Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie peptydów przeciwdrobnoustrojowych dotyczące tego, czy peptydy lokalizują się, czy translokalizują się przez błonę komórkową. Wykorzystanie sferoplastów i protoplastów umożliwia wizualizację i analizę lokalizacji peptydów w fizjologicznie istotnym systemie modelowym bez wyzwań związanych z rozdzielczością, jakie występują w przypadku obrazowania komórek bakteryjnych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat peptydów przeciwdrobnoustrojowych, można ją również zastosować do innych środków aktywnych błonowych, takich jak peptydy penetrujące komórki.

Gram-ujemne sferoplasty E. coli i Gram-dodatni protoplast B.megaterium powinny być przygotowane w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie z przepływem laminarnym przy użyciu odpowiedniej sterylnej techniki. W razie potrzeby szczepy bakteryjne mogą zawierać plazmid oporny na antybiotyki, a sferoplasty i protoplasty można przygotować na otwartym stanowisku laboratoryjnym. W tym filmie sferoplasty i protoplasty są przygotowywane na otwartym stanowisku laboratoryjnym przy użyciu szczepów bakterii opornych na antybiotyki.

Aby założyć hodowlę przez noc, użyj sterylnej końcówki mikropipety, aby przenieść pojedynczą kolonię bakterii z stałej płytki do hodowli agaru do 14-mililitrowej probówki hodowlanej, zawierającej od dwóch do trzech mililitrów trzyprocentowego bulionu sojowego z tryptykazą, TSB, na 16 do 21 godzin inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Aby przygotować sferoplasty Gram-ujemne E. coli, rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku jeden do 100 i 25 mililitrów TSB w kolbie o pojemności 250 mililitrów i zwrócić bakterie do inkubatora wstrząsającego na kolejne 2,5 godziny. Gdy roztwór osiągnie gęstość optyczną od 0,5 do 0,8 przy 600 nanometrach, rozcieńczyć kulturę w stosunku od jednego do dziesięciu w świeżym TSB w nowej kolbie o pojemności 250 mililitrów na drugą 2,5-godzinną inkubację z końcowym skutecznym stężeniem 60 mikrogramów na mililitr cefaleksyny.

Do produkcji jednokomórkowych włókien o długości około 50 do 150 mikrometrów, jak to uwidoczniono pod mikroskopem świetlnym przy 1000-krotnym powiększeniu. Odwirować roztwór bakteryjny w celu zebrania włókien i zdekantowania supernatantu. Umyj włókna delikatnym dodatkiem jednego mililitra 0,8 molowej sacharozy, uważając, aby nie naruszyć granulki.

Po jednej minucie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i dodać wskazane odczynniki w odpowiedniej kolejności do włókien. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej stopniowo dodawaj jeden mililitr roztworu A przez jedną minutę, delikatnie obracając roztwór ręcznie. Inkubować roztwór przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, a następnie podzielić zawiesinę włókien na dwie równe porcje między dwiema 15-mililitrowymi stożkowymi probówkami zawierającymi siedem mililitrów roztworu o temperaturze czterech stopni Celsjusza B. Następnie zagnieździć włókna przez wirowanie i użyć pipety asyryjskiej, aby ostrożnie usunąć wszystkie oprócz jednego do dwóch mililitrów supernatantu bez naruszania osadów.

Użyj mikropipety p1000, aby delikatnie zawiesić granulki. Sprawdzić małe porcje próbki pod kątem tworzenia się sferoplastów za pomocą mikroskopii świetlnej. Sferoplast można następnie przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do tygodnia lub do momentu, gdy przejdzie przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania.

Aby przygotować protoplasty Gram-dodatnie B.megaterium, rozcieńczyć nocną kulturę bakteryjną w stosunku jeden do 1000 w 100 mililitrach trzyprocentowego TSB w kolbie o pojemności 250 mililitrów na 4,5-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Gdy ciekła kultura osiągnie gęstość optyczną od 0,9 do 1,0 przy 600 nanometrach, podziel bakterie na dwie 50-mililitrowe stożkowe probówki w celu ich odwirowania i użyj pipety asyriologicznej do nasycenia supernatantów. Ponownie zawiesić granulki w 2,5 mililitra pożywki protoplastowej na probówkę i wciągnąć zawiesinę do pojedynczej stożkowej probówki do hodowli w kolbie o pojemności 125 mililitrów.

Dodaj jeden mililitr pięciu miligramów na mililitr lizozymu do kultury na godzinę inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Monitorowanie wzrostu protoplastu pod mikroskopem świetlnym i odnotowywanie wszelkich nieprawidłowości, takich jak bakterie, które pojawiają się jako spuchnięte pręciki zamiast kulek. Pod koniec inkubacji przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki protoplastowej.

Protoplast można następnie przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do tygodnia lub do momentu, gdy przejdzie przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. W celu wizualizacji sferoplastu lub protoplastu przenieś pięć mikrolitrów interesującej Cię zawiesiny na szkiełko pokryte poli lizyną, a następnie dwa mikrolitry fitc znakowanego 100 do 200 mikromolowym peptydem przeciwdrobnoustrojowym lub AMP. Po trzyminutowej inkubacji chronionej przed światłem dodać jeden mikrolitr odpowiedniej matrycy membranowej do próbki na kolejne trzyminutowe inkubacje w ciemności.

Pod koniec inkubacji przykryj oznakowany sferoplast lub protoplast szklanym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Aby zobrazować komórki, włącz mikroskop konfokalny i odpowiedni laser i wybierz obiektyw 63x, a następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby uzyskać ośmiobitowe obrazy stosu Z o wymiarach 512 na 512 składających się z 0,5 mikrometrowych wycinków całości każdej komórki bakteryjnej będącej przedmiotem zainteresowania. Aby zobrazować lokalizację znakowanego fluorescencyjnie AMP, otwórz obrazy stosu kompozytowego Z w odpowiednim programie do analizy obrazowania i zlokalizuj najbardziej środkowy wycinek pierwszego interesującego nas sferoplastu lub protoplastu.

Umieść jeden okrągły obszar zainteresowania o średnicy 0,3 mikrometra na membranie, jeden w środku komórki i jeden z dala od komórki, aby zmierzyć fluorescencję tła, uważając, aby uniknąć nasyconych pikseli. Średnia intensywność fluorescencji w każdym obszarze zainteresowania może być następnie obliczona przez oprogramowanie. Ograniczenia rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów świetlnych utrudniają rozróżnienie, czy znakowane fluorescencyjnie sygnały peptydowe pochodzą z błony, czy z przestrzeni wewnątrzkomórkowej u normalnych bakterii.

Ponieważ sygnały zlokalizowane na błonie będą wydawać się nakładać na przestrzeń wewnątrzkomórkową. W przeciwieństwie do tego, powiększony rozmiar sferoplastu i protoplastu w porównaniu z normalnymi bakteriami powoduje wyraźną rozdzielczość między markerem błonowym a przestrzenią wewnątrzkomórkową. Ułatwia to rozróżnienie lokalizacji peptydów.

Na przykład lokalizację na błonie i translokację przez błonę komórkową znakowanego fluorescencyjnie peptydu można uwidocznić zarówno w sferoplastach E. coli, jak i protoplastach B.megaterium, za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, jak właśnie pokazano. Rozmieszczenie obszarów zainteresowania na błonie i przestrzeni wewnątrzkomórkowej sferoplastu lub protoplastu oraz w tle umożliwia obliczenie stosunku intensywności fluorescencji peptydu wewnątrzkomórkowego do intensywności fluorescencji peptydu na błonie każdego sferoplastu lub protoplastu oddziałującego z AMP. Na przykład metoda ta może być wykorzystana do wizualizacji interakcji mutanta peptydu drobnoustrojowego pochodzącego z histonów ze sferoplastami E. coli i protoplastami B. megaterium.

W tym eksperymencie AMP wykazał podobny wzorzec lokalizacji w obu szczepach bakterii. Podkreślając jego zmniejszoną translokację w stosunku do peptydu typu dzikiego. Ostatecznie technika ta umożliwia naukowcom zbadanie wzorców lokalizacji peptydów na poziomie pojedynczej komórki.

Oferuje wgląd w mechanizm działania peptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Oprócz umożliwienia naukowcom zebrania większej liczby obrazów w celu systematycznej charakterystyki mechanizmów peptydowych, obrazy większych sferoplastów i protoplastów są łatwiejsze do opanowania w analizie ilościowej niż obrazy mniejszych komórek bakteryjnych.