Name: Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do stanu naiwnego o ulepszonej sile różnicowania wieloliniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę LIF-3i do chemicznej rewersji konwencjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do stanu naiwnego. Protokół ten poprawia zdolności różnicowania i zmniejsza ekspresję genów uwarunkowanych liniowo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez granty od NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award oraz The Moseley Foundation.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzano zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami oraz protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania (IACUC) Szkoły Medycznej Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy (MEF) do kultury konwencjonalnej komórek macierzystych ludzkich (hPSC) zależnej od podłoża (medium hESC/MEF) lub naiwnej-powrotnej (medium LIF-3i/MEF)
<ol>
	<li>Zakupu lub przygotowanie w warunkach domowych dostaw MEF podłoża z niską liczbą pokoleń z embrionów myszy CF1 lub hybryd CF1 x DR4 E13.5 zgodnie z opublikowanymi protokołami4.
	<ol>
		<li>Kriokonserwacja MEF nisko pokoleniowych (p1-p2) przed (dla długotrwałego przechowywania) lub po (na okres do 6 miesięcy) napromienieniu i przechowywanie w ciekłym azocie jak opisano wcześniej4.</li>
		<li>Napromienianie (5000 rad) MEF w masie podstawowym poniżej p5 za pomocą promieniowania γ lub X i przygotowanie alikwotów po 1,5 x 106 komórek na fiolkę na krótkoterminowe przechowywanie (mniej niż 6 miesięcy) w temperaturze -80 °C w zamrażarce ultraniskiej temperatury.</li>
		<li>Wysiew od 1,2 x 106 (świeżo napromieniowanych niekriokonserwowanych) do 1,5 x 106 (naporamieniowane kriokonserwowane) MEF na jednej żelatynizowanej płytce 6-dołkowej do przygotowania kultur podłoża, jak opisano poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie żelatynizowanej 6-dołkowej sterylnej płytki tkankowej z traktowaniem kulturowym poprzez dodanie 1,5 mL sterylnego 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka w biologicznej szafie bezpieczeństwa.</li>
	<li>Inkubacja żelatynizowanej płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h lub przez całą noc w laboratoryjnym inkubatorze CO2.</li>
	<li>Na następny dzień, rozmrażanie nisko pokoleniowych (np. P2 do P4) MEF zamrożonych w DMSO i napromieniowanych (5000 rad) zgodnie z krokami wskazanymi poniżej. 
	UWAGA: MEF nie napromieniowany należy również rozmrozić, rozwinąć i napromieniować bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Umieszczenie zamrożonego alikwotu MEF w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu, sterylizacja tuby za pomocą etanolu i natychmiastowe rozcieńczenie kryoprotektora DMSO co najmniej 10-krotnie za pomocą medium MEF (Tabela 1) w szafie bezpieczeństwa biologicznego (np. przeniesienie 1 mL alikwotu DMSO-MEF do 9 mL medium MEF w sterylnej 15 mL stożkowej fiolce).</li>
	<li>Centrifugowanie rozcieńczonych komórek MEF z siłą 200 x g przez 5 min w sterylnych 15 mL stożkowych fiolkach.</li>
	<li>W szafie bezpieczeństwa biologicznego, aspiracja i odrzucenie nadkomórkowego surowiczego płynu, i ponowne zawieszenie pelletu komórek w 1-2 mL świeżego medium MEF.</li>
	<li>Delikatne odrzucenie roztworu żelatyny i dodanie 2 mL MEF zawieszonego w medium MEF do każdego dołka żelatynizowanej 6-dołkowej płytki, jak wskazano powyżej. Liczenie komórek MEF i wysiew 1,2 x 106 (świeżo napromieniowanych niekriokonserwowanych) lub 1,5 x 106 (naporamieniowane kriokonserwowane) MEF na jednej żelatynizowanej 6-dołkowej płytce. 
	UWAGA: Wszystkie płytki do hodowli komórek, które są przenoszone z inkubatora CO2 do szafy bezpieczeństwa biologicznego, mogą być delikatnie przetarcia za pomocą papieru spryskiwanego etanolem, ale nie należy bezpośrednio spryskiwać 70% roztworem etanolu, aby uniknąć rozprzestrzeniania się etanolu w dołkach.</li>
	<li>Inkubacja płytek MEF w temperaturze 37 °C przez noc w laboratoryjnym inkubatorze CO2 (5% CO2, wilgotna atmosfera) w celu umożliwienia adhezji, przed użyciem.</li>
</ol>
2. Masowa stabilizacja konwencjonalnych kultur hPSC do późniejszej rewersji naiwnej z krótkim etapem adaptacji LIF-5i
<ol>
	<li>Walidacja wszystkich konwencjonalnych linii hPSC pod kątem posiadania normalnego kariotyp z wykorzystaniem metody G-banding, przed rozpoczęciem rewersji LIF-5i/LIF-3i. 
	UWAGA: Rewersja LIF-3i konwencjonalnych linii hPSC z wysokim pokoleniem (np. P>40-50) powinna być unikaną, ponieważ te kultury mogą już zawierać aberracje genomowe, które mogą negatywnie wpłynąć na stabilną, wydajną i masową rewersję LIF-3i pobudzonych, konwencjonalnych linii hPSC.</li>
	<li>Utrzymywanie i rozwijanie konwencjonalnych kultur hPSC z zweryfikowanymi normalnymi kariotypami w systemie kultur opartym na MEF (jak opisano w Sekcji 1), lub systemie kultur bez podłoża (zgodnie z preferencjami badacza). 
	UWAGA: Zarówno kultury współzależne hPSC/MEF (np. medium hESC (Tabela 1</

<ol><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Human+Naive+Pluripotency+in+the+Embryo+and+in+the+Dish%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish.</a> Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).</li>
<li>Zimmerlin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+promotes+a+stable+human+naive+pluripotent+state+with+improved+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality.</a> Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16388305">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).</li>
<li>Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24513647">Chromosome preparation from cultured cells.</a> J Vis Exp. (83), e50203(2014).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293(2011).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-activated+stem+cell+circuits+and+stromal+signals+cooperatively+accelerate+non-integrated+iPSC+reprogramming+of+human+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors.</a> PLoS One. 7 (8), 42838(2012).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).</li>
<li>Collier, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Cell+Surface+Protein+Profiling+Identifies+Specific+Markers+of+Human+Naive+and+Primed+Pluripotent+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+distinct+states+of+human+naive+pluripotency+generated+by+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming.</a> Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Pluripotent+Stem+Cells+with+In+Vivo+Embryonic+and+Extraembryonic+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency.</a> Cell. 169 (2), 243-257 (2017).</li>
<li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+simultaneous+generation+of+hematopoietic+and+vascular+progenitors+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+progenitors+from+cord+blood-derived+induced+pluripotent+stem+cells+possess+augmented+capacity+for+regenerating+ischemic+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature.</a> Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).</li>
<li>Taapken, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karotypic+abnormalities+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).</li>
<li>Mitalipova, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+copy+number+of+pluripotency+and+cell+proliferation+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+during+reprogramming+and+time+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).</li>
<li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+and+selection+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency.</a> Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).</li>
</ol>

Na mocy umowy licencyjnej między Life Technologies a Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis ma prawo do udziału w tantiemi odbieranych przez Uniwersytet za licencjonowanie komórek macierzystych. Warunki tej umowy są zarządzane przez JHU zgodnie z jego politykami dotyczącymi konfliktu interesów. Nie zmienia to przestrzegania przez autorów zasad czasopisma dotyczących udostępniania danych i materiałów.

System LIF-3i stosuje zmodyfikowaną wersję klasycznego koktajlu do rewersji naiwnych komórek macierzystych mysich 2i1 do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Samoregulacja hPSC (które nie mogą się rozwijać tylko w 2i) jest stabilizowana w LIF-2i poprzez uzupełnienie tego koktajlu inhibitorem tankyrazy XAV939. Hodowla LIF-3i pozwala na masową i efektywną rewersję konwencjonalnych hPSC do stanu pluripotencjalnego przypominającego ludzki epiblast przedimplantacyjny<stro...

System kultury 2i (inhibitor MEK/ERK i GSK3β) został pierwotnie opracowany w celu uszlachetnienia heterogenicznych kultur komórek macierzystych zarodkowych myszy (mESC) opartych na surowicy do jednolitego stanu podstawowego pluripotencji podobnego do mysiego epiblastu przedimplantacyjnego1. Jednak 2i nie wspiera stabilnego utrzymania ludzkich linii komórek macierzystych wielopotencjalnych (hPSC)2. Różne złożone małe cząsteczki, czynniki wzrostu uzupełnione i podejścia transgeniczne zostały niedawno zgłoszone jako zdobycie podobnych ludzkich stanów pluripotencjalnych przypominających stan naiwny2. Jednak wiele z "naiwnych" stanów stworzonych tymi metodami wykazywało również niestabilność kariotypów, wady epigenomowe (np. globalna utrata rodzicowskiego imprintingu genomowego) lub upośledzone potencjały różnicowania.
Natomiast koktajl potrójnej chemicznej inhibicji sygnałowania GSK3β, ERK i tankyrazy oraz czynnik hamujący białaczki (LIF-3i) był wystarczający do stabilnej naiwnej rewersji szerokiego repertuaru konwencjonalnych linii hPSC3. Nawrócone na LIF-3i naiwne hPSC (N-hPSC) utrzymywały normalne kariotyp i zwiększały ekspresję genów epiblastu przedimplantacyjnego specyficznych dla stanu naiwnego u ludzi (np. NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17, TFCP2L1). Rewersja LIF-3i nadała również hPSC szereg cech molekularnych i biochemicznych unikalnych dla wielopotencjalności naiwnej podobnej do mESC, w tym zwiększone fosforylowane sygnałowanie STAT3, zmniejszone fosforylację ERK, globalną hipometylację 5-metylocytozyny CpG, genomową demetylację CpG w promotorach genów komórek macierzystych zarodkowych (ESC) i dominujące odległe użycie enhancera OCT4. Co więcej, w porównaniu z innymi metodami rewersji naiwnej, które prowadziły do nieprawidłowo hipometylowanych genomowych locus imprintowanych, nawrócone na LIF-3i N-hPSC nie wykazywały systematycznej utraty imprintowanych wzorców CpG lub utraty ekspresji metylotransferazy DNA (np. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Bezpośrednia kultura LIF-3i szerokiego wachlarza konwencjonalnych ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) i ludzkich komórek macierzystych wielopotencjalnych indukowanych (hiPSC) hodowane na feederach lub warunkach bez feederów E8 osiągnęła szybkie i masowe odwrócenie do stanu naiwnego przypominającego epiblast. Jednak bezpośrednia naiwna rewersja LIF-3i może być nieefektywna w niektórych niestabilnych konwencjonalnych liniach hPSC z powodu wrodzonych różnic genomowych i związanych z linią plemienną zmienności wynikających z genetycznie zróżnicowanego pochodzenia donorów.
Dlatego, aby poszerzyć przydatność metody LIF-3i, opracowano i przedstawiono tutaj stopniową optymalizację, która pozwala na uniwersalną naiwną rewersję z prawie każdą konwencjonalną linią hESC lub wolną od transgenów linią hiPSC hodowanych na feederach. Ta uniwersalna metoda naiwnej rewersji stosuje początkowy tymczasowy krok kultury w konwencjonalnych hPSC, która uzupełnia koktajl LIF-3i o dwa dodatkowe małe cząsteczki (LIF-5i), które wzmacniają sygnałowanie kinazy białkowej A (forskolin) i sonic hedgehog (sHH) (purmorphaminę). Jeden początkowy przebieg konwencjonalnych hPSC w LIF-5i przystosowuje je do kolejnej stabilnej rewersji LIF-3i w dużych ilościach. Początkowa adaptacja LIF-5i znacząco zwiększa początkową klonalną proliferację jednokomórkowych konwencjonalnych hPSC hodowanych na E8 lub feederach (przed ich kolejnym stabilnym, ciągłym przebiegom w LIF-3i). Konwencjonalne linie hPSC zaadaptowane najpierw do jednego przebiegu w LIF-5i tolerują następnie masowe klonalne przebiegową naiwnie odwróconych komórek w warunkach LIF-3i, co eliminuje konieczność wybierania i subklonowania rzadkich stabilnych kolonii lub rutynowego stosowania anty-apoptotycznych cząsteczek lub inhibitorów Rho-skojarzonej białkowej kinazy (ROCK).
Metoda LIF-3i została pomyślnie zastosowana do stabilnego ekspandowania i utrzymywania szerokiego repertuaru ponad 30 niezależnych, genetycznie zróżnicowanych konwencjonalnych linii hPSC przez ponad 10-30 przebiegów za pomocą metod nieswoistych enzymatycznych lub enzymatycznych, bez występowania indukcji chromosomalnych lub epigenomowych anomalii, w tym anomalii w locus genów imprintowanych. Dodatkowo, sekwencyjna kultura LIF-5i/LIF-3i jest jedyną metodą naiwnej rewersji, która dotychczas została zgłoszona, która poprawia funkcjonalną pluripotencję szerokiego repertuaru konwencjonalnych linii hPSC, zmniejszając ich ekspresję genów związanych z linią i dramatycznie poprawiając ich wielopotacyjną potencjał różnicowania. Metoda naiwnej rewersji LIF-3i eliminuje wrodzoną zmienność międzyliniową różnicowania konwencjonalnych linii hPSC związanych z linią i będzie miała dużą przydatność w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej i terapii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>561716</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti- TFCP2L1 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA029708</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-beta-Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6276</td><td>use at 1:5000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-CD146 antibody,&nbsp; PE conjugated&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>550315</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody, APC conjugated</td><td>eBioscience</td><td>17-0319-42</td><td>use 2&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 microbead kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>anti-NANOG antibody</td><td>Abcam</td><td>ab109250</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-NR5A2 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA005455</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4695</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9145</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated</td><td>Agilent</td><td>E0432</td><td>use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>FAB1435A</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC1435G</td><td>use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9139</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-STELLA/DPPA3 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4388</td><td>use at a 1:50 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC4770R</td><td>use at&nbsp; a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0068</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560193</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560161</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>APEL2-Li</td><td>StemCell Technologies</td><td>5271</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere dilution buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>7183</td><td>dilutent for Vitronectin XF&trade; matrix</td></tr><tr><td>CF1 mouse</td><td>Charles river</td><td>023</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R&amp;D System</td><td>L5283</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>confocal microscope system</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>cord blood CD34+ derived iPSC line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>also referred as 6.2 line</td></tr><tr><td>Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Countess&nbsp; cell counting chamber slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 (E8) medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Stemgent</td><td>04-0025</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Gelatin (porcine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>resuspend in water and sterilize with an autoclave</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene cryogenic vials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Stemgent</td><td>04-0009</td><td>reconstitute at 10mM in DMSO</td></tr><tr><td>recombinant human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>AF-120-14E</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4</td><td>Peprotech</td><td>120-05ET</td><td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td></tr><tr><td>recombinant human FGF-basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>1

chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich komórek pluripotentnych do stanu naiwnego z poprawioną wieloliniową zdolnością do różnicowania

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Naïwe komórki macierzyste ludzkie wielopotencjalne (N-hPSC) o poprawionej funkcjonalności mogą mieć szeroki wpływ w medycynie regeneracyjnej. Celem tego protokołu jest efektywne przywrócenie komórkom macierzystym ludzkim wielopotencjalnym (hPSC) utrzymywanym w warunkach bez pokarmu lub zależnych od pokarmu, stanu podobnego do naïwego z poprawioną funkcjonalnością. Ta chemiczna metoda przywracania do stanu naïwego stosuje klasyczny czynnik hamujący białaczkę (LIF), GSK3β oraz koktajl hamujący MEK/ERK (LIF-2i), uzupełniony tylko o inhibitor tankyrazy XAV939 (LIF-3i). LIF-3i przywraca konwencjonalne hPSC do stabilnego wielopotencjalnego stanu przyjmując biochemiczne, transkrypcyjne i epigenetyczne cechy ludzkiego epiblastu przed implantacją. Metoda LIF-3i wymaga minimalnej manipulacji kulturą komórek i jest wysoce reproduktyjna w szerokim repertuarze ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) i wolnych od transgenów komórek macierzystych wielopotencjalnych indukowanych u ludzi (hiPSC). Metoda LIF-3i nie wymaga kroku re-prime'owania przed różnicowaniem; N-hPSC mogą być różnicowane bezpośrednio z niezwykle wysoką wydajnością i utrzymywać stabilność kariotypowo-epigenomiczną (w tym na loci wyciszonych). Aby zwiększyć uniwersalność metody, konwencjonalne hPSC są najpierw hodowane w koktajlu LIF-3i uzupełnionym o dwie dodatkowe małe cząsteczki, które potencjuje sygnalizację białkowej kinazy A (forskolin) i sonic hedgehog (sHH) (purmorphaminę) (LIF-5i). Ten krótki krok adaptacji LIF-5i znacznie zwiększa początkową ekspansję klonalną konwencjonalnych hPSC i pozwala na późniejsze przywrócenie do stanu naïwego z LIF-3i w ilościach masowych, eliminując potrzebę późniejszego wybierania/subklonowania rzadkich kolonii N-hPSC. Stabilizowane LIF-5i hPSC są następnie utrzymywane tylko w LIF-3i bez potrzeby molekuł przeciw apoptotycznych. Co najważniejsze, rewersja LIF-3i znacząco poprawia funkcjonalną wielopotencjalność szerokiego repertuaru konwencjonalnych hPSC poprzez zmniejszenie ich ekspresji genów zorientowanych na linię komórkową i wymazanie zmienności międzyliniowej kierowanego różnicowania, często obserwowanego między niezależnymi liniami hPSC. Podano reprezentatywne charakterystyki N-hPSC przywróconych LIF-3i, a także zarysowano strategie eksperymentalne do porównania funkcjonalnego izogenicznych hPSC w stanach zorientowanych na linię komórkową vs. podobnych do naïwego.

Ten protokół optymalizuje efektywną rewersję naiwną z LIF-3i zarówno w zależnych od podłoża, jak i niezależnych od podłoża liniach konwencjonalnych komórek pluripotentnych komórek macierzystych człowieka (Rycina 1). Szczegółowy protokół, opisany w niniejszym dokumencie, opisuje sekwencyjną adaptację do LIF-3i, zaczynając od konwencjonalnych warunków komórek pluripotentnych komórek macierzystych człowieka zależnych od podłoża lub niezależnych od podłoża (n...

Przedstawiamy protokół do wydajnej, masowej i szybkiej chemicznej rewersji konwencjonalnych linii komórek ludzkich o uprzywilejowanej linii pluripotentnych komórek macierzystych (hPSC) w epigenomicznie stabilny naiwny stan pluripotentny przypominający epiblast preimplantacyjny. Metoda ta powoduje zmniejszenie ekspresji genów o uprzywilejowanej linii i znaczną poprawę kierowanej różnicowania wieloliniowego w szerokim zakresie konwencjonalnych linii hPSC.

Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich komórek pluripotentnych do stanu naiwnego z poprawioną wieloliniową zdolnością do różnicowania

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Metoda LIF-3i odwraca konwencjonalne ludzkie pluripotentne komórki macierzyste w bardziej prymitywny stan pluripotencji z biochemicznymi, transkrypcyjnymi i epigenetycznymi cechami ludzkiego przedimplantacyjnego epiblastu. Ta metoda poprawia funkcjonalność konwencjonalnych ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych poprzez zmniejszenie ekspresji genów pierwotnych linii i usunięcie zmienności międzyliniowej kierowanej dyferencjacji często obserwowanej w niezależnych liniach hPSC. Stosując tę metodę, chemicznie odwrócone ludzkie pluripotentne komórki macierzyste utrzymują stabilność kariotypowo-epigenomiczną po przedłużonym przeprowadzeniu, w tym na zlokalizowanych lokacjach i mogą być różnicowane bezpośrednio z poprawioną wydajnością bez konieczności ponownego stymulowania.Metoda LIF-3i otworzy nowe drogi badań nad wczesną biologią rozwoju człowieka i może posłużyć rozwojowi medycyny regeneracyjnej poprzez poprawę dyferencjacji ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych, ukierunkowanego targetowania genów i wytwarzania chimer międzygatunkowych. Aby rozpocząć protokół, utrzymuj i rozwijaj konwencjonalne ludzkie pluripotentne komórki macierzyste lub hPSC z zweryfikowanymi norm

chemical-reversion-conventional-human-pluripotent-stem-cells-to-nave

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Generowanie zróżnicowanych typów komórek z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest bardzo obiecujące terapeutycznie, ale nadal stanowi wyzwanie. PSC często wykazują wrodzoną niezdolność do różnicowania, nawet gdy są stymulowane odpowiednim zestawem sygnałów. Opisane tutaj jest proste narzędzie do zwiększania różnicowania wieloliniowego w różnych liniach PSC.

Przejściowe leczenie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych DMSO w celu promowania różnicowania

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Poznaj metodę LIF-3i do chemicznej rewersji konwencjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do stanu naiwnego. Protokół ten poprawia zdolności różnicowania i zmniejsza ekspresję genów uwarunkowanych liniowo.

Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do stanu naiwnego o ulepszonej sile różnicowania wieloliniowego (Wideo) | JoVE Journal

Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich komórek pluripotentnych do stanu naiwnego z poprawioną wieloliniową zdolnością do różnicowania

Przeglądaj więcej filmów