Częste pobieranie próbek krwi na końcówce ogona u myszy w celu oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego

Ogólnym celem częstego pobierania próbek krwi z końcówki ogona jest uzyskanie próbek krwi pełnej do pomiaru pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego, określanego jako LH, u obudzonych, nieznieczulonych i normalnie zachowujących się myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroendochrynologii reprodukcyjnej, zapewniając wiarygodny protokół oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego u myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że częste obchodzenie się i habituacja zapewnią solidne i wiarygodne pomiary impulsów hormonu luteinizującego po ostrym lub przewlekłym leczeniu eksperymentalnym.

Przez pięć tygodni przed pobraniem krwi należy obchodzić się z myszami codziennie, od poniedziałku do piątku. W ostatnich dwóch tygodniach zajmij się myszami również w sobotę i niedzielę. Wykonaj reżim obchodzenia się z myszą w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni w szafce. Delikatnie przytrzymuj mysz na tej powierzchni, przytrzymując podstawę jej ogona. Następnie drugą ręką mocno pogłaszcz brzuszną powierzchnię ogona od podstawy do czubka.

Zrób to w sumie sześć razy, a następnie włóż mysz z powrotem do klatki. Stanowi to jeden zestaw manipulacyjny. Teraz odczekaj sześć minut i wykonaj kolejną serię obsługi.

Kontynuując ten wzorzec z interwałami między zestawami, wykonaj cztery zestawy obsługi na sesję obsługi. W sumie zapewnia to dwadzieścia cztery pociągnięcia ogonem na sesję. Jeśli eksperymentalne leczenie w okresie pobierania próbek będzie obejmowało wszelkie dodatkowe metody obchodzenia się, takie jak chrupanie lub wstrzyknięcie dootrzewnowe, należy również przystosować myszy do takiej czynności obchodzenia się podczas sesji przenoszenia.

Dwa tygodnie przed planowanym dniem pobrania krwi trzymaj myszy w parach, aby zminimalizować ich zakłócenia w okresie pobierania próbek. Do pobierania krwi należy przygotować mikroprobówki wirówkowe o pojemności 0,6 mililitra do przechowywania krwi. Oznacz probówki i w przypadku trzech mikrolitrów krwi należy wprowadzić do każdej probówki pięćdziesiąt siedem mikrolitrów buforu ACES.

Po przygotowaniu przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W szafie bezpieczeństwa biologicznego przygotuj następujące przedmioty: końcówki do pipet, kosz na śmieci, minutnik, dziennik doświadczeń, wiaderko z lodem zawierające probówki do pobierania krwi, ostre, sterylne nożyczki, marker permanentny i małą gazę. Czterdzieści pięć minut przed rozpoczęciem pobierania krwi wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni.

Następnie zaznacz ogon, aby szybko zidentyfikować tę mysz od jej partnera w klatce. Teraz użyj nożyczek, aby usunąć od jednego do dwóch milimetrów końcówki ogona. Po przycięciu tego ogona ostrożnie głaszcz ogon, aż na końcu utworzy się kropla krwi.

Następnie zbierz trzy mikrolitry krwi i wyrzuć zarówno krew, jak i końcówkę do kosza na śmieci. Następnie upewnij się, że przepływ krwi się zatrzymał. W razie potrzeby delikatnie uciskaj sterylną gazą.

Następnie umieść mysz z powrotem w klatce na sześć minut. Teraz w sześciominutowych odstępach przez czterdzieści pięć minut mocno głaszcz ogon, aby pobrać dodatkowe próbki krwi od myszy. Jeśli kropla krwi nie utworzy się, przetrzyj ogon gazikiem nasączonym solą fizjologiczną, aby pomóc usunąć skrzep krwi.

W okresie wstępnego pobierania próbek należy odrzucić wszystkie podwielokrotności krwi. Po czterdziestu pięciu minutach rozpocznij okres pobierania próbek. Podczas pobierania próbek przenieś trzy mikrolitry krwi do probówki zbiorczej, wymieszaj probówkę przez odwrócenie i umieść ją z powrotem na lodzie.

Teraz należy kontynuować pobieranie próbek tak długo, jak to konieczne. Po zakończeniu należy poddać myszy eutanazji lub upewnić się, że przepływ krwi w ich ogonie całkowicie się zatrzymał, a następnie zapewnić myszom czystą klatkę. Następnie przenieś próbki krwi do pudełka do przechowywania i przechowuj je w temperaturze minus dwudziestu stopni Celsjusza, dopóki nie będzie można ich przeanalizować.

Hormon luteinizujący lub LH mierzono w częstych próbkach krwi w celu określenia odpowiedzi na ostre wyzwanie związane ze stresem psychospołecznym. Dorosłą samicę czarnych sześciu myszy C57 poddano owariektomii, a próbki krwi pobierano przez dziewięćdziesiąt minut w celu ustalenia punktu odniesienia przed leczeniem pulsacyjnego wydzielania LH. W celu leczenia stresu podczas dziewięćdziesięciominutowego pobierania próbek, zwierzęta doświadczalne umieszczono w urządzeniach przytrzymujących gryzonie i przeniesiono do nowej klatki, podczas gdy grupa kontrolna pozostała w swoich domowych klatkach i nie była skrępowana.

Analiza wykazała, że zwierzęta kontrolne miały wyraźne, jednoznaczne impulsy LH przez cały okres pobierania próbek. W przeciwieństwie do tego, stres psychospołeczny związany z ograniczeniem szybko i jednoznacznie hamował pulsacyjne wydzielanie LH w grupie eksperymentalnej. Przygotowując się do użycia tej techniki, ważne jest, aby pamiętać o zminimalizowaniu zakłóceń środowiskowych, takich jak hałas lub przerwy innych badaczy, które mogłyby stresować myszy i przerwać pulsacyjne wydzielanie LH.

Od czasu jej opracowania przez dr Steina i innych w laboratorium Chen, technika ta zaczęła torować drogę naukowcom w dziedzinie neuroendokrynologii do badania regulacji impulsu LH u gatunku, w którym złożone narzędzia molekularne i genetyczne są praktyczne i dostępne.