Name: Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metody izolacji i analizy mikrobiomów gleby, ryzosfery i endosfery korzeni w badaniach polowych z trawami wieloletnimi. Technika ta umożliwia standaryzację badań ekologii mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój tego manuskryptu jest wspierany przez National Science Foundation EPSCoR Center for Root and Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Gromadzenie danych było wspierane przez fundusze z University of Nebraska-Lincoln, Agricultural Research and Development oraz przez Hatch Grant z USDA. Doceniamy również wsparcie ze strony USDA-ARS oraz wsparcie zostało udzielone przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Konkurencyjny grant nr 2011-68005-30411 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA na ustanowienie i zarządzanie tymi polami.

<ol><li>Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+back+to+the+roots%3A+the+microbial+ecology+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).</li>
<li>Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+the+unknown%3A+disentangling+the+complexities+of+the+soil+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome.</a> Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+microbial+communities+in+soil%2C+rhizosphere+and+roots+of+two+major+crop+systems+under+elevated+CO2+and+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15019(2017).</li>
<li>White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio+Temporal+influence+of+isoflavonoids+on+bacterial+diversity+in+the+soybean+Rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).</li>
<li>Edwards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+variation%2C+and+assembly+of+the+root-associated+microbiomes+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bougoure, D. S., Cairney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblages+of+ericoid+mycorrhizal+and+other+root-associated+fungi+from+Epacris+pulchella+%28Ericaceae%29+as+determined+by+culturing+and+direct+DNA+extraction+from+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots.</a> Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).</li>
<li>Doty, S. L., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF03179967">Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow.</a> Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).</li>
<li>Gottel, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+microbial+communities+within+the+endosphere+and+rhizosphere+of+populus+deltoides+roots+across+contrasting+soil+types%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).</li>
<li>Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+endophytic%2C+indole-3-acetic+acid-producing+yeasts+occurring+in+Populus+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees.</a> Mycological Research. 113, 973-980 (2009).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biolology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biolology. 12, 87(2014).</li>
<li>Gohl, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+improvement+of+amplicon+marker+gene+methods+for+increased+accuracy+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+innovations+for+high-throughput+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).</li>
<li>RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.rstudio.com/">http://www.rstudio.com/</a> (2015).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://affect-reason-utility.com/1301/4/shannon1948.pdf">A mathematical theory of communication.</a> Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).</li>
<li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/163688a0">Measurement of diversity.</a> Nature. 163, 688(1949).</li>
<li>Chao, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4615964">Non-parametric estimation of the number of classes in a population.</a> Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).</li>
<li>Legendre, P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jpe/article/1/1/3/1130269">Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis.</a> Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).</li>
<li>Oksanen, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228975085_The_Vegan_Package">The vegan package.</a> Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).</li>
<li>Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22Ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).</li>
<li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ribosomal+Database+Project+%28RDP-II%29%3A+sequences+and+tools+for+high-throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).</li>
<li>Wagner, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genotype+and+age+shape+the+leaf+and+root+microbiomes+of+a+wild+perennial+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant.</a> Nature Communications. 7, 12151(2016).</li>
<li>O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+community+analysis+by+large-scale+sequencing+of+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).</li>
<li>Taylor, D. L., et al. <a target="_blank" href="https://esajournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1890/12-1693.1">A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning.</a> Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).</li>
<li>Lebeis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+modulates+colonization+of+the+root+microbiome+by+specific+bacterial+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa.</a> Science. 349 (6250), 860-864 (2015).</li>
<li>Ofek-Lalzar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+and+host-associated+functional+signatures+of+the+root+surface+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome.</a> Nature Commununications. 5, 4950(2014).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Fitzpatrick, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+ecological+function+of+the+root+microbiome+across+angiosperm+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).</li>
<li>Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+effects+of+nitrogen+fertilization+on+soil+bacterial+communities+in+contrasting+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems.</a> Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).</li>
<li>Paungfoo-Lonhienne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+table%3A+Plants+consume+microbes+as+a+source+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients.</a> PLoS One. 5 (7), e11915(2010).</li>
<li>Yeoh, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li>
<li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li>
<li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metody opisane w tym manuskrypcie powinny umożliwić naukowcom łatwe wejście w dziedzinę metagenomiki gleby i roślin. Z biegiem lat udoskonaliliśmy nasze metody od czasu przeprowadzenia eksperymentu opisanego w tym manuskrypcie. Jedną ze zmian jest to, że teraz wstępnie etykietujemy probówki przed wyjściem w teren w celu pobrania próbek. Nasze laboratorium korzysta z systemu kodów kreskowych oraz drukarki etykiet. Drukarka etykiet nie tylko oszczędza czas podczas etykietowania tubek, ale także ułatwia śledzenie i prawidłową identyfikację próbek bez kaprysów ludzkiego pisma ręcznego. Kolejnym krytycznym punktem jest to, że staramy się przetworzyć materiał po przywiezieniu go z pola tak szybko, jak to możliwe. Naszym celem jest zamrożenie gleby używanej do analizy DNA, sterylizacja i zamrożenie korzeni oraz przefiltrowanie i zamrożenie ryzosfery w ciągu 12 do 36 godzin po powrocie z pola. Procedury ekstrakcji DNA są długotrwałe i składają się z wielu etapów, szczególnie w przypadku gleby i ryzosfery, dlatego zakupiliśmy robota (Kingfisher Flex, ThermoFisher), który minimalizuje czas potrzebny na protokoły ekstrakcji DNA, zmniejsza błąd ludzki, który może zostać wprowadzony, i poprawia spójność w sposobie przetwarzania różnych partii gleby, korzeni lub ryzosfery. Podczas pracy z materiałem roślinnym ważne jest, aby zdecydować się na typ korzenia, który ma być badany, lub pobrać różne typy korzeni, aby uzyskać "reprezentatywną próbkę". Utrzymanie korzeni i liści w stanie zamrożonym podczas przeprowadzania ekstrakcji DNA jest ważne, podobnie jak zapewnienie, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami podczas napełniania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA. Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest liczba powtórzeń, które mają być użyte podczas projektowania eksperymentów terenowych i stosowania kompletnego projektu randomizowanego, jeśli to możliwe26. Ze względu na dużą zmienność pola może być konieczne przeprowadzenie dużej liczby powtórzeń w celu wykrycia niewielkich różnic. Wreszcie, z naszego doświadczenia wynika, że ważne jest, aby upewnić się, że gleba nie jest zbyt mokra podczas kopania korzeni. Jeśli gleby są nasycone wodą, praca z nimi jest nie tylko niechlujna, ale także bardzo trudno jest zdefiniować ryzosferę i usunąć glebę z korzeni.
Jedną z modyfikacji, która została wprowadzona na wczesnym etapie opracowywania tych metod, było to, że zamiast ręcznie potrząsać rurkami w celu uwolnienia ryzosfery, zmodernizowaliśmy je do wirów zasilanych generatorem gazu, aby ułatwić pracę w terenie i bardziej ustandaryzować pod względem czasu i sposobu mieszania każdej rurki. Jednym z ograniczeń podejścia opartego na sekwencjonowaniu amplikonów jest to, że rozdzielczość taksonomiczna wyników jest często ograniczona, a wiele OTU jest nieznanych lub znanych tylko na poziomie rodziny lub rodzaju. Ta dziedzina badań szybko się rozwija, dlatego ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z nowych i rozwijających się podejść, szczególnie w przypadku analizy danych, która może poprawić rozdzielczość wyników.
Protokoły te służą wyłącznie do badania bakterii i archeonów, a nie grzybów. Zastosowanie różnych starterów do amplifikacji pozwoli na badanie zbiorowisk grzybów przy użyciu tych samych próbek DNA27,28. Metody te nie wymagają zakupu dużych ilości sprzętu, ponieważ metody można uprościć. Metody, które tutaj opisujemy, służą głównie do określania "kto tam jest", ale dziedzina ta szybko ewoluuje w kierunku zadawania ważnych pytań dotyczących funkcji, na które można odpowiedzieć za pomocą metod sekwencjonowania typu shotgun, izolacji i testowania funkcjonalności drobnoustrojów lub sekwencjonowania całych genomów drobnoustrojów.
Reprezentatywne wyniki podkreślają różnice w zbiorowiskach drobnoustrojów, które można zidentyfikować za pomocą opisanych metod. Stosując podejście oparte na różnorodności beta do analizy danych22, wykazano różnice w składzie między typami prób. Różnice te zostały wyraźnie zaobserwowane w większości innych badań, w których endosfera, ryzosfera i gleba zawierają unikalne zbiorowiska drobnoustrojów3. Wskaźnik różnorodności Shannona został obliczony w celu określenia liczebności i równomierności gatunków drobnoustrojów obecnych w każdym gatunku roślin w endosferze, ryzosferze i glebie. Jak wykazano w tym badaniu i wielu innych, różnorodność alfa jest największa w glebie, nieznacznie maleje w ryzosferze, a następnie znacznie maleje w endosferze 3,5,29. Wyniki te wskazują, że opisane tutaj metody są odpowiednie do identyfikacji zmian składu chemicznego w endosferze, ryzosferze i glebie.
Dominacja Proteobacteria jest częstym odkryciem w badaniach nad endosferą i glebą 30,31,32. Endosfera ma na ogół mniejszą różnorodność gatunków drobnoustrojów z wyższą względną liczebnością Proteobacteria. To ponownie podkreśla, że uzyskane tu wyniki są reprezentatywne dla innych ustaleń w literaturze. Efekty stosowania substancji w tym badaniu nie różniły się znacząco, a dwoma głównymi przyczynami takiego stanu rzeczy może być to, że różnice wynikające z zabiegów nie były wystarczająco duże, aby wygenerować wystarczającą zmienność do wykrycia, oraz fakt, że pobieranie próbek zostało wykonane pod koniec sezonu wegetacyjnego, kiedy pola mogły mieć wystarczająco dużo czasu na pobranie azotu do podobnych poziomów, Czyli tyle, ile zostało zmierzone na koniec sezonu. W innym badaniu, w którym zastosowano podobne dawki nawożenia w dłuższym okresie czasu, zmierzono tylko stosunkowo niewielkie zmiany w składzie mikrobiomu33. Inne badania wykazały zmiany zarówno w zbiorowiskach grzybów, jak i bakterii spowodowane nawozem azotowym34,35.
Wiadomo, że gatunki roślin odgrywają rolę w określaniu ich mikrobiomów 3,32,36, a nawet wykazano niewielkie różnice w zmienności społeczności drobnoustrojów między różnymi genotypami roślin w obrębie jednego gatunku 37. W niniejszej pracy stwierdzono istotną różnicę w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych między gatunkami roślin. We wszystkich typach próbek okazało się, że proso rózgowate miało najbardziej wyraźny skład mikrobiologiczny, ale różnice między gatunkami były istotne statystycznie tylko w endosferze. Skład zbiorowiska ryzosfery mógłby stać się znaczący, gdyby dostępnych było więcej powtórzeń do analizy.
Opisane tutaj połączone protokoły terenowe, laboratoryjne i analityczne zapewniają potężną metodę badania, w jaki sposób różne czynniki wpływają na skład zbiorowisk drobnoustrojów w glebach, ryzosferze i endosferze korzeni36. Jest jeszcze wiele do zrobienia w dziedzinie badania mikrobiomów, szczególnie w dziedzinach rolniczych. Ważne pytania dotyczące tego, w jaki sposób mikrobiom glebowy zmienia plony, nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Nawet najbardziej podstawowe pytania dotyczące tego, jak płodozmian wpływa na mikrobiom glebowy, jak czas zmienia mikrobiom, jak stres abiotyczny zmienia mikrobiom, jak rodzaj gleby oddziałuje z tymi czynnikami, aby zmienić mikrobiom i czy w niektórych uprawach lub regionach USA występują uniwersalne drobnoustroje, są pytaniami otwartymi. Metody te będą również przydatne w badaniach epidemiologicznych w celu identyfikacji obecności i trwałości bakterii chorobotwórczych i pożytecznych. Kolejnym horyzontem przyszłości dla tych metod będzie rozpoczęcie integracji opisanych tu metod DNA z danymi dotyczącymi RNA i metabolitów roślin i mikrobów. Dodatkowe ulepszenia i testowanie większej liczby zmiennych będą ważne dla dalszej optymalizacji tych protokołów.

Badania mikrobiomu mają ważne implikacje dla zrozumienia i manipulowania procesami ekosystemowymi, takimi jak obieg składników odżywczych, obrót materią organiczną oraz rozwój lub hamowanie patogenów glebowych1,2. Ten obszar badań ma również ogromny potencjał w zakresie zrozumienia wpływu mikroorganizmów glebowych na produktywność naturalnych zbiorowisk roślinnych i agroekosystemów. Podczas gdy istnieje wiele badań, które koncentrowały się na mikrobiomie glebowym w naturalnych ekosystemach, mniej skupiało się na mikroorganizmach ryzosfery roślinnej i endosfery w agroekosystemach3. W Nebrasce rolnictwo dominuje w krajobrazie w dużej części stanu, co sprawia, że badania tych gleb, na których uprawia się rośliny ważne dla rolnictwa, są istotnym tematem badań. Celem niniejszej pracy metodologicznej jest dostarczenie naukowcom standardowego zestawu protokołów do opisu drobnoustrojów obecnych w agroekosystemach, określenia, w jaki sposób korzenie roślin modyfikują społeczności drobnoustrojów w ryzosferze i endosferze, a ostatecznie zrozumienia funkcji, jakie te drobnoustroje odgrywają w zdrowiu gleby i produktywności roślin.
Przedstawiona tutaj metoda różni się nieznacznie od metod używanych przez inne4,5 tym, że ten artykuł ma na celu poznanie, które mikroby znajdują się wyłącznie wewnątrz korzenia i czym różnią się od mikrobów znajdujących się bezpośrednio poza korzeniem w ryzosferze. Sekwencjonowanie amplikonów zastosowane w tym badaniu identyfikuje taksony drobnoustrojów znalezione w próbce DNA i pozwala badaczom określić, jak zmieniają się społeczności w zależności od rodzaju próbki lub traktowania. Jedną z kluczowych różnic między tym protokołem a bardzo podobnym protokołem używanym przez Lundberga i wsp.6 jest to, że zamiast sonikacji, ten protokół wykorzystuje sterylizację powierzchni za pomocą wybielacza i etanolu w celu usunięcia ryzosfery z korzeni. Inni również skutecznie stosowali sterylizację powierzchni7,8,9,10. Metody te nie są korzystniejsze niż inne metody, ale nieco inne. Metody te szczególnie dobrze nadają się do dużych eksperymentów terenowych, ponieważ przy wystarczającej liczbie osób możliwe jest przetworzenie ponad 150 poletek polowych dziennie, co daje około 450 próbek po podziale na endosferę, ryzosferę i glebę. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje metody stosowane do pobierania próbek w terenie, przetwarzania materiału w laboratorium, ekstrakcji i sekwencjonowania DNA, a także zawiera krótki przegląd kroków do analizy uzyskanych danych sekwencjonowania.

<table><tbody><tr><td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Zestaw</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>12955-4</td><td>Zestaw ekstrakcyjny do gleby i ryzosfery</td></tr><tr><td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Zestaw</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>13496-4</td><td>Zestaw do ekstrakcji korzeni</td></tr><tr><td>Łopata do kopania z uchwytem D, 101 cm L</td><td>Glebogryzarka szybka Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>, 40 cm L</td><td>Truper</td><td>34316</td><td></td></tr><tr><td>Worki Ziploc, 17,7 cm x 19,5 cm</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cooler</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Patelnia do mycia</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe wiadro</td><td>Dowolne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice (robocze i laboratoryjne)</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Średnica 20 cm Sito do gleby #8, 2360 &mu; m rozmiar oczek</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-8FS</td><td></td></tr><tr><td>Sito glebowe o średnicy 20 cm #4, 4750 &mu; m rozmiar oczek</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>Przenośny generator US8-4FS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marka Honda działa dobrze</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe 100 &mu; m rozmiar oczek</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td> Autoklawy środków <td>powierzchniowo czynnych</td></tr><tr><td></td><td>Dowolna</td><td>kuchenka</td> do suszenia na NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Dowolna</td> skala <td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wybielacz</td><td>CLOROX - siła gospodarstwa domowego</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Granulki suchego lodu</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>11 cm Precyzyjna pęseta drobno punktowa</td><td>Fisher</td><td>17456209</td><td></td></tr><tr><td>18 cm Kleszczyki do próbek proste</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do przycinania 13,5 cm</td><td>Rurka Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>2 ml</td><td>Dowolna</td><td></td> rurka stożkowa NA <td></td></tr><tr><td>15 ml PP</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa PP 50 ml</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Millipore-sigma</td><td>Milli-Q Integral, fluorometr</td> Q-POD <td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Do kwantyfikacji DNA usuniętych próbek</td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Do kwantyfikacji DNA</td></tr><tr><td>96-dołkowy z przezroczystymi płaskimi płytkami dolnymi</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>Genomowe DNA z mikrobiologicznej społeczności makiety B (nawet niskie stężenie) v5.1L, do sekwencjonowania genów 16s rRNA</td><td>Zasoby BEI</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>Klej 8-dołkowe paski do płytek</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej, średnica 3,2 mm Blok testowy</td><td>Next Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>1 ml (płytka do ekstrakcji DNA do Qiagen/MoBio Dneasy Zestaw PowerPlant HTP)</td><td>CoStar</td><td>3959</td><td></td></tr><tr><td>antystatyczny lejek wagowy PP, rozmiar mały do gleby/ryzosfery</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWF1SPK</td><td></td></tr><tr><td>antystatyczny lejek wagowy PP, rozmiar x-mały do korzeni/liści</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Vortex do probówek</td> <td>50 mlScientific Industries</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz (100 ml) i tłuczek</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa mikroszpatułka</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe antystatyczne mikroszpatułki</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>Brązowa torba papierowa 2# (10,95 cm x 6,19 cm x 20 cm)</td><td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 Wirówka do probówki 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka na płytkę 96-dołkową</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik wirówki do probówek 50 ml</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Polimeraza DNA</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Badania mikrobiomu roślin i gleby stają się coraz ważniejsze dla zrozumienia ról mikroorganizmów w wydajności rolnictwa. Celem tego manuskryptu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat szybkiego pobierania próbek gleby, ryzosfery i endosfery z replikowanych prób terenowych oraz analizowania zmian, które mogą wystąpić w zbiorowiskach drobnoustrojów w zależności od rodzaju próbki, traktowania i genotypu rośliny. Eksperyment wykorzystany do zademonstrowania tych metod składa się z odtworzonych poletek polowych zawierających dwie czyste trawy o ciepłym sezonie (Panicum virgatum i Andropogon gerardii) oraz mieszankę traw o niskiej różnorodności (A. gerardii, Sorghastrum nutans i Bouteloua curtipendula). Krótko mówiąc, rośliny są wykopywane, różne korzenie są wycinane i umieszczane w buforze fosforanowym, a następnie wstrząsane w celu zebrania ryzosfery. Korzenie są przenoszone do laboratorium na lodzie i sterylizowane powierzchniowo wybielaczem i etanolem (EtOH). Ryzosfera jest filtrowana i zagęszczana przez wirowanie. Wykopaną ziemię z okolic bryły korzeniowej umieszcza się w plastikowych workach i przenosi do laboratorium, gdzie pobierana jest niewielka ilość gleby do ekstrakcji DNA. DNA jest ekstrahowane z korzeni, gleby i ryzosfery, a następnie amplifikowane starterami dla regionu V4 genu 16S rRNA. Amplikony są sekwencjonowane, a następnie analizowane za pomocą narzędzi bioinformatycznych o otwartym dostępie. Metody te pozwalają naukowcom przetestować, w jaki sposób różnorodność i skład zbiorowisk drobnoustrojów zmienia się w zależności od rodzaju próbki, traktowania i genotypu rośliny. Wykorzystując te metody wraz z modelami statystycznymi, reprezentatywne wyniki pokazują, że istnieją znaczące różnice w zbiorowiskach mikrobiologicznych korzeni, ryzosfery i gleby. Przedstawione tutaj metody zapewniają pełny zestaw kroków do zbierania próbek terenowych, izolowania, ekstrakcji, kwantyfikacji, amplifikacji i sekwencjonowania DNA oraz analizowania różnorodności i składu społeczności drobnoustrojów w replikowanych badaniach terenowych.

Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie pochodzą z obszaru badawczego ustanowionego w 2012 roku na farmie University of Nebraska-Lincoln Agriculture Research Division w pobliżu Mead, NE. Przed rozpoczęciem eksperymentu teren ten był zarządzany w systemie płodozmianu kukurydza-soja. Obszar badań obejmował trzy różne typy gleb, jednak dane analizowano przy założeniu, że wszystkie zmiany w zmierzonych właściwościach gleby wynikały z zastosowanych zabiegów.
Teren badawczy obejmował dwa czyste drzewostany rozsadnika (P. virgatum cv Liberty) i trzęślicy wielkiej (A. gerardii), a także mieszankę traw o niskiej różnorodności, zawierającą trzęślicę wielką, trawę indyjską (S. nutans) oraz trawę sideoats grama 'Butte' (B. curtipendula). Trzy działki traw ciepłosezonowych zostały rozmieszczone w zrandomizowanym schemacie bloków zupełnych z trzykrotnymi powtórzeniami. W obrębie trzech różnych działek traw zastosowano dwie warianty nawożenia azotowego (N), polegające na podaniu 56 (N1) i 112 (N2) kg N ha-1 w postaci mocznika. W momencie pobierania próbek mikrobiomu na koniec sezonu wegetacyjnego gleba zawierała 8,0 ±&#160;1,1 (średnia ±&#160;SD) ppm azotanów w działkach nawożonych dawką 112 kg N ha-1 oraz 6,8 ±&#160;0,7 (średnia + SD) ppm azotanów w działkach nawożonych dawką 56 kg N ha-1. Działki były nawożone raz w roku. Działki traw ciepłosezonowych wyznaczono jako działki główne (8000 m2), a warianty N jako pod-działki (4000 m2). Trzęślica wielka została wysiana jako mieszanka 'Bonanza' i 'Goldmine' w stosunku 50:50, a trawa indyjska jako mieszanka 'Scout' i 'Warrior' w stosunku 50:50. Działki zostały obsiane w 2012 roku, a pierwsza aplikacja azotu N miała miejsce wiosną 2013 roku.
Pobieranie próbek gleby i korzeni przeprowadzono 15 września 2014 roku. Prace opisane poniżej wykonano na polu, na którym zastosowano randomizowany układ dzielonych poletek z trzema powtórzeniami (Rysunek 1). Średnia głębokość sekwencjonowania wszystkich próbek dla endosfery wynosiła: 4871 ± 5711 (średnia ± SD), dla ryzosfery: 40726 ± 14684, dla gleby: 38184 ± 9043. Jednym z największych źródeł zmienności w tych eksperymentach, przy zastosowaniu opisanych metod, jest różnica w społecznościach mikrobiologicznych występujących pomiędzy typami próbek (Rysunek 2). W tym reprezentatywnym zbiorze danych ryzosfera i gleba wydają się być bardziej podobne pod względem składu do siebie nawzajem niż do endosfery&#160;(Rysunek 2A). Jednakże odnotowano również wysoce istotne (p = 0,001) różnice w składzie społeczności mikrobiologicznych pomiędzy ryzosferą a glebą (Rysunek 2B). Całkowita zmienność uwzględniona w tych eksperymentach analizowanych według typu próbki wyniosła 26%.
Analiza różnorodności alfa wykazała, że społeczności mikrobiologiczne w endosferze charakteryzowały się niższą różnorodnością próbek w porównaniu z glebą i ryzosferą (Rysunek 3). Jedyne istotne różnice w różnorodności między gatunkami traw w dowolnym przedziale wystąpiły pomiędzy próbkami endosfery rozsadnicy wielkiej i trawy preriowej, przy czym trawa preriowa wykazywała istotnie wyższą różnorodność gatunkową mikroorganizmów (Rysunek 3). Analiza względnej liczebności (Rysunek 4) wskazuje na dominację Proteobacteria, a następnie Actinobacteria we wszystkich typach próbek. Gleba i ryzosfera są również zdominowane przez Acidobacteria i Chloroflexi, podczas gdy w endosferze&#160;odnotowano większą względną liczebność Bacteriodetes.
W tym eksperymencie rośliny hodowano przy zastosowaniu dwóch różnych dawek nawozu azotowego (N), w związku z czym przeanalizowano dane w celu ustalenia, czy wystąpiły efekty zabiegowe. Efekty zabiegowe odpowiadały za 12% całkowitej zmienności, jednak nie były one istotnie różne, mimo że w ordynacji oba zabiegi wyglądają odmiennie (Rysunek 5). Podkreśla to znaczenie analiz statystycznych dla tego typu zbiorów danych w przeciwieństwie do inspekcji wizualnej lub ocen jakościowych.
Różnice w mikrobiomie tkanek roślinnych i gleby pod wpływem roślin zostały zwizualizowane przy użyciu ograniczonej metody ordynacji. Różnice statystyczne określono za pomocą analizy PERMANOVA, aby sprawdzić, czy konkretne zmienne, takie jak gatunek, prowadzą do istotnych różnic w składzie społeczności mikrobiologicznych pomiędzy próbkami. Gdy wszystkie typy próbek analizowano wspólnie, stwierdzono wysoce istotną różnicę w składzie społeczności mikrobiologicznych wynikającą z gatunku rośliny (Rycina 6). W tym eksperymencie stopień zmienności wyjaśniony przez gatunek rośliny wyniósł 6,7%. Na koniec każdy typ próbki analizowano indywidualnie, aby ustalić, który z nich może odpowiadać za istotny wpływ gatunku rośliny. Wyłącznie w endosferze odnotowano wysoce istotną różnicę (p = 0,001) między składem społeczności mikrobiologicznych różnych gatunków roślin (Rycina 7). W pozostałych typach próbek wpływ gatunku nie był istotny podczas analizy indywidualnej. W endosferze procent zmienności wynikający z gatunku wyniósł 27%, podczas gdy w ryzosferze (18%) i glebie (15%) był on niższy. Podkreśla to dodatkowo znaczenie indywidualnej analizy każdego typu tkanki.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Przykład projektu pola doświadczalnego. Projekt pola doświadczalnego ilustrujący randomizowany układ bloków kompletnych w trzech powtórzeniach na stanowisku badawczym zlokalizowanym w University of Nebraska-Lincoln Eastern Nebraska Research and Extension Center w pobliżu Mead, NE. Pełny opis stanowiska znajduje się w sekcji Wyniki. N1 oznacza niską dawkę azotu (56 kg N ha-1 mocznika), a N2 (112 kg N ha-1 mocznika) wyższą dawkę azotu, które zostały zastosowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Analiza beta-różnorodności porównująca skład mikrobiologiczny w różnych typach próbek, w tym endosfery, ryzosfery i gleby, pobranych z traw wieloletnich w 2014 roku. Analizę przeprowadzono za pomocą skryptu Python w QIIME1.9.1 w celu utworzenia macierzy dystansu Bray-Curtis. Analiza głównych współrzędnych (PCoA) oparta na macierzy dystansu Bray-Curtis została zwizualizowana w programie RStudio. PCoA1 i PCoA2 wskazują odpowiednio pierwszą i drugą największą wariancję wyjaśnioną przez analizę PCoA. Przeprowadzono statystyczną analizę PERMANOVA w celu określenia istotności różnic między typami próbek; wartość p jest wyświetlana w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rysunkach reprezentuje całą społeczność mikrobiologiczną dla danej próbki. (A) Typy próbek z endosfery, ryzosfery i gleby zostały przeanalizowane wspólnie. Wszystkie 87 próbek zostało zrzadkowanych do 486 sekwencji na próbkę. (B) Próbki z ryzosfery i gleby zostały przeanalizowane wspólnie. Wszystkie 59 próbek zostało zrzadkowanych do 8231 sekwencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Analiza różnorodności alfa z wykorzystaniem indeksu Shannona dla każdego gatunku w endosferze, ryzosferze i glebie. Analizę przeprowadzono za pomocą skryptu Python w programie QIIME1.9.1. Rzadkość (rarefakcję) wykonano odpowiednio dla próbek z endosfery, ryzosfery i gleby przy 486, 17154 i 8231 sekwencjach na próbkę. Prostokąty reprezentują 25. i 75. percentyl (pierwszy i trzeci kwartyl). Pozioma linia wewnątrz prostokąta oznacza medianę, a czerwony plus wskazuje średnią. Wąsy pokazują zakres danych z wyłączeniem wartości odstających (przedstawionych jako czarne kropki), które wykraczały poza 1,5-krotność rozstępu międzykwartylowego (n = 6 dla każdej próbki, z wyjątkiem mieszanki sideoats grama, gdzie n = 5). Indeks Shannona dla wszystkich pięciu gatunków w endosferze był niższy niż w ryzosferze i glebie. Do określenia istotności różnic między gatunkami zastosowano nieparametryczny test suma rang Wilcoxona; nad prostokątami zaznaczono jedynie różnice istotne statystycznie między gatunkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Względna liczebność na poziomie typu w endosferze, ryzosferze i glebie. Przebadano próbki w celu porównania liczebności typów mikroorganizmów w różnych rodzajach próbek (n = 29 dla każdego rodzaju próbki). Analizę przeprowadzono za pomocą skryptu Python w programie QIIME1.9.1 na podstawie tabeli OTU. Różne kolory na wykresie kołowym oznaczają typy. Procent wskazuje względną liczebność każdego typu w każdym rodzaju próbki. Informacje o typach zostały przypisane przy użyciu klasyfikatora Ribosomal Database Project (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Analiza z zastosowaniem traktowania jako czynnika ograniczającego pomiędzy wszystkimi typami próbek. Przeprowadzono kanoniczną analizę głównych współrzędnych (CAP), aby ustalić, czy występują różnice w składzie społeczności drobnoustrojów pomiędzy wariantami traktowania. Dla każdego traktowania azotem (N), n = 42 dla N1 (56 kg N ha-1) oraz n = 45 dla N2 (112 kg N ha-1). Macierz niezależności Braya-Curtisa wygenerowano za pomocą skryptu python w QIIME1.9.1. Analizę CAP opartą na macierzy niezależności Braya-Curtisa wykonano w RStudio, przyjmując traktowanie jako czynnik ograniczający. Przeprowadzono analizę PERMANOVA, aby określić, czy różnice między wariantami traktowania były istotne; wartość p przedstawiono w prawym górnym rogu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg" /> 
Rycina 6: Analiza z gatunkiem rośliny jako czynnikiem ograniczającym pomiędzy wszystkimi typami próbek. Przeprowadzono analizę w celu ustalenia, czy występują różnice w składzie społeczności drobnoustrojów pomiędzy gatunkami roślin we wszystkich typach próbek. Ordynacja głównych współrzędnych oraz analiza CAP dla wszystkich typów próbek (endosfera, ryzosfera i gleba) zostały wykonane przy użyciu macierzy niepodobieństwa Bray-Curtis. Macierz niepodobieństwa Bray-Curtis została wygenerowana za pomocą skryptu Python w programie QIIME1.9.1. Analizę CAP opartą na macierzy niepodobieństwa Bray-Curtis przeprowadzono w programie RStudio, przyjmując gatunek rośliny jako czynnik ograniczający. Przeprowadzono statystyczną analizę PERMANOVA w celu określenia istotności różnic pomiędzy gatunkami roślin; wartość P jest przedstawiona w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rycinach reprezentuje całą społeczność drobnoustrojów dla danej próbki. n = 18 dla każdego gatunku we wszystkich typach próbek, z wyjątkiem n = 15 dla mieszanki sideoats grama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg" /> 
Rysunek 7: Przykład analizy CAP z wykorzystaniem gatunków jako czynnika ograniczającego dla każdego typu próbki z osobna. Ordynacja głównych współrzędnych i analiza CAP dla każdego typu próbki (endosfera, ryzosfera i gleba) z wykorzystaniem macierzy niezróżnicowania Bray-Curtis. Każdy typ próbki został poddany rzedukcji (rarefakcji) do odpowiednio 486, 17154 i 8231 odczytów na próbkę w endosferze, ryzosferze i glebie. Jako czynnik ograniczający ordynację wykorzystano gatunki. Przeprowadzono analizę statystyczną PERMANOVA w celu określenia istotności różnic między gatunkami roślin w każdym typie próbki, a wartość p przedstawiono w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rysunku reprezentuje całą społeczność mikrobiologiczną dla danej próbki. Wielkość próby wynosi n = 29 dla każdego typu próbki, n = 6 dla każdego gatunku rośliny w każdym typie próbki, z wyjątkiem mieszanki sideoats grama (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer.

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiomu glebowego, ryzosfery i endosfery korzeni, takie jak to, jak zmienia się różnorodność społeczności drobnoustrojów w odpowiedzi na rodzaj próbki, traktowanie i genotyp rośliny. Główną zaletą tej techniki jest to, że doskonale nadaje się do eksperymentów terenowych, które wymagają dużej liczby próbek i replikacji. Procedurę zademonstruję ja i Stephanie Futrell, studentka i technik badawczy z mojego laboratorium.Aby rozpocząć protokół, oznacz patelnię i wiadro karteczką samoprzylepną ze szczegółami próbki rośliny. Zanieś oznakowane wiadro na działkę i pozostaw umywalkę na ustalonym stanowisku pracy w terenie. Losowo wybierz i zbierz dwie rośliny na działkę z różnych obszarów na działce.Następnie przebij glebę łopatą na głębokość 30 centymetrów, aby przeciąć dowolny z bocznych korzeni utrzymujących roślinę w glebie. Wykop korzenie rośliny, wykorzystując łopatę i umieść bryłę korzeniową w oznaczonym wiadrze. Przynieś łyżkę z powrotem na stanowisko pracy w terenie.Potrząśnij korzeniami i użyj łopaty lub ręcznego rumpla, aby usunąć ziemię z korzeni. Załóż rękawice i umieść korzenie w pobliżu stacji przetwarzania. Po potrząśnięciu korzeniami wymieszaj ziemię na patelni i rozbij wszelkie grudki gleby za pomocą ręcznej glebogryzarki.Umieść próbkę gleby, która jest wolna od zanieczyszczeń, w oznakowanej torbie do przechowywania na suwak o wymiarach 17,7 na 19,5 centymetra i umieść ją na lodzie. Sterylizuj nożyczki do przycinania w 70% etanolu. Użyj sterylnych nożyczek, aby wyciąć różne korzenie, około czterech do sześciu korzeni na roślinę, a każdy korzeń ma około dziewięciu do 12 centymetrów długości.Umieść wycięte korzenie w oznakowanej 50-mililitrowej probówce zawierającej 35 mililitrów autoklawowanego buforu fosforanowego ze środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak Silwet L-77. Potrząsaj rurkami przez dwie minuty, aby uwolnić ryzosferę z powierzchni korzeni. Popraw wstrząsy za pomocą generatora i wirownika.Za pomocą kleszczy wysterylizowanych w 70% etanolu usuń korzenie z tuby, osusz je krótko na ręcznikach papierowych i umieść w nowej, oznakowanej, 50-mililitrowej tubce. Umieść na lodzie zarówno probówkę zawierającą ryzosferę, jak i rurkę zawierającą korzenie. Dodaj około 35 mililitrów 50% wybielacza plus 0,01% Tween 20 do 50-mililitrowych tubek z korzeniami zebranymi na polu.Wiruj lub potrząsaj probówkami przez 30 do 60 sekund. Odlej wybielacz, dodaj 35 mililitrów 70% etanolu i wiruj lub potrząsaj korzeniami przez kolejne 30 do 60 sekund. Po wstrząśnięciu odlej 70% etanol i dodaj 35 mililitrów sterylnej, ultraczystej wody i wiruj lub wstrząsaj próbką przez jedną minutę.Powtórz etap płukania wodą jeszcze dwa razy, aby korzeń został poddany łącznie trzem płukaniom sterylnej, ultraczystej wody. Osusz korzenie na suchych, czystych ręcznikach papierowych i użyj czystego ręcznika papierowego do każdej próbki. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek do przycinania pokrój korzenie na około pięciomilimetrowe kawałki i umieść ścięte korzenie w czystej, oznakowanej, stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, a następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki.Potrząsaj 50-mililitrowymi probówkami zawierającymi próbki ryzosfery z pola przez 20 do 30 sekund, aby ponownie zawiesić całą próbkę. Używając sterylnego sitka o siatkowej siatce 100 mikronów, przefiltruj ponownie zawieszoną próbkę do nowej 50-mililitrowej probówki. Następnie odwirować probówki z ciśnieniem 3 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Natychmiast odlewać i wyrzucić supernatant. Umieść granulki ryzosfery w 50-mililitrowych rurkach na lodzie. Następnie dodaj 1,5 mililitra sterylnego buforu fosforanowego bez środka powierzchniowo czynnego do granulek ryzosfery i odwiruj je, aby ponownie zawiesić próbkę.Odpipetuj zawieszoną ciecz do czystej, oznakowanej, dwumililitrowej probówki do mikrofugi. Wiruj probówki z prędkością 15 871 razy g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Natychmiast odlej sklarowany sklarent i opróżnij probówki na czystych ręcznikach papierowych.Przechowuj granulki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Za pomocą sterylnej metalowej szpatułki napełnij czystą, oznakowaną, dwumililitrową probówkę około trzema gramami gleby do ekstrakcji DNA i unikaj małych kawałków korzeni i zanieczyszczeń. Opłucz metalową szpatułkę w 70% etanolu między każdą próbką.Przechowuj tę próbkę gleby w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W czystej patelni do mycia opróżnij worek z ziemią na ułożone w stos sita z większym sitkiem na mniejszym sicie i ręcznie przesiej ziemię przez oba sita. Użyj szczotki, aby dokładnie wyczyścić sita między próbkami.Odłóż od 100 do 125 gramów przesianej gleby w torbie zapinanej na zamek błyskawiczny o wymiarach 17,7 na 19,5 centymetra do przyszłej analizy fizykochemicznej i tekstury gleby. Umieść worki z ziemią w temperaturze czterech stopni Celsjusza do krótkotrwałego przechowywania. Następnie wlej ciekły azot do plastikowej zlewki za pomocą czystych szpatułek i w czystym moździerzu.Zamrożoną chusteczkę umieszczamy w moździerzu i mielimy ją tłuczkiem na drobny proszek. Stale dodawaj ciekły azot podczas mielenia, aby utrzymać próbki w stanie zamrożonym. Za pomocą szpatułki przenieś zmieloną tkankę do czystej, oznakowanej probówki o pojemności dwóch mililitrów, a następnie przechowuj tkankę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Przetrzyj miejsce pracy 70% etanolem i 1% domowym wybielaczem. Wyjmij próbki gleby z magazynu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź je w wiadrze z lodem. Zdejmij pokrywę maty uszczelniającej z 96-dołkowej płytki ekstrakcyjnej i umieść ją między dwiema chusteczkami papierowymi, aby utrzymać ją w czystości, gdy nie jest używana.Przykryj 12 kolumn płytki samoprzylepnymi 8-dołkowymi paskami PCR, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wytaruj sterylny, mały lejek wagowy na wadze i zważ od 200 do 250 miligramów gleby. Ostrożnie podnieś pasek samoprzylepny do góry, umieść szyjkę napełnionego lejka wagowego w odpowiedniej studzience i delikatnie wprowadź próbkę gleby do odpowiedniej studzienki.Wymień pasek samoprzylepny, aby zakryć studnię. Powtórz ten proces dla każdej studzienki, używając nowego sterylnego lejka dla każdej próbki. Załóż pokrywę maty uszczelniającej na płytkę ekstrakcyjną i przechowuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do ekstrakcji DNA.Wyjmij próbki ryzosfery z magazynu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź w wiadrze na lód. Przygotuj płytkę do ekstrakcji DNA, jak opisano w poprzednim rozdziale. Umieść czystą chusteczkę papierową na wadze, a następnie wytaruj sterylną metalową szpatułkę na wadze.Za pomocą szpatułki ostrożnie wyjąć część osadu ryzosfery z probówki na próbkę. Odważyć od 200 do 250 miligramów próbki ryzosfery. Ostrożnie podnieś pasek samoprzylepny, aby odsłonić pierwszą głębinę płytki ekstrakcyjnej.Ustaw napełnioną szpatułkę w studzience i zeskrob materiał ryzosfery do odpowiedniej studzienki sterylną wykałaczką. Opłucz metalową szpatułkę w wodzie, a następnie 70% etanolu między próbkami. Na koniec powtórz ten proces dla każdego dołka płytki, aż płytka zostanie napełniona, pozostawiając jedną studzienkę pustą jako ślepą próbę ekstrakcyjną.W tym reprezentatywnym zestawie danych stwierdzono bardzo istotne różnice między typami próbek, a ryzosfera i gleba wydają się być bardziej podobne pod względem składu do siebie niż korzeń. Dalsza analiza pokazuje, że istniały również bardzo istotne różnice w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych między ryzosferą a glebą. Analiza różnorodności alfa pokazuje, że zbiorowiska drobnoustrojów w endosferze były niższe niż zbiorowiska w glebie i ryzosferze.Jedyna znacząca różnica w różnorodności między gatunkami traw występowała między próbkami endosfery dużej niebieskiej łodygi i proso rózgowatego. Analiza względnej liczebności podkreśla dominację Proteobacteria, a następnie Actinobacteria we wszystkich typach próbek. Gleba i ryzosfera są zdominowane przez Acidobacteria i Chloroflexi, podczas gdy korzenie miały większą względną obfitość Bacteriodetes.Analiza przeprowadzona w ramach projektu PERMANOVA wszystkich typów próbek wykazała bardzo istotną różnicę w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych ze względu na gatunki roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać szereg kroków, które można wykorzystać w badaniu mikrobiomów gleby, endosfery i ryzosfery. Chcielibyśmy podziękować EPSCoR w Nebrasce i Narodowej Fundacji Nauki EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 za częściowe sfinansowanie tego filmu edukacyjnego.

isolation-analysis-microbial-communities-soil-rhizosphere-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Prezentujemy metody oceny, jak ryzyko drapieżnictwa może zmienić jakość chemiczną ofiar roślinożerców, wywołując zmiany w diecie, aby sprostać wymaganiom zwiększonego stresu, oraz jak rozkład zwłok tych zestresowanych roślinożerców spowalnia późniejszy rozkład ściółki roślinnej przez mikroby glebowe.

Powiązanie ryzyka drapieżnictwa, stresu fizjologicznego roślinożerców i mikrobiologicznego rozkładu ściółki roślinnej

Zrozumienie roli heterogeniczności środowiska we współistnieniu gatunków zazwyczaj skupiało się na typach heterogeniczności, które są zewnętrzne w stosunku do składu gatunkowego społeczności. Przedstawiamy nowatorskie szczegółowe metody tworzenia zabiegów na rzecz niejednorodności gleby przy użyciu gleb poddanych warunkowaniu zwrotnemu roślina-gleba lub heterogeniczności nieodłącznie związanej ze składem zbiorowiska.

Eksperymentalny protokół manipulowania heterogenicznością gleby wywołaną przez rośliny

Artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami.

Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Opisujemy protokół pobierania próbek, konserwacji i sekcji nienaruszonych korzeni i otaczającej je gleby ryzosfery ze środowisk podmokłych przy użyciu ryżu (Oryza sativa L.) jako gatunku modelowego. Po zakonserwowaniu próbka może być analizowana przy użyciu technik obrazowania elementarnego, takich jak obrazowanie specjacji chemicznej za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej (XRF).

Metoda ochrony korzeni i ryzosfer mokradeł do obrazowania pierwiastków

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne.

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

Tutaj prezentujemy badanie przeprowadzone w iDiv Ecotron, naziemnych komorach mezokosmicznych z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi nad i pod ziemią, w celu zbadania niezależnego i interaktywnego wpływu historii roślin i historii gleby na funkcjonowanie ekosystemu zbiorowisk trawiastych wzdłuż gradientu różnorodności roślin.

JenaTron - eksperymentalne podejście do badania wpływu historii roślin i historii gleby na funkcjonowanie ekosystemów użytków zielonych

Poznaj metody izolacji i analizy mikrobiomów gleby, ryzosfery i endosfery korzeni w badaniach polowych z trawami wieloletnimi. Technika ta umożliwia standaryzację badań ekologii mikroorganizmów.

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Przeglądaj więcej filmów