Name: Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Poznaj metodę szybkiego układania zarodków Danio rerio przy użyciu drukowanego w 3D szablonu do płytek 96-well. Technika znacząco przyspiesza przygotowanie próbek do badań przesiewowych wysokoprzepustowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez program "1000plan Youth", fundusze startowe z Uniwersytetu Tongji oraz grant NSFC# 21607115 i 21777116 (Lin).

1. Projekt i wykonanie szablonu do układania zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Zaprojektuj szablon tablicy z 96-dołkowym układem 12 na 8, który pasuje do standardowej płytki 96-dołkowej. Użyj wymiarów podanych w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A dla górnej komory uwięzienia zarodków (zobacz również plik uzupełniający).
	<ol>
		<li>Użyj wymiarów pokazanych w Rysunek 1B i 1D dla studni pułapki.</li>
		<li>Użyj wymiarów w Rysunek 1C dla dolnej komory próżniowej.</li>
		<li>Użyj wymiarów w Rysunek 1B dla wlotu/wylotu powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj drukarki 3D (z dokładnością do 0,1 mm), aby wydrukować szablon; zobacz Tabelę materiałów, aby zapoznać się z zalecaną żywicą do drukowania. 
	UWAGA: Drukarki 3D o dokładności 0,1 mm są zalecane do wytwarzania szablonu do szykowania (patrz Tabela Materiałów). Sugerowany kolor powierzchni szablonu to ciemnoszary lub.</li>
</ol>
2. Tarło zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Umieść dwie pary samców i samic ryb w komorze godowej na jeden dzień przed tarłem. Oddziel samce i samice przezroczystą plastikową przegrodą.</li>
	<li>Zdejmij przegrody rano, aby wymieszać samce i samice ryb.</li>
	<li>Usuń samce i samice ryb i zbierz zarodki danio pręgowanego za pomocą sitka o drobnych oczkach. Umyj zarodki 250 ml wody jajecznej (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieść pobrane zarodki na szalki Petriego (o średnicy 90 mm) za pomocą roztworu Holtfretera (patrz tabela materiałów) i usunąć martwe i niezapłodnione zarodki za pomocą stereomikroskopu.</li>
	<li>Umieścić zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C. Po 4 godzinach od zapłodnienia (hpf) obserwuj zarodki i usuń wszelkie martwe i niezdrowe zarodki. Zarodki są teraz gotowe do następnego kroku.</li>
</ol>
3. Przygotowanie szablonu do tworzenia tablic
<ol>
	<li>Umyj szablon 2-3 razy 500 ml wody dejonizowanej i włóż do suszarki (45 °C) na 5 minut.</li>
	<li>Zaklej dolną komorę kawałkiem folii uszczelniającej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, Krok 1).</li>
	<li>Podłącz pompę próżniową przez wylot powietrza na dole szablonu. 
	UWAGA: Zalecane maksymalne podciśnienie dla pompy próżniowej wynosi 0.1 MPa. Należy pamiętać o sile używanej próżni. Jeśli podciśnienie jest zbyt silne, wytnij otwór w kształcie krzyża w folii uszczelniającej, aby obniżyć ciśnienie.</li>
</ol>
4. Układanie zarodków danio pręgowanego w 96-dołkowej płytce
<ol>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść około 150 zarodków w szablonie, jak pokazano w Rysunek 2, Krok 2.</li>
	<li>Podłącz pompę próżniową do wylotu powietrza, aby wytworzyć podciśnienie w komorze uszczelnionej folią uszczelniającą w kroku 3.3.</li>
	<li>Potrząśnij całym szablonem poziomo, aż w każdym dołku uwięziony będzie jeden zarodek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, Krok 3). 
	UWAGA: Jeśli roztwór Holtfretera wyschnie, zanim zarodki zostaną uwięzione w każdym dołku, dodaj dodatkowy roztwór Holtfretera do komory uwięzionej i powtórz ten krok.</li>
	<li>Odrzuć nadmiar roztworu Holtfretera i zarodki, które nie są uwięzione w studzienkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, Krok 4).</li>
	<li>Wyłącz i odłącz pompę próżniową.</li>
	<li>Umieść standardową 96-dołkową płytkę do góry nogami na szablonie (Rysunek 2, Krok 5) i obróć obie w tym samym czasie (Rysunek 2, Krok 6).</li>
	<li>Postukaj w dolną część szablonu lub podłącz wylot powietrza do puszki do pylenia sprężonym gazem, aby przenieść wszystkie uwięzione zarodki z szablonu do płytki 96-dołkowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 6).</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 4.1 do 4.8, aby przygotować dodatkowe płytki wielodołkowe.</li>
	<li>Usuń folię uszczelniającą i umyj szablon 3 razy od góry do dołu 500 ml wody dejonizowanej do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Do czyszczenia szablonu nie używaj żadnych rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Transformation%2C+Speciation%2C+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li>
<li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+%28nanotomy%29+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid%2C+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22in+CT+Images+with+Convolutional+Neural+Network.+Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li>
<li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li>
</ol>

Autorzy wypełnili patent na opisywany szablon wydrukowany w 3D.

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki, które wymagają szczególnej uwagi w celu pomyślnego wdrożenia wydrukowanego w 3D szablonu do układania zarodków danio pręgowanego.
Najważniejszym czynnikiem wpływającym na projekt szablonu tablicowego jest studnia uwięzienia. Aby upewnić się, że w każdej studzience uwięziony jest tylko jeden zarodek, należy zwrócić szczególną uwagę na średnicę i głębokość dołka pułapkowego oraz średnicę otworu przelotowego. Zalecana średnica mieści się w zakresie od...

Jako popularny organizm modelowy, danio pręgowany jest szeroko stosowany w medycynie i toksykologii1,2,3,4. W porównaniu z platformami in vitro, danio pręgowany oferuje znacznie większą złożoność biologiczną, której jeden lub dwa typy komórek nie były w stanie zaoferować. Oprócz tego, że jest to model całego organizmu, duża płodność danio pręgowanego, szybki i jednoczesny rozwój embrionalny oraz wysoka przezroczystość narządów dały temu modelowi unikalne zalety do wykorzystania w przypadku toksyczności na dużą skalę lub badań przesiewowych leków/związków5. Setki zarodków wytwarzanych każdego tygodnia przez jedną parę dorosłych ryb danio pręgowanych przewyższają wszelkie inne modele całych zwierząt i sprawiają, że nadają się one do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.
Typowa procedura przesiewowa z użyciem danio pręgowanego obejmuje znaczną ilość pracy manualnej, takiej jak tarło dorosłych danio pręgowanego, selekcja zarodków i umieszczanie zarodków w odpowiednich pojemnikach, gdzie są poddawane ekspozycji poprzez zanurzenie w wodzie. Rozwój zarodków jest monitorowany, a obserwowalne punkty końcowe, takie jak śmiertelność, wylęgowość i nieprawidłowości, są często oceniane ręcznie i wykorzystywane jako wstępna identyfikacja toksyczności substancji chemicznych lub wskaźniki skuteczności leków lub związków. Aby przyspieszyć procedurę badań przesiewowych, już wcześniej badano takie podejścia, jak zautomatyzowane obrazowanie i komputerowa analiza obrazu. Na przykład mikroskopy o wysokich możliwościach obrazowania zostały przystosowane do wykonywania zautomatyzowanego obrazowania w jasnym polu lub obrazowania fluorescencyjnego na zarodkach danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju z płytek 96/384-dołkowych6. Urządzenia mikroprzepływowe sprzężone z mikroskopami zostały użyte do pozycjonowania larw danio pręgowanego za pomocą manipulacji prądem w celu obrazowania neuronów mózgowych7. Podejścia te mogą znacznie poprawić efektywność pozyskiwania obrazów w porównaniu z tradycyjną obsługą ręczną. Co więcej, ze względu na dużą liczbę generowanych obrazów, opracowano również narzędzia do analizy obrazów w celu przyspieszenia przetwarzania danych, jak wykazali Liu i wsp. oraz Tu i wsp.8,9.
Wraz ze wzrostem przepustowości obrazowania i analizy obrazu, stało się jasne, że etap ograniczający szybkość badań przesiewowych polega na procesie przygotowania zarodków danio pręgowanego do ekspozycji, co zazwyczaj oznacza ułożenie ich na 96- lub 384-dołkowych płytkach. Aby rozwiązać ten problem z wąskim gardłem, Mandrell i wsp. opracowali robotykę sterowaną wizją.10 i us11 poprzednio, aby zastąpić ręczną obsługę, ale instrumenty były dość wyrafinowane i istnieje głęboka krzywa uczenia się, aby wdrożyć takie techniki. W związku z tym zapewnienie łatwego w użyciu podejścia staje się jednym z ważnych czynników dalszej poprawy poziomu przepustowości badań przesiewowych danio pręgowanego i jest głównym celem tych prac.
W tej pracy zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy szablon do układania zarodków za pomocą druku 3D. Taki szablon do układania został zaprojektowany w celu uwięzienia zarodka danio pręgowanego w studzienkach, które pasują do standardowej płytki 96-dołkowej. Zamiast wybierać zarodki i układać je w osobne studzienki jeden po drugim, można przeprowadzić uwięzienie zarodka i ułożyć wszystkie 96 zarodków w wielościennej płytce jednocześnie. Korzystając z tego szablonu i następującego po nim protokołu, można znacznie zwiększyć wydajność układania zarodków w płytki wielościenne, co w efekcie zwiększyłoby zdolność badań przesiewowych co najmniej dziesięciokrotnie w porównaniu z operacją ręczną. Opisany poniżej protokół zawiera ogólny projekt szablonu do ustawiania w szyku, tarła danio pręgowanego, zbierania zarodków i szykowania. Rysunek 1 pokazuje ogólny wygląd szablonu tablicy. Rysunek 2 pokazuje przegląd protokołu krok po kroku dotyczącego korzystania z szablonu opisanego w częściach 3 i 4.

<table><tbody><tr><td>Zakład Danio Pręgowany</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td>Z-A-S5</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka godowa</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka do mycia, 500 ml</td><td>Sangon Biotech</td><td>F505001-0001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Vetec</td><td>V900058-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu&nbsp;</td><td>Vetec</td><td>V900182-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat błękitu metylenowego</td><td>TCI</td><td>M0501</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011008</td><td></td></tr><tr><td>Sole morskie</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipeter</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta z kontrolowanym spadkiem</td><td>Pasteura Fisherbrand</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator biochemiczny</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td>Drukarka 3D <td>LRH-250</td><td></td></tr><tr><td></td><td>UnionTech</td><td>Lite600</td><td></td></tr><tr><td>Żywica światłoczuła</td><td>UnionTech</td><td>UTR9000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SHB-IIIA</td> Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCR Solarbio YA0245 96-dołkowa <td></td></tr><tr><td>płytka</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Wielokanałowa pipeta 30 - 300 &mu;<td></td></tr><tr><td> l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>Miotełka do kurzu na sprężony gaz</td><td>Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.</td><td>ST1005</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>Thermo</td><td>GenPure Pro UV/UF</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do suszenia</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>BPG-9106A</td><td></td></tr><tr><td>System wody</td><td></td><td></td><td>: Woda z obiektu" s system wodny</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>jajeczna</td><td>Rozcieńczony 60mg " Natychmiastowy ocean" soli morskich i 0,25 mg/l błękitu metylenowego w 1 l wody</td></tr><tr><td>DI Holtfreter' </td><td></td><td></td><td>7,0 g chlorku sodu (NaCl), 0,4 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 0,1 g chlorku potasu (KCl), 0,235 g chlorku wapnia (CaCl2,2H2O) w 1,9 l wody DI. Dostosuj pH do 7 za pomocą HCl i dostosuj objętość do 2 l za pomocą wody Di</td></tr></tbody></table>

drukowany w 3 wymiarach (3d) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Danio pręgowany jest uznanym na całym świecie organizmem słodkowodnym, często wykorzystywanym w badaniach nad biologią rozwojową, toksykologią środowiskową i chorobami ludzkimi. Dzięki swoim unikalnym cechom, w tym dużej płodności, przezierności zarodków, szybkiemu i jednoczesnemu rozwojowi itp., zarodki danio pręgowanego są często wykorzystywane do oceny toksyczności chemikaliów na dużą skalę i badań przesiewowych leków/związków. Typowa procedura przesiewowa obejmuje tarło dorosłych danio pręgowanego, selekcję zarodków i ułożenie zarodków w wielodołkowych płytkach. Stamtąd zarodki są poddawane ekspozycji, a toksyczność substancji chemicznej lub skuteczność leków/związków można stosunkowo szybko ocenić na podstawie obserwacji fenotypowych. Wśród tych procesów układanie zarodków jest jednym z najbardziej czasochłonnych i pracochłonnych etapów, który ogranicza poziom przepustowości. W tym protokole przedstawiamy innowacyjne podejście, które wykorzystuje wydrukowany w 3D szablon do układania w szyku w połączeniu z manipulacją próżnią, aby przyspieszyć ten pracochłonny krok. Niniejszy protokół opisuje ogólny projekt szablonu macierzy, szczegółową konfigurację eksperymentalną i procedurę krok po kroku, po której następują reprezentatywne wyniki. Po wdrożeniu, podejście to powinno okazać się korzystne w różnych zastosowaniach badawczych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego jako obiektów testowych.

Rycina 3 przedstawia typowy szablon do układania w macierz wydrukowany w technologii 3D. Szablon ten został wykonany za pomocą drukarki 3D z żywicy światłoczułej jako materiału bazowego; naniesiono na niego warstwę czarnej farby, aby zapewnić lepszy kontrast względem koloru embrionów. Rozmieszczenie 96 dołków (12 na 8) zaprojektowano tak, aby odpowiadało standardowej płytce 96-dołkowej. Podobnie, stosując tę samą metodę, można zaprojektować i wykonać szablon ...

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i produkcji szablonu do układania zarodków danio pręgowanego, a następnie szczegółową procedurę użycia takiego szablonu do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce.

Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Ta metoda może znacznie przyspieszyć procedurę układania zarodków danio pręgowanego i sprawić, że danio pręgowany będzie naprawdę podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie wydrukowanego w 3D szablonu do wstępnego ułożenia zarodków danio pręgowanego w matrycy 96 lub 384 dołków, co ułatwia wysoce wydajny proces przygotowania płytki. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody podczas przeprowadzania badań przesiewowych nanocząstek poprzez ręczne wybieranie i selekcję pojedynczych zarodków do każdego dołka płytki modułowej i chcieliśmy zwiększyć wydajność.Oprócz Tianyu, jego kolega ze studiów magisterskich Yue Jiang zademonstruje tę procedurę. Rozpocznij tę procedurę od zaprojektowania szablonu do układania z układem 96 dołków dwanaście na osiem, który pasuje do standardowej płytki 96-dołkowej. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Użyj drukarki 3D z dokładnością do 0,1 milimetra, aby wydrukować szablon. Niektóre kluczowe elementy szablonu to komora uwięziona, studzienka pułapkowania, komora próżniowa i wylot powietrza. Aby przeprowadzić tarło zarodków danio pręgowanego, najpierw oddziel samce i samice za pomocą przezroczystej plastikowej przegrody.Następnie umieść dwie pary samców i samic ryb w pudełku godowym na dzień przed tarłem. W dniu tarła zdejmij rano przegrody, aby wymieszać ryby męskie i żeńskie. Usuń samce i samice ryb i zbierz zarodki danio pręgowanego za pomocą sitka o drobnych oczkach.Umyj zarodki 250 mililitrami wody jajecznej. Przenieś zebrane zarodki na szalki Petriego za pomocą roztworu Holtfretera. Usuń martwe i niezapłodnione zarodki za pomocą mikroskopu stereoskopowego.Umieść zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Po czterech godzinach od zapłodnienia obserwuj zarodki i usuń martwe i niezdrowe zarodki. Zarodki są teraz gotowe do następnego kroku.Umyj szablon dwa do trzech razy 500 mililitrami wody dejonizowanej przed włożeniem go do suszarki na pięć minut. Następnie zaklej dolną komorę taśmą z kawałkiową folią uszczelniającą. Podłącz pompę próżniową przez wylot powietrza w dolnej części szablonu, aby wytworzyć podciśnienie w komorze uszczelnionej folią uszczelniającą.Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść około 150 zarodków w szablonie. Potrząśnij całym szablonem poziomo, aż w każdym dołku zostanie uwięziony jeden zarodek. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby sprawdzić i upewnić się, że każdy dostępny zarodek danio pręgowanego.Jeśli bufor Holtfretera był bardzo niski, można było dodać dodatkowy bufor, potrząsając szablonem. Odrzuć nadmiar roztworu Holtfretera i zarodki, które nie są uwięzione w studzienkach. Wyłącz i odłącz pompę próżniową.Umieść standardową 96-dołkową płytkę do góry nogami na szablonie i obróć obie w tym samym czasie. Postukaj w dolną część szablonu lub podłącz wylot powietrza do puszki do pylenia sprężonym gazem, aby przenieść wszystkie uwięzione zarodki z szablonu na płytkę 96-dołkową. Na koniec usuń folię uszczelniającą i umyj szablon trzy razy od góry do dołu 500 mililitrami wody dejonizowanej do wykorzystania w przyszłości.Pokazano tutaj częściowy obraz 96-dołkowej płytki ułożonej według szablonu. I odwrotnie, ten obraz przedstawia częściowy obraz 96-dołkowej płytki ułożonej ręcznie. W tym miejscu wyświetlany jest ogólny stan zdrowia zarodków po ich ręcznym posiewie metodą matrycową i matrycową.Opierając się na wskaźnikach wylęgu, przeżywalności i wad rozwojowych zarodków, w żadnym z tych przypadków nie zaobserwowano znaczącego wpływu na ogólny stan zdrowia zarodków. Po opanowaniu tej techniki przygotuje jedną 96- lub 384-dołkową płytkę w ciągu dwóch do trzech minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do pełnego wykorzystania nowych cech tego organizmu modelowego i naprawdę przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych in vitro.

a-3-dimensional-3d-printed-template-for-high-throughput-zebrafish

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Innowacyjna metoda wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych wykorzystujących laminowanie politereftalanu etylenu (PET) znacznie zmniejsza koszty i złożoność chwytania i obrazowania wielu żywych zarodków danio pręgowanego.

Tanie projekty mikrofluidyki laminacji politereftalanu etylenu do multipleksowanego obrazowania danio pręgowanego

Poznaj metodę szybkiego układania zarodków Danio rerio przy użyciu drukowanego w 3D szablonu do płytek 96-well. Technika znacząco przyspiesza przygotowanie próbek do badań przesiewowych wysokoprzepustowych.

Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów