Bioreaktory wsadowe i ciągłe

Bioreaktory, znane również jako fermentory, to systemy hodowli komórkowych, które zapewniają odpowiednie środowisko wzrostu. W hodowlach komórkowych powszechnie stosowane są dwa rodzaje bioreaktorów, bioreaktorów wsadowych i zbiornikowych z ciągłym mieszaniem. Reaktor wsadowy to zamknięty system naczyń zawierający wszystkie składniki potrzebne do hodowli komórkowej, podczas gdy reaktor zbiornikowy z ciągłym mieszaniem to system otwarty, w którym składniki aktywnie wpływają i wypływają, umożliwiając usuwanie odpadów i uzupełnianie składników odżywczych. Aby zmaksymalizować wzrost i gęstość komórek, można kontrolować wiele parametrów reaktora dla obu systemów, w tym temperaturę, ciśnienie, rozpuszczony tlen i pH. W tym filmie przedstawimy podstawowe zasady rządzące reaktorami wsadowymi i ciągłymi oraz zademonstrujemy procedurę szczegółowo opisującą ich zastosowanie w laboratorium.

Najprostszym typem bioreaktora jest reaktor wsadowy, który jest zamkniętym systemem zawierającym pożywki do hodowli komórkowych i populację komórek. W miarę wzrostu komórki zużywają składniki odżywcze i wydalają odpady, które gromadzą się w naczyniu. Stosowane są również reaktory zbiornikowe z ciągłym mieszaniem, które są otwartymi systemami, w których składniki odżywcze w sposób ciągły napływają, a komórki i odpady komórkowe wypływają. Umożliwia to kontrolę gęstości komórek poprzez usuwanie odpadów i uzupełnianie składników odżywczych. Przed użyciem któregokolwiek z systemów komponenty są sterylizowane, zwykle przy użyciu pary wodnej w celu złagodzenia zanieczyszczenia. Gdy reaktor jest w pełni zmontowany, sterylne pożywki hodowlane są dodawane do głównego naczynia, a następnie zaszczepiane kulturą starterową. Podczas użytkowania mieszanie i natlenianie są kontrolowane za pomocą wirników w celu utrzymania jednorodnego roztworu, w którym komórki są zaopatrywane w wystarczającą ilość składników odżywczych i tlenu potrzebnych do wzrostu. Ponadto systemy zbiorników fermentorowych są często wyposażone w sondy do pomiaru warunków, takich jak temperatura, rozpuszczony tlen i pH, aby zapewnić optymalne warunki wzrostu. Podczas wzrostu wsadowego populacja komórek przechodzi klasyczne fazy wzrostu. Po pierwsze, komórki wchodzą w fazę opóźnienia, w której komórki rosną powoli, dostosowując się do środowiska. Następnie komórki wchodzą w fazę logarytmiczną i dzielą się w tempie wykładniczym, aż składniki odżywcze zostaną wyczerpane lub toksyczne produkty uboczne osiągną poziom krytyczny. W końcu wzrost zwalnia, a komórki osiągają fazę stacjonarną, która daje możliwość zebrania interesującego produktu z hodowli. Produkt jest albo wydzielany przez komórki i zbierany bezpośrednio z bulionu hodowlanego, albo produkt pozostaje w komórce i musi zostać usunięty w procesie lizy komórek. Po zbiorach reaktor jest przygotowywany do nowej partii hodowli komórkowych poprzez czyszczenie i sterylizację.

Reaktory zbiornikowe z ciągłym mieszaniem wykazują początkowo podobne wzorce wzrostu i osiągają stałą gęstość komórek w stanie ustalonym. Jednak ta gęstość komórek zależy od szybkości rozcieńczenia, która jest szybkością zasilania i ścieków podzieloną przez objętość reaktora. Tak więc, gdy szybkość rozcieńczenia zbliża się do jednego, gęstość komórek maleje. Rozważając konfiguracje bioreaktorów, warto pamiętać, że reaktory okresowe są często używane ze względu na ich prostotę i niski koszt, chociaż gęstość komórek jest ograniczona. Reaktory ciągłe są w stanie zwiększyć gęstość komórek. Jednak przy dużej gęstości komórek może dojść do agregacji, uniemożliwiając optymalny wzrost. Dodatkowo dłuższe okresy fermentacji mogą zwiększać ryzyko zanieczyszczenia kultur.

Teraz, gdy wprowadziliśmy reaktory okresowe i ciągłe, przyjrzyjmy się procedurze dla obu, zaczynając od reaktora wsadowego. Przed użyciem reaktora okresowego pożywka komórkowa jest dodawana do czystego naczynia reakcyjnego. Po napełnieniu elementy naczynia są płukane wodą dejonizowaną i montowane. Komponenty obejmują płytę główną, rurę zbiorczą do pobierania próbek kultur, wirnik do utrzymywania jednorodności kultur i natleniania pożywki oraz rozpylacz gazu do dostarczania infuzji gazu do kultury. Montaż jest kontynuowany wraz z instalacją sondy natleniającej do pomiaru zawartości tlenu rozpuszczonego w zbiorniku, przewodów zasilających do dodawania kwasu lub zasady w celu kontrolowania pH oraz skalibrowanej sondy pH. Po zainstalowaniu wszystkich komponentów zmontowany reaktor jest sterylizowany za pomocą autoklawu. Naczynie jest następnie instalowane w podstawie fermentora, gdzie zarówno sonda pH, jak i sonda tlenu są podłączone do komputera. Dodatkowo rozpylacz gazu jest podłączony do rotametru gazowego, który mierzy natężenie przepływu gazu. W tym czasie wirnik jest włączany, a przepływ gazu, temperatura i mieszanie naczynia są regulowane aż do osiągnięcia pożądanych parametrów. Port inokulacyjny jest następnie sterylizowany alkoholem, a kultura starterowa dozowana do zbiornika reaktora. Podczas pracy próbki kultur komórkowych są pobierane w wybranych punktach czasowych w celu skonstruowania krzywej wzrostu na podstawie pomiarów gęstości komórek. Gdy gęstość komórek osiągnie pożądany poziom, hodowla zostaje zatrzymana, a komórki są zbierane z naczynia przez szereg etapów filtracji. Pozostałą zawartość naczynia usuwa się za pomocą wybielacza lub innej zawartości przeciwdrobnoustrojowej.

Podobnie jak reaktory wsadowe, reaktory zbiornikowe z ciągłym mieszaniem, czasami nazywane chemostatami, wymagają dokładnego przepłukania ich poszczególnych elementów wodą dejonizowaną przed montażem. Po oczyszczeniu zespół mieszadła i elementy wału napędowego są ze sobą łączone, a zbiornik reaktora napełniany jest wodą dejonizowaną, aby poprawić sterylizację podczas autoklawowania. Sondy rozpuszczonego tlenu, pH i temperatury są kalibrowane, a następnie instalowane. Gdy naczynie jest w pełni zmontowane, reaktor jest sterylizowany za pomocą autoklawu. Po sterylizacji naczynie umieszcza się w płaszczu grzewczym w celu kontrolowania jego temperatury, a skalibrowane sondy są podłączane. Następnie przed włączeniem przepływu powietrza podłącza się gąsior pożywki i dopływ powietrza ze sterylnym filtrem. Naczynie jest zalewane sterylnymi mediami poprzez odpięcie rurki gąsiora, a następnie uruchomienie podstawowego programu fermentora. Gdy pożywka przepływa do aktywnego reaktora, port inokulacyjny jest sterylizowany alkoholem przed dodaniem jednego mililitra kultury starterowej do naczynia. Podczas pracy próbki hodowli są pobierane w wybranych punktach czasowych w celu zmierzenia gęstości komórek. Dane te są następnie wykorzystywane do skonstruowania krzywej wzrostu. Optymalny wzrost osiąga się, gdy hodowla osiąga stan ustalony, co oznacza, że gęstość komórek pozostaje stała.

Teraz, gdy dowiedziałeś się już o reaktorach zbiornikowych z mieszaniem wsadowym i ciągłym, przyjrzyjmy się kilku praktycznym zastosowaniom tej technologii. Warzenie piwa odbywa się zwykle poprzez hodowlę drożdży w systemie reaktora wsadowego. Do reaktora dodaje się zestaw podstawowych składników składający się z oczyszczonej wody, słodu jęczmiennego, chmielu i drożdży. Słód jęczmienny stymuluje proces fermentacji, działając jako bogate w cukier źródło pożywienia dla drożdży, co po spożyciu powoduje produkcję alkoholu jako produktu odpadowego. Gdy mieszanina osiągnie docelową zawartość alkoholu lub będzie fermentowana przez określony czas, można ją przefiltrować, zapakować i pozostawić do leżakowania w celu wywołania nasycenia dwutlenkiem węgla przed dystrybucją produktu końcowego. Standardowe reaktory można również dostosować do specjalistycznych celów. Na przykład wyspecjalizowane reaktory mogą być wykorzystywane do zwiększania żywotności komórek rusztowań tkankowych poprzez lepszą dystrybucję komórek i składników odżywczych poprzez ciągłe mieszanie. Jednocześnie na rusztowaniu można zastosować stymulację mechaniczną, aby pobudzić produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywnie kierować wzrostem i różnicowaniem komórek. Powstałe rusztowania mają ulepszone właściwości fizjologiczne i mechaniczne, dzięki czemu są atrakcyjne do implantacji.

Właśnie obejrzałeś film Jowisza na temat reaktorów z mieszaniem okresowym i ciągłym. Powinieneś teraz zrozumieć, jak działają bioreaktory zbiornikowe z mieszaniem wsadowym i ciągłym oraz jak te systemy można zastosować w dziedzinie bioinżynierii. Dzięki za oglądanie.