Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do stanu naiwnego o ulepszonej sile różnicowania wieloliniowego

Metoda LIF-3i przywraca konwencjonalne ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste do bardziej prymitywnego stanu pluripotencjalnego z biochemicznymi, transkrypcyjnymi i epigenetycznymi cechami ludzkiego epiblastu przedimplantacyjnego. Metoda ta poprawia funkcjonalność konwencjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez zmniejszenie ekspresji genów opartych na linii i wyeliminowanie zmienności międzyliniowej ukierunkowanego różnicowania, powszechnie obserwowanej wśród niezależnych linii hPSC. Dzięki tej metodzie, chemicznie odwrócone ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste utrzymują stabilność kariotypową i epigenomiczną po przedłużonym pasażu, w tym w loci nadrukowanych, i mogą być różnicowane bezpośrednio z większą wydajnością bez konieczności ponownego etapu przygotowania.

Metoda LIF-3i otworzy nowe możliwości badań nad wczesną biologią rozwoju człowieka i może przyczynić się do rozwoju medycyny regeneracyjnej poprzez poprawę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, celowania w geny i generowania międzygatunkowych chimer. Aby rozpocząć protokół, należy utrzymać i namnażać konwencjonalne ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub hPSC z zwalidowanymi normalnymi kariotypami w kokulturach z mysim fibroblastem embrionalnym lub systemem hodowli paszowej opartym na MIF lub w systemie hodowli bez karmienia. Przygotować karmniki MEF na wcześniej przygotowanej żelatynizowanej sześciodołkowej płytce co najmniej jeden dzień przed pasażowaniem konwencjonalnych kultur hPSC dostosowanych do LIF-5i.

Po tym, jak konwencjonalne hodowle hPSC osiągną około 50% konfluencji, zastąp standardową pożywkę hodowlaną hESC dwoma mililitrami na studzienkę pożywki czynnika hamującego białaczkę 5i lub LIF-5i. Hodowla i utrzymanie konwencjonalnych hPSC i MEF przez okres do dwóch dni w LIF-5i w inkubatorze CO2. Codziennie zmieniaj pożywkę LIF-5i, aby dostosować je do ich późniejszego przejścia i stabilnego powrotu w LIF-3i.

W przypadku kultur konwencjonalnych bez karmienia, hPSC należy hodować w LIF-5i tylko przez noc przed pasażowaniem następnego ranka. Przed pasażowaniem należy raz przemyć konwencjonalne hPSC przystosowane do LIF-5i za pomocą PBS i dodać jeden mililitr odczynnika do dysocjacji komórek do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2.

Po inkubacji delikatnie rozetrzeć komórki za pomocą pipety do zawiesiny pojedynczej komórki z powrotem. Zawiesinę komórek należy zebrać w pożywce hESC w co najmniej dwukrotnym rozcieńczeniu w sterylnej, stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i delikatnie rozdzielić komórki przez pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Odwirować komórki o masie 300 g przez pięć minut.

Po wirowaniu odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym do dwóch mililitrów pożywki LIF-5i. Następnie policz komórki. Umyj wstępnie platerowaną sześciodołkową płytkę MEF dwukrotnie dwoma mililitrami PBS na studzienkę.

Rozprowadź od jednego do dwóch razy od 10 do szóstych komórek w dwóch mililitrach pożywki LIF-5i do jednego dołka płytki MEF przemytej PBS. Umieścić płytkę w inkubatorze CO2. Następnego dnia delikatnie zakręć płytką, aby podnieść wszystkie nieprzyłączone komórki i zassać pożywkę, a następnie zastąpić pożywkę dwoma mililitrami pożywki LIF-5i.

Powtarzaj ten krok codziennie przez trzy do pięciu dni lub do momentu, gdy komórki będą zlewać się w 60 do 70%. Protokół ten wspiera szybką i masową, naiwną rewersję szerokiego zakresu ludzkich linii embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, o ile preparaty ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wyraźnym różnicowaniem lub nieprawidłowymi kariotypami są skrupulatnie wykluczone. Po wstępnej adaptacji LIF-5i, kolejne stabilne kultury LIF-3i należy przechodzić co trzy do czterech dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub gdy kultury staną się zlewające się w 60 do 70%.

Wyrzuć pożywkę hodowlaną i umyj każdą studzienkę kultur LIF-5i-LIF-3i, delikatnie dodając dwa mililitry PBS. Wyrzuć PBS i dodaj jeden mililitr roztworu do odrywania komórek. Inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2.

Po inkubacji zebrać zawiesinę komórkową, dodać niepoddane działaniu substancji pożywkę hESC w dwukrotnym rozcieńczeniu i delikatnie rozprowadzić komórki przez pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Przenieść zawiesinę do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki o masie 300 g przez pięć minut, a następnie odessać i odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w podłożu LIF-3i, a następnie policzyć komórki. Następnie płytkę dwa razy po 10 do pięciu komórek na basenie na napromieniowany MEF w żelatynizowanej płytce sześciodołkowej w celu rutynowego pasażowania kultur LIF-3i. W przypadku początkowych kultur przystosowanych do LIF-5i, przed pierwszym przejściem do LIF-3i MEF należy umieścić początkowo większą gęstość.

Poszczególne linie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych powinny być zoptymalizowane i dostosowane do wysokich początkowych gęstości posiewu, jeśli jest to wymagane w celu utrzymania ciągłego pasażu masowego podczas wczesnych pasaży hodowli rewersyjnej LIF-3i. Ponownie płytkować i rozprowadzać hPSC przystosowane do LIF-5i na świeżych, mytych PBS, napromieniowanych płytkach podajnika MEF w pożywce LIF-3i. Pożywkę LIF-3i należy wymieniać codziennie.

Pasaż N-hPSC przez co najmniej cztery do siedmiu ciągłych pasaży masowych w pożywce LIF-3i przed użyciem N-hPSC w badaniach funkcjonalnych lub krioprezerwacji. Zapisać liczbę przejść N-hPSC w pożywce konwencjonalnej lub LIF-3i. Barwienie immunofluorescencyjne i western blot wykryły ekspresję aktywowanych fosforylowanych i całkowitych izoform STAT3 i Erk1/2, kluczowych markerów pluripotencji molekularnej.

Barwienia hematoksyliną i eozyną w mikrosekcjach potworniaka wykazały silne zróżnicowanie we wszystkich trzech listkach zarodkowych z dobrze zorganizowanymi liniami ektodermy, mezodermy i endodermy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przywrócić konwencjonalne ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste masowo do stanu podobnego do naiwnego przy użyciu sekwencyjnej uniwersalnej metody chemicznej LIF-5i do LIF-3i. Przed wypróbowaniem tego protokołu ważne jest, aby zacząć od niskiego pasażu konwencjonalnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, które są zgodne z normalnymi kariotypami.

Konwencjonalne hodowle ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych powinny być w większości niezróżnicowane i zawierać niewiele spontanicznie różnicujących się komórek przed rozpoczęciem. Początkowy, krótki etap adaptacji LIF-5i znacznie zwiększa ekspansję klonalną konwencjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i pozwala na ich późniejsze naiwne odwrócenie za pomocą samego LIF-3i w ilościach hurtowych, eliminując w ten sposób potrzebę późniejszego pobierania lub subklonowania rzadkich, naiwnych kolonii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Dalsza optymalizacja tej metody chemicznej wykorzystującej inhibitory tankyrazy w zdefiniowanych warunkach hodowli zgodnych z GMP bez karmienia ułatwi wydajne, klinicznie użyteczne generowanie szerokiej gamy funkcjonalnych i wszczepialnych typów komórek do użytku terapeutycznego.