Name: Częste pobieranie próbek krwi na końcówce ogona u myszy w celu oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę pobierania krwi z końcówki ogona u myszy do pomiaru pulsacyjnego wydzielania LH. Technika ta umożliwia niezawodne badania neuroendokrynologii reprodukcji przy minimalnym stresie zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują doktorom Jennifer Yang i Alexandrowi (Sasha) Kauffmanowi za pomoc techniczną przy tej technice, jak również za liczne pomocne i krytyczne dyskusje. Testy hormonów w surowicy zostały przeprowadzone przez Yang i wsp., 2017 w The University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core, wspierane przez Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Źródła wsparcia badań: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM był wspierany przez T32 NICHD 007203.

Opisana tutaj metoda jest zgodna z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich używania, a także została zatwierdzona przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego.
1. Aklimatyzacja do obsługi
<ol>
	<li>Procedura postępowania
	<ol>
		<li>Umieść klatki dla myszy w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni (np. czystej pokrywie klatki) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Delikatnie przytrzymuj mysz na powierzchni roboczej, przytrzymując podstawę ogona palcem wskazującym i kciukiem jednej ręki. Następnie mocno pogładź brzuszną powierzchnię ogona, od podstawy do czubka ogona, palcem wskazującym i kciukiem drugiej ręki. Powtórz to głaskanie 6 razy (tj. 1 zestaw) i umieść mysz z powrotem w klatce.</li>
		<li>Odczekaj 6 minut i powtórz krok 1.1.2. 
		UWAGA: W sumie krok 1.1.2 zostanie powtórzony 4 razy na mysz (tj. 4 zestawy po 6 uderzeń), tak aby każda mysz otrzymała łącznie 24 pociągnięcia ogonem w każdym dniu obsługi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Częstotliwość codziennego obchodzenia się z rybami
	<ol>
		<li>Od pięciu do dwóch tygodni przed planowanym dniem pobrania krwi należy obchodzić się z myszami zgodnie z opisem w kroku 1.1, pięć dni w tygodniu (myszy nie są obsługiwane w soboty lub niedziele aż do ostatnich dwóch tygodni aklimatyzacji).</li>
		<li>Jeżeli eksperymentalne leczenie w okresie pobierania próbek będzie obejmowało jakiekolwiek dodatkowe obchodzenie się (np. chrupanie lub wstrzyknięcie dootrzewnowe), należy przystosować myszy do tej czynności podczas każdej sesji obchodzenia się z myszami. 
		Uwaga: W celu aklimatyzacji do zabiegów iniekcyjnych należy użyć igły do wykonania pozorowanego wstrzyknięcia.</li>
		<li>W ciągu dwóch tygodni przed planowanym dniem pobrania krwi należy obchodzić się z myszami zgodnie z opisem w punkcie 1.1, siedem dni w tygodniu.</li>
		<li>Co najmniej dwa tygodnie przed planowanym dniem pobrania krwi trzymaj myszy w parach, aby zminimalizować zakłócenia dla myszy podczas pobierania próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie probówek do pobierania krwi
<ol>
	<li>Przygotować ultraczuły bufor do oznaczania LH w szklanej butelce: 0,2% albuminy surowicy bydlęcej i 0,05% Tween-20 w PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (bezwodny), 0,24 g KH2PO4, woda ultraczysta do 1 L, pH 7,4, filtr i autoklaw], przechowywać w temperaturze 4°C.1 
	UWAGA: Objętość ultraczułego buforu do oznaczania LH, który ma być przygotowany, można obliczyć na podstawie liczby próbek i objętości na próbkę, jak wskazano poniżej (2.2 i dyskusja)</li>
	<li>Przygotuj probówki do pobierania krwi (probówki do mikrowirówek o pojemności 0,6 ml). Oznakować probówki i podwielokrotny bufor do oznaczania (57 μl buforu na probówkę; należy pamiętać, że objętość ta może się różnić w zależności od objętości pobranej krwi lub stosunku krwi do pożądanego buforu). Probówki można przygotować na kilka dni przed pobraniem próbek, przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
3. Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów do pobierania krwi.
	<ol>
		<li>Przygotuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego do użycia i ułóż następujące materiały w kapturze lub na wózku w pobliżu: pipeta 10 μl (ustawiona na 3 μl lub żądaną objętość do pobrania krwi), końcówki do pipet, kosz na zużyte końcówki do pipet, minutnik, wydruk z numerami zwierząt i numerami próbek (do notatek dotyczących pobierania próbek lub problemów ze zwierzętami), wiadro na lód z probówkami do pobierania krwi, nożyczki i mała gaza (2 "x 2"). 
		UWAGA: Funkcja "odliczania" w zegarze laboratoryjnym jest przydatna, ponieważ nie ma alarmu dźwiękowego, który mógłby przeszkadzać myszom</li>
		<li>Użyj trwałego markera, aby oznaczyć ogon każdej myszy (w pobliżu podstawy), aby pomóc w szybkiej identyfikacji właściwej myszy podczas pobierania próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strzyżenie ogona i przygotowanie do pobrania krwi.
	<ol>
		<li>Na 45 minut przed rozpoczęciem pobierania krwi wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni (dobrze sprawdza się czysta pokrywa klatki) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Użyj ostrych, sterylnych nożyczek, aby usunąć 1-2 mm czubka ogona myszy, po aseptycznym przygotowaniu (tj. szorowaniu alkoholem i betadyną). 
		UWAGA: Można to osiągnąć u zwierząt obudzonych przy delikatnym ograniczeniu lub w znieczuleniu izofluranem. Dodatkowo, analgezja może być zapewniona zgodnie z zaleceniami lokalnego IACUC.</li>
		<li>Ostrożnie głaszcz ogon myszy zgodnie z powyższym opisem (1.1.2; 1-2 pociągnięcia są zazwyczaj wystarczające), aż na końcu ogona utworzy się kropla krwi.</li>
		<li>Za pomocą pipety z czystą końcówką pobrać 3 μl krwi z końcówki ogonowej i wyrzucić końcówkę pipety wraz z krwią.</li>
		<li>Przed powrotem myszy do klatki upewnij się, że przepływ krwi się zatrzymał. W razie potrzeby delikatnie uciskaj sterylną gazą.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.1 - 3.2.5 dla wszystkich myszy. Kolejne próbki krwi można pobierać, mocno głaszcząc ogon myszy, aż na końcu ogona utworzy się kropla krwi. 
		UWAGA: Jeśli po mocnych pociągnięciach nie utworzy się kropla krwi, ogon można przetrzeć gazikiem nasączonym solą fizjologiczną. Prawdopodobieństwo tworzenia się skrzepów jest większe podczas rzadszego pobierania próbek (tj. w odstępach >15 minut). Po usunięciu skrzepu z żyły pobieranie próbek można kontynuować.</li>
		<li>Kontynuuj pobieranie 3 μl krwi od każdej myszy w sposób opisany powyżej co 6 minut przez około 45 minut w okresie przygotowań do pobrania krwi. Wyrzuć krew i końcówkę pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek krwi
	<ol>
		<li>Zbierz 3 μl krwi z końcówki ogona, jak opisano powyżej. Należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że cała próbka o objętości 3 μl została pobrana do końcówki pipety (bez pęcherzyków powietrza i zanieczyszczenia ściółką). Wyrzuć próbkę krwi do buforu testowego w oznakowanej probówce. Wymieszaj przez odwrócenie i umieść probówkę z powrotem w lodzie.</li>
		<li>Przed powrotem myszy do klatki upewnij się, że przepływ krwi się zatrzymał. W razie potrzeby delikatnie uciskaj sterylną gazą.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.3.1 - 3.3.2 dla każdej myszy, co 6 minut, dla z góry ustalonego czasu próbkowania. Należy obserwować każde zwierzę pod kątem oznak niepokoju (np. częściowo zamknięte powieki, zgarbiona pozycja [niespowodowana innym leczeniem] lub brak reakcji na obchodzenie się z nim) i w razie potrzeby przerwać pobieranie próbek. 
		UWAGA: Zaburzenia behawioralne lub inne powikłania, które wymagają przerwania pobierania próbek, występują niezwykle rzadko w naszym laboratorium.</li>
		<li>Jeśli zwierzęta nie zostaną poddane eutanazji po pobraniu próbki krwi, upewnij się, że przepływ krwi z końcówki ogona całkowicie się zatrzymał. Wytrzyj rozlaną krew z wnętrza klatki każdego zwierzęcia (lub zmień klatki) i włóż klatki dla zwierząt z powrotem do stojaka na pomieszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza próbek
<ol>
	<li>Próbki krwi należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy. 
	UWAGA: LH oznacza się w próbkach krwi pełnej rozcieńczonych w buforze do oznaczania; Nie jest wymagane oddzielanie surowicy lub osocza przed przechowywaniem lub analizą.</li>
	<li>Oznacz próbki krwi za pomocą ultraczułego testu ELISA, jak opisano wcześniej1 i podać wartości w ng/ml krwi pełnej po korekcie o rozcieńczenie objętości próbki w buforze testowym.</li>
	<li>Zidentyfikuj impulsy LH w zestawie danych. Obliczyć i porównać średnią amplitudę impulsu i częstotliwość impulsów (lub interwał między impulsami) odpowiednio dla zbioru danych. 
	UWAGA: Dostępne są opublikowane kryteria13,14 oraz programy,15,16 do wykrywania impulsów LH.</li>
</ol>

<ol><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li>
<li>McArdle, C. A., Roberson, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcArdle%2C+CA+%22Knobil+and+Neill%27s+Physiology+of+Reproduction%22">Knobil and Neill's Physiology of Reproduction</a>. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).</li>
<li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
<li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li>
<li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li>
<li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li>
<li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li>
<li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li>
<li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li>
<li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li>
<li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+of+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li>
<li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li>
<li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone%3A+differential+suppression+by+ovarian+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li>
<li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li>
<li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DynPeak%3A+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001(2012).</li>
<li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li>
<li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li>
<li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Stress%22%5BJournal%5D)">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li>
<li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosterone%2C+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding%2C+and+its+effect+on+nearby+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal%22%5BJournal%5D)">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li>
<li>United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017).</li>
<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy protokół częstego pobierania krwi z próbek krwi pełnej na końcówkach ogona w celu oceny pulsacyjnego wydzielania LH u myszy. Protokół ten umożliwia pobieranie próbek w celu wykrycia ostrych zmian w pulsacyjnym wydzielaniu LH po ekspozycji na stres psychospołeczny i dobrze nadaje się do oceny impulsów LH w przypadku innych ostrych lub przewlekłych manipulacji.
Kluczowym elementem tego protokołu dla uzyskania wiarygodnych i solidnych profili impulsów LH jest okres aklimatyzacji d...

Funkcja gonad u ssaków jest zależna od wydzielania gonadotropin, hormonu luteinizującego (LH) i hormonu folikulotropowego z przysadki mózgowej. Gonadotropiny są wydzielane w sposób pulsacyjny lub nagły w odpowiedzi na podwzgórze wydzielanie hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH). Synteza i wydzielanie zarówno LH, jak i FSH są regulowane przez działanie hormonalne, parakrynne i autokrynne z różnych cząsteczek, w tym podwzgórza GnRH, hormonów steroidowych gonad i układu aktywina-inhibina-folistatyna, a także niezliczonych stanów fizjologicznych, w tym stresu i równowagi energetycznej. 2
Pulsacyjny wzór LH we krwi wynika z dość nagłego wyładowania LH do krwi obwodowej, po którym następuje w przybliżeniu wykładnicza eliminacja. Ważnymi cechami wzorca są częstotliwość każdego wyładowania LH i amplituda odpowiedzi LH, z których obie są częściowo podyktowane uwalnianiem GnRH. Ze względu na trudności w pobieraniu krwi wrogiej podwzgórze-przysadka do pomiaru pulsacyjnego GnRH, pobieranie próbek i pomiar LH jest używany jako wskaźnik zastępczy dla regulacji GnRH osi podwzgórze-przysadka-gonady. W związku z tym krytyczne informacje są kodowane w częstotliwości i amplitudzie impulsów LH, których nie można określić na podstawie pojedynczej próbki.
Analiza pulsacyjnego wydzielania LH historycznie była ograniczona do dużych ssaków (ludzi, naczelnych i owiec) ze względu na ich dużą objętość krwi i tolerancję na częste pobieranie próbek krwi. U gryzoni częste pobieranie próbek krwi ograniczało się do szczurów i osiągano je za pomocą cewnika przedsionkowego na stałe. 3,4 Stosunkowo niski koszt i dostępność manipulacji genetycznych (np. cre-lox, CRISPR) i złożonych obwodów neuronowych (np. optogenetyka, chemogenetyka) sprawia, że myszy są atrakcyjnym organizmem modelowym; jednak uzyskanie częstych próbek krwi i późniejsza analiza stężeń LH do niedawna okazywała się nieuchwytna. To monumentalne zadanie zostało zapoczątkowane przez Steyna i jego współpracowników. 1 Od tego czasu, kilka laboratoriów zaczęło wykorzystywać częste pobieranie próbek krwi i ultraczułe testy LH do oceny pulsacyjnego wydzielania LH w różnych paradygmatach eksperymentalnych. 5,6,7,8,9 Należy zauważyć, że poszukiwanie praktycznej metody pobierania wielu próbek krwi od myszy trwa od co najmniej 40 lat10 z wieloma udoskonaleniami dokonanymi po drodze. 11,12
Ocena wzorców impulsów LH (tj. częstotliwości i amplitudy) stanowi duże udoskonalenie w monitorowaniu podstawowego wydzielania gonadotropin w tym genetycznie podatnym modelu zwierzęcym. Tradycyjnie stężenia LH u myszy oznaczano w pojedynczej próbce krwi. Jedną ze słabości próbek jednopunktowych jest bardzo zmienny zestaw danych, ponieważ stężenia LH naturalnie zmieniają się podczas każdego impulsu. Kolejną słabością jest to, że izolowane pomiary z natury pomijają krytyczne informacje przekazywane przez wzorce wydzielania impulsu LH. W związku z tym metoda częstego pobierania próbek krwi u swobodnie zachowujących się, nieskrępowanych myszy (z wyjątkiem delikatnego obchodzenia się z próbkami) dostarczy lepszych informacji i okaże się przydatna dla wielu laboratoriów badających regulację hormonów pulsacyjnych.
Tutaj opisujemy protokół częstego (co 6 minut) pobierania próbek krwi od przytomnych, nieskrępowanych myszy. Co ważne, dołączamy protokół aklimatyzacji, który pozwala na solidne i ciągłe wykrywanie pulsacyjnego wydzielania LH w próbkach krwi pełnej pobranych przez długi czas, w którym można określić wstępną i końcową ocenę ostrego wyzwania, takiego jak reakcja na stres psychospołeczny związany z unieruchomieniem i unieruchomieniem. Skuteczny test stężeń LH w próbkach krwi pełnej został opisany wcześniej; 1 ten protokół skupia się na metodzie pobierania próbek krwi do pomiaru tętna LH.

<table><tbody><tr><td>Szafka biobezpieczna</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (bezwodna)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Millipore</td><td></td><td>Oczyszczona i przefiltrowana woda</td></tr><tr><td>Urządzenie do powstrzymywania gryzoni Broome</td><td>Aparat Harvard</td><td>52-0460</td><td>Nie jest konieczne do pobierania krwi, ale zostały wykorzystane do zbierania reprezentatywnych danych.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>nie dotyczy</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

częste pobieranie próbek krwi na końcówce ogona u myszy w celu oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego

Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

W wielu układach hormonalnych czynniki krążące lub hormony nie są uwalniane w sposób ciągły, ale są wydzielane jako dyskretny impuls w odpowiedzi na czynnik uwalniający. Jednopunktowe pomiary próbek są niewystarczające, aby w pełni zrozumieć biologiczne znaczenie wzorca wydzielniczego hormonów pulsacyjnych zarówno w normalnych warunkach fizjologicznych, jak i w warunkach rozregulowania. Hormon luteinizujący (LH) jest syntetyzowany przez komórki gonadotropowe przedniego płata przysadki mózgowej i wydzielany w pulsacyjnym wzorcu, który wymaga częstego pobierania próbek krwi w celu oceny pulsu. Do niedawna nie było to możliwe u myszy, ze względu na opracowanie testu LH o wysokiej czułości i postęp w technice częstego pobierania próbek o małej objętości, początkowo opisanej przez Steyna i współpracowników. 1 Tutaj opisujemy protokół częstego pobierania próbek krwi obwodowej od myszy z wystarczającą aklimatyzacją do wykrywania pulsacyjnego wydzielania LH. Obecny protokół szczegółowo opisuje rozszerzony okres aklimatyzacji, który pozwala na ocenę solidnych i ciągłych impulsów LH przez wiele godzin. W tym protokole końcówka ogona jest obcinana, a krew jest pobierana z ogona za pomocą ręcznej pipety. W celu oceny pulsacyjnego LH u myszy poddanych gonadektomii, próbki seryjne pobiera się co 5-6 minut przez 90-180 minut. Co ważne, pobieranie krwi i pomiar silnych impulsów LH można przeprowadzić u obudzonych, swobodnie zachowujących się myszy, pod warunkiem odpowiedniej aklimatyzacji i wysiłku w celu zminimalizowania stresorów środowiskowych. Wystarczającą aklimatyzację można osiągnąć w ciągu 4-5 tygodni przed pobraniem krwi. Protokół ten podkreśla postępy w metodologii zapewniającej pobieranie próbek krwi pełnej do oceny pulsacyjnych wzorców wydzielania LH przez wiele godzin u myszy, potężnego modelu zwierzęcego do badań neuroendokrynnych.

Reprezentatywne wzorce impulsów LH u 4 myszy przedstawiono na Rysunku 1 (dane powtórzone z publikacji Yang et al., 2017). Poziom LH mierzono w częstych próbkach krwi, aby określić odpowiedź na ostry stres psychospołeczny. Dorosłe samice myszy C57/Bl6 poddano ovariektomii i obchodzono się z nimi zgodnie z opisem w niniejszym protokole w celu częstego pobierania krwi. Próbki krwi pobierano od wszystkich zwierząt przez pierwsze 90 min, aby ustalić bazow...

Tutaj prezentujemy protokół pobierania próbek krwi z końcówki ogona do częstego pobierania próbek u nieskrępowanych myszy. Metoda ta jest przydatna do oceny wzorców pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego i może być dostosowana do analizy innych krążących czynników.

Częste pobieranie próbek krwi na końcówce ogona u myszy w celu oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

Ogólnym celem częstego pobierania próbek krwi z końcówki ogona jest uzyskanie próbek krwi pełnej do pomiaru pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego, określanego jako LH, u obudzonych, nieznieczulonych i normalnie zachowujących się myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroendochrynologii reprodukcyjnej, zapewniając wiarygodny protokół oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego u myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że częste obchodzenie się i habituacja zapewnią solidne i wiarygodne pomiary impulsów hormonu luteinizującego po ostrym lub przewlekłym leczeniu eksperymentalnym.Przez pięć tygodni przed pobraniem krwi należy obchodzić się z myszami codziennie, od poniedziałku do piątku. W ostatnich dwóch tygodniach zajmij się myszami również w sobotę i niedzielę. Wykonaj reżim obchodzenia się z myszą w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni w szafce. Delikatnie przytrzymuj mysz na tej powierzchni, przytrzymując podstawę jej ogona. Następnie drugą ręką mocno pogłaszcz brzuszną powierzchnię ogona od podstawy do czubka.Zrób to w sumie sześć razy, a następnie włóż mysz z powrotem do klatki. Stanowi to jeden zestaw manipulacyjny. Teraz odczekaj sześć minut i wykonaj kolejną serię obsługi.Kontynuując ten wzorzec z interwałami między zestawami, wykonaj cztery zestawy obsługi na sesję obsługi. W sumie zapewnia to dwadzieścia cztery pociągnięcia ogonem na sesję. Jeśli eksperymentalne leczenie w okresie pobierania próbek będzie obejmowało wszelkie dodatkowe metody obchodzenia się, takie jak chrupanie lub wstrzyknięcie dootrzewnowe, należy również przystosować myszy do takiej czynności obchodzenia się podczas sesji przenoszenia.Dwa tygodnie przed planowanym dniem pobrania krwi trzymaj myszy w parach, aby zminimalizować ich zakłócenia w okresie pobierania próbek. Do pobierania krwi należy przygotować mikroprobówki wirówkowe o pojemności 0,6 mililitra do przechowywania krwi. Oznacz probówki i w przypadku trzech mikrolitrów krwi należy wprowadzić do każdej probówki pięćdziesiąt siedem mikrolitrów buforu ACES.Po przygotowaniu przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W szafie bezpieczeństwa biologicznego przygotuj następujące przedmioty: końcówki do pipet, kosz na śmieci, minutnik, dziennik doświadczeń, wiaderko z lodem zawierające probówki do pobierania krwi, ostre, sterylne nożyczki, marker permanentny i małą gazę. Czterdzieści pięć minut przed rozpoczęciem pobierania krwi wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni.Następnie zaznacz ogon, aby szybko zidentyfikować tę mysz od jej partnera w klatce. Teraz użyj nożyczek, aby usunąć od jednego do dwóch milimetrów końcówki ogona. Po przycięciu tego ogona ostrożnie głaszcz ogon, aż na końcu utworzy się kropla krwi.Następnie zbierz trzy mikrolitry krwi i wyrzuć zarówno krew, jak i końcówkę do kosza na śmieci. Następnie upewnij się, że przepływ krwi się zatrzymał. W razie potrzeby delikatnie uciskaj sterylną gazą.Następnie umieść mysz z powrotem w klatce na sześć minut. Teraz w sześciominutowych odstępach przez czterdzieści pięć minut mocno głaszcz ogon, aby pobrać dodatkowe próbki krwi od myszy. Jeśli kropla krwi nie utworzy się, przetrzyj ogon gazikiem nasączonym solą fizjologiczną, aby pomóc usunąć skrzep krwi.W okresie wstępnego pobierania próbek należy odrzucić wszystkie podwielokrotności krwi. Po czterdziestu pięciu minutach rozpocznij okres pobierania próbek. Podczas pobierania próbek przenieś trzy mikrolitry krwi do probówki zbiorczej, wymieszaj probówkę przez odwrócenie i umieść ją z powrotem na lodzie.Teraz należy kontynuować pobieranie próbek tak długo, jak to konieczne. Po zakończeniu należy poddać myszy eutanazji lub upewnić się, że przepływ krwi w ich ogonie całkowicie się zatrzymał, a następnie zapewnić myszom czystą klatkę. Następnie przenieś próbki krwi do pudełka do przechowywania i przechowuj je w temperaturze minus dwudziestu stopni Celsjusza, dopóki nie będzie można ich przeanalizować.Hormon luteinizujący lub LH mierzono w częstych próbkach krwi w celu określenia odpowiedzi na ostre wyzwanie związane ze stresem psychospołecznym. Dorosłą samicę czarnych sześciu myszy C57 poddano owariektomii, a próbki krwi pobierano przez dziewięćdziesiąt minut w celu ustalenia punktu odniesienia przed leczeniem pulsacyjnego wydzielania LH. W celu leczenia stresu podczas dziewięćdziesięciominutowego pobierania próbek, zwierzęta doświadczalne umieszczono w urządzeniach przytrzymujących gryzonie i przeniesiono do nowej klatki, podczas gdy grupa kontrolna pozostała w swoich domowych klatkach i nie była skrępowana.Analiza wykazała, że zwierzęta kontrolne miały wyraźne, jednoznaczne impulsy LH przez cały okres pobierania próbek. W przeciwieństwie do tego, stres psychospołeczny związany z ograniczeniem szybko i jednoznacznie hamował pulsacyjne wydzielanie LH w grupie eksperymentalnej. Przygotowując się do użycia tej techniki, ważne jest, aby pamiętać o zminimalizowaniu zakłóceń środowiskowych, takich jak hałas lub przerwy innych badaczy, które mogłyby stresować myszy i przerwać pulsacyjne wydzielanie LH.Od czasu jej opracowania przez dr Steina i innych w laboratorium Chen, technika ta zaczęła torować drogę naukowcom w dziedzinie neuroendokrynologii do badania regulacji impulsu LH u gatunku, w którym złożone narzędzia molekularne i genetyczne są praktyczne i dostępne.

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

W tym filmie demonstrujemy procedurę obcinania ogona na modelu myszy w celu pobrania krwi obwodowej. Pobrana krew jest następnie poddawana odwirowaniu w celu oddzielenia osocza, które można wykorzystać do dalszych eksperymentów.

Procedura wycinania ogona myszy w celu pobrania krwi obwodowej i izolacji osocza

Próbki krwi są przydatne do oceny biomarkerów stanów fizjologicznych lub chorób in vivo. Tutaj opisujemy metodologię pobierania krwi z bocznej żyły ogonowej u szczura. Ta metoda zapewnia szybkie pobieranie próbek przy minimalnym bólu i inwazyjności.

Pobieranie próbek krwi z bocznej żyły ogonowej szczura

Opisujemy rozwój szczupłego modelu myszy podobnego do PCOS z granulką dihydrotestosteronu w celu zbadania patofizjologii PCOS i potomstwa z tych matek podobnych do PCOS.

Hiperandrogenny model myszy do badania zespołu policystycznych jajników

To badanie informuje o próbkach krwi z żyły ogonowej u myszy przy użyciu systemu probówek do ekstrakcji próżniowej z lupą okularową. Nasza metoda jest łatwa do przećwiczenia i może być stosowana do powtórnego pobierania próbek krwi u myszy.

Zmodyfikowane pobieranie krwi z żył ogonowych myszy nieznieczulonych za pomocą próżniowego systemu pobierania krwi i lupy okularowej

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Ten artykuł opisuje technikę obsługi u myszy, technikę obsługi 3D, która ułatwia rutynowe obchodzenie się poprzez redukcję zachowań podobnych do lęku i przedstawia szczegóły dotyczące dwóch istniejących powiązanych technik (obsługa tunelu i ogona).

Techniki obchodzenia się w celu zmniejszenia stresu u myszy

To badanie opisuje bezpośredni pomiar produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników przy użyciu stabilnego izotopowego znacznika glukozy przez żyłę ogonową zarówno na czczo, jak i w stanie bogatym w glukozę w tandemie.

Ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników

Pulsatywność hormonu luteinizującego (LH) jest cechą charakterystyczną funkcji rozrodczych. Opisujemy protokół zdalnej aktywacji określonych populacji neuronów związany z seryjnym automatycznym pobieraniem krwi. Technika ta pozwala na czasową modulację hormonalną, multipleksowanie i minimalizowanie efektów manipulacji na poziomie LH u przytomnych, swobodnie poruszających się i niezakłóconych zwierząt.

Zdalna aktywacja neuronów w połączeniu z automatycznym pobieraniem próbek krwi w celu indukcji i pomiaru krążącego hormonu luteinizującego u myszy

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Poznaj metodę pobierania krwi z końcówki ogona u myszy do pomiaru pulsacyjnego wydzielania LH. Technika ta umożliwia niezawodne badania neuroendokrynologii reprodukcji przy minimalnym stresie zwierząt.

Częste pobieranie próbek krwi na końcówce ogona u myszy w celu oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego

Przeglądaj więcej filmów