Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiomu glebowego, ryzosfery i endosfery korzeni, takie jak to, jak zmienia się różnorodność społeczności drobnoustrojów w odpowiedzi na rodzaj próbki, traktowanie i genotyp rośliny. Główną zaletą tej techniki jest to, że doskonale nadaje się do eksperymentów terenowych, które wymagają dużej liczby próbek i replikacji. Procedurę zademonstruję ja i Stephanie Futrell, studentka i technik badawczy z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć protokół, oznacz patelnię i wiadro karteczką samoprzylepną ze szczegółami próbki rośliny. Zanieś oznakowane wiadro na działkę i pozostaw umywalkę na ustalonym stanowisku pracy w terenie. Losowo wybierz i zbierz dwie rośliny na działkę z różnych obszarów na działce.

Następnie przebij glebę łopatą na głębokość 30 centymetrów, aby przeciąć dowolny z bocznych korzeni utrzymujących roślinę w glebie. Wykop korzenie rośliny, wykorzystując łopatę i umieść bryłę korzeniową w oznaczonym wiadrze. Przynieś łyżkę z powrotem na stanowisko pracy w terenie.

Potrząśnij korzeniami i użyj łopaty lub ręcznego rumpla, aby usunąć ziemię z korzeni. Załóż rękawice i umieść korzenie w pobliżu stacji przetwarzania. Po potrząśnięciu korzeniami wymieszaj ziemię na patelni i rozbij wszelkie grudki gleby za pomocą ręcznej glebogryzarki.

Umieść próbkę gleby, która jest wolna od zanieczyszczeń, w oznakowanej torbie do przechowywania na suwak o wymiarach 17,7 na 19,5 centymetra i umieść ją na lodzie. Sterylizuj nożyczki do przycinania w 70% etanolu. Użyj sterylnych nożyczek, aby wyciąć różne korzenie, około czterech do sześciu korzeni na roślinę, a każdy korzeń ma około dziewięciu do 12 centymetrów długości.

Umieść wycięte korzenie w oznakowanej 50-mililitrowej probówce zawierającej 35 mililitrów autoklawowanego buforu fosforanowego ze środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak Silwet L-77. Potrząsaj rurkami przez dwie minuty, aby uwolnić ryzosferę z powierzchni korzeni. Popraw wstrząsy za pomocą generatora i wirownika.

Za pomocą kleszczy wysterylizowanych w 70% etanolu usuń korzenie z tuby, osusz je krótko na ręcznikach papierowych i umieść w nowej, oznakowanej, 50-mililitrowej tubce. Umieść na lodzie zarówno probówkę zawierającą ryzosferę, jak i rurkę zawierającą korzenie. Dodaj około 35 mililitrów 50% wybielacza plus 0,01% Tween 20 do 50-mililitrowych tubek z korzeniami zebranymi na polu.

Wiruj lub potrząsaj probówkami przez 30 do 60 sekund. Odlej wybielacz, dodaj 35 mililitrów 70% etanolu i wiruj lub potrząsaj korzeniami przez kolejne 30 do 60 sekund. Po wstrząśnięciu odlej 70% etanol i dodaj 35 mililitrów sterylnej, ultraczystej wody i wiruj lub wstrząsaj próbką przez jedną minutę.

Powtórz etap płukania wodą jeszcze dwa razy, aby korzeń został poddany łącznie trzem płukaniom sterylnej, ultraczystej wody. Osusz korzenie na suchych, czystych ręcznikach papierowych i użyj czystego ręcznika papierowego do każdej próbki. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek do przycinania pokrój korzenie na około pięciomilimetrowe kawałki i umieść ścięte korzenie w czystej, oznakowanej, stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, a następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki.

Potrząsaj 50-mililitrowymi probówkami zawierającymi próbki ryzosfery z pola przez 20 do 30 sekund, aby ponownie zawiesić całą próbkę. Używając sterylnego sitka o siatkowej siatce 100 mikronów, przefiltruj ponownie zawieszoną próbkę do nowej 50-mililitrowej probówki. Następnie odwirować probówki z ciśnieniem 3 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Natychmiast odlewać i wyrzucić supernatant. Umieść granulki ryzosfery w 50-mililitrowych rurkach na lodzie. Następnie dodaj 1,5 mililitra sterylnego buforu fosforanowego bez środka powierzchniowo czynnego do granulek ryzosfery i odwiruj je, aby ponownie zawiesić próbkę.

Odpipetuj zawieszoną ciecz do czystej, oznakowanej, dwumililitrowej probówki do mikrofugi. Wiruj probówki z prędkością 15 871 razy g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Natychmiast odlej sklarowany sklarent i opróżnij probówki na czystych ręcznikach papierowych.

Przechowuj granulki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Za pomocą sterylnej metalowej szpatułki napełnij czystą, oznakowaną, dwumililitrową probówkę około trzema gramami gleby do ekstrakcji DNA i unikaj małych kawałków korzeni i zanieczyszczeń. Opłucz metalową szpatułkę w 70% etanolu między każdą próbką.

Przechowuj tę próbkę gleby w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W czystej patelni do mycia opróżnij worek z ziemią na ułożone w stos sita z większym sitkiem na mniejszym sicie i ręcznie przesiej ziemię przez oba sita. Użyj szczotki, aby dokładnie wyczyścić sita między próbkami.

Odłóż od 100 do 125 gramów przesianej gleby w torbie zapinanej na zamek błyskawiczny o wymiarach 17,7 na 19,5 centymetra do przyszłej analizy fizykochemicznej i tekstury gleby. Umieść worki z ziemią w temperaturze czterech stopni Celsjusza do krótkotrwałego przechowywania. Następnie wlej ciekły azot do plastikowej zlewki za pomocą czystych szpatułek i w czystym moździerzu.

Zamrożoną chusteczkę umieszczamy w moździerzu i mielimy ją tłuczkiem na drobny proszek. Stale dodawaj ciekły azot podczas mielenia, aby utrzymać próbki w stanie zamrożonym. Za pomocą szpatułki przenieś zmieloną tkankę do czystej, oznakowanej probówki o pojemności dwóch mililitrów, a następnie przechowuj tkankę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przetrzyj miejsce pracy 70% etanolem i 1% domowym wybielaczem. Wyjmij próbki gleby z magazynu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź je w wiadrze z lodem. Zdejmij pokrywę maty uszczelniającej z 96-dołkowej płytki ekstrakcyjnej i umieść ją między dwiema chusteczkami papierowymi, aby utrzymać ją w czystości, gdy nie jest używana.

Przykryj 12 kolumn płytki samoprzylepnymi 8-dołkowymi paskami PCR, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wytaruj sterylny, mały lejek wagowy na wadze i zważ od 200 do 250 miligramów gleby. Ostrożnie podnieś pasek samoprzylepny do góry, umieść szyjkę napełnionego lejka wagowego w odpowiedniej studzience i delikatnie wprowadź próbkę gleby do odpowiedniej studzienki.

Wymień pasek samoprzylepny, aby zakryć studnię. Powtórz ten proces dla każdej studzienki, używając nowego sterylnego lejka dla każdej próbki. Załóż pokrywę maty uszczelniającej na płytkę ekstrakcyjną i przechowuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do ekstrakcji DNA.

Wyjmij próbki ryzosfery z magazynu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź w wiadrze na lód. Przygotuj płytkę do ekstrakcji DNA, jak opisano w poprzednim rozdziale. Umieść czystą chusteczkę papierową na wadze, a następnie wytaruj sterylną metalową szpatułkę na wadze.

Za pomocą szpatułki ostrożnie wyjąć część osadu ryzosfery z probówki na próbkę. Odważyć od 200 do 250 miligramów próbki ryzosfery. Ostrożnie podnieś pasek samoprzylepny, aby odsłonić pierwszą głębinę płytki ekstrakcyjnej.

Ustaw napełnioną szpatułkę w studzience i zeskrob materiał ryzosfery do odpowiedniej studzienki sterylną wykałaczką. Opłucz metalową szpatułkę w wodzie, a następnie 70% etanolu między próbkami. Na koniec powtórz ten proces dla każdego dołka płytki, aż płytka zostanie napełniona, pozostawiając jedną studzienkę pustą jako ślepą próbę ekstrakcyjną.

W tym reprezentatywnym zestawie danych stwierdzono bardzo istotne różnice między typami próbek, a ryzosfera i gleba wydają się być bardziej podobne pod względem składu do siebie niż korzeń. Dalsza analiza pokazuje, że istniały również bardzo istotne różnice w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych między ryzosferą a glebą. Analiza różnorodności alfa pokazuje, że zbiorowiska drobnoustrojów w endosferze były niższe niż zbiorowiska w glebie i ryzosferze.

Jedyna znacząca różnica w różnorodności między gatunkami traw występowała między próbkami endosfery dużej niebieskiej łodygi i proso rózgowatego. Analiza względnej liczebności podkreśla dominację Proteobacteria, a następnie Actinobacteria we wszystkich typach próbek. Gleba i ryzosfera są zdominowane przez Acidobacteria i Chloroflexi, podczas gdy korzenie miały większą względną obfitość Bacteriodetes.

Analiza przeprowadzona w ramach projektu PERMANOVA wszystkich typów próbek wykazała bardzo istotną różnicę w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych ze względu na gatunki roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać szereg kroków, które można wykorzystać w badaniu mikrobiomów gleby, endosfery i ryzosfery. Chcielibyśmy podziękować EPSCoR w Nebrasce i Narodowej Fundacji Nauki EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 za częściowe sfinansowanie tego filmu edukacyjnego.