Różnica potencjału nosowego w celu ilościowego określenia transnabłonkowego transportu jonów u myszy
4 lipca 2018
Tutaj prezentujemy protokół pomiaru różnicy potencjału nosowego u myszy. Test określa ilościowo funkcję transbłonowych transporterów jonów, takich jak mukowiscydoza, transbłonowy regulator przewodnictwa i nabłonkowy kanał sodowy. Cenna jest ocena skuteczności nowych terapii mukowiscydozy.
Różnica potencjału nosowego jest cenną metodą charakterystyki fenotypu myszy transgenicznych modelujących mukowiscydozę. Pozwala to na badanie skuteczności nowych rodzajów terapii mukowiscydozy. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zapewnia ona wiarygodne pomiary u myszy rozmnażających się w sposób ciągły.
Zmniejsza to śmiertelność z tym związaną i pozwala na powtórzenie badania na tym samym zwierzęciu. Aby przygotować cewnik do nosa o podwójnym przeźrnicy, trzymaj środek rurki polietylenowej o długości 20 centymetrów w płomieniu przez około 10 do 15 sekund, aż będzie wystarczająco miękki, aby można go było ciągnąć. Następnie rozsuń oba końce, aby uzyskać bardzo cienką rurkę kapilarną o długości około 15 centymetrów i zewnętrznej średnicy 0,1 milimetra dla sondy nosowej.
Następnie oczyść i odtłuść dwie kapilary czystym etanolem. Połącz je taśmą i sklej ze sobą za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Odetnij nadmiar długości sond żyletką, aby uzyskać cewnik o podwójnym świetle o długości około ośmiu centymetrów.
Następnie wstrzyknij wodę przez oba lumeny, aby sprawdzić, czy są przepuszczalne, i zaznacz znak w odległości pięciu milimetrów od końcówki. Następnie przygotuj mieszankę śmietany, mieszając krem elektrolitowy i nasycony trzymolowy roztwór potasu w stosunku jeden do jednego, unikając tworzenia się drobnych pęcherzyków powietrza. W konfiguracji doświadczalnej, aby zapobiec hipotermii w trakcie i po badaniu, należy użyć dwóch poduszek grzewczych, jednej dla stanowiska pomiarowego, a drugiej dla pudełka, w którym zwierzę zostanie umieszczone w celu odzyskania zdrowia po zakończeniu badania.
Włącz komputer, który jest podłączony do pamięci danych o wysokiej impedancji wejściowej i woltomierzu o wysokiej rozdzielczości. Następnie otwórz oprogramowanie do przechwytywania danych. Podłącz elektrody do woltomierza.
Zanurz końcówki elektrod razem w mieszance śmietany. Sprawdź początkową wartość przesunięcia elektrody i odrzuć elektrody, jeśli wartość jest większa niż plus lub minus dwa miliwolty. Następnie włącz pompę perystaltyczną i włóż rurkę pompy do światła perfującego cewnika nosowego.
Napełnij jedno światło cewnika do nosa mieszanką kremów elektrolitowych przez końcówkę pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Dostosuj cewnik do łącznika rurki silikonowej i napełnij łącznik mieszanką śmietany. Następnie włóż elektrodę dodatnią do złącza.
Sprawdź wartość przesunięcia mostka elektrody pomiarowej i odrzuć mostki, jeśli wartość jest większa niż plus lub minus dwa miliwolty. Następnie podłączyć proksymalny wylot rurki pompy do fiolki zawierającej wybrany roztwór do perfuzji donosowej. Następnie podłącz dystalny wylot rurki pompy do światła perfuzyjnego cewnika nosowego.
Następnie napełnij drugie światło cewnika nosowego świeżym roztworem A1. Zanurzyć końcówkę cewnika donosowego w fiolce zawierającej roztwór A. Odwrócić kierunek pompy perystaltycznej, aby napełnić cewnik donosowy na długość odpowiadającą 10 sekundom perfuzji. Następnie złóż arkusz tkanki wchłaniającej, aby uzyskać poduszkę o szerokości trzech centymetrów, która posłuży jako podparcie dla głowy myszy. Przykryj poduszkę grzewczą arkuszem chusteczki chłonnej.
Następnie połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej i przyklej kończyny i ogon do podkładki. Następnie wprowadzić referencyjny cewnik dożylny w przestrzeń podskórną kończyny tylnej. Wyjąć igłę i dopasować do łącznika rurki silikonowej.
Napełnij cewnik i łącznik mieszanką kremu. Następnie podłącz dodatnią elektrodę pomiarową do cewnika nosowego, a ujemną elektrodę odniesienia do cewnika wprowadzonego w przestrzeń podskórną w tylnej kończynie zwierzęcia. Następnie przymocuj cewnik i elektrodę taśmą zgodnie z wymaganiami, aby zapobiec przemieszczeniu.
Po umieszczeniu elektrody referencyjnej i mostków ponownie sprawdź wartość przesunięcia mostka elektrody pomiarowej, zanurzając końcówkę cewnika nosowego w mieszance kremu do elektrod wewnątrz łącznika cewnika dożylnego. Zapisz stabilną, końcową wartość przesunięcia. Teraz przymocuj uszy myszy taśmą do poduszki grzewczej w wolnej przestrzeni między dwoma kawałkami tkanki chłonnej.
Napraw jaskrawość bez dotykania oczu. Aby wchłonąć płyn z jamy ustnej, przesuń język na boki i włóż do jamy ustnej spiczasty z bibuły filtracyjnej na około jeden centymetr. Aby wchłonąć płyn wypływający z perfundowanego nozdrza, umieść drugi kawałek bibuły filtracyjnej w miejscu nosa.
Sprawdź dodatnią wartość kontrolną potencjału nabłonkowego, umieszczając końcówkę cewnika nosowego we wnętrzu jamy ustnej. Trzymając go cienkimi kleszkami i przy dobrym bezpośrednim oświetleniu, delikatnie wprowadź cewnik do nosa do jednego nozdrza, w odległości do czterech do sześciu milimetrów od czubka nosa. Pięć minut po wstrzyknięciu leków znieczulających delikatnie przechyl poduszkę grzewczą o około 30 stopni, kierując głowę zwierzęcia w dół.
Monitoruj maksymalną wartość podstawowego PD. Gdy ustabilizuje się przez 30 sekund, rozpocznij perfuzję błony śluzowej nosa z prędkością 10 mikrolitrów na minutę za pomocą czterech kolejno buforowanych roztworów. Utrwalaj pierwszy roztwór przez 10 sekund, a każdy następny roztwór przez pięć minut lub do momentu osiągnięcia stabilnego napięcia.
Przestań perfuzjować Forskolina, gdy przejściowa odpowiedź Forskolina zaczyna spadać. Po ocenie zwolnij mysz z poduszki grzewczej. Podaj go z mieszanką antagonistów znieczulających i przenieś do pojemnika regeneracyjnego z poduszką grzewczą aż do pełnego wyzdrowienia.
Poniżej znajdują się reprezentatywne ślady PD w nosie od homozygotycznej, normalnej myszy i myszy homozygotycznej pod względem mutacji CFTR z delecją F508, wraz z indywidualnymi wartościami uzyskanymi dla parametrów PD w nosie. Odpowiedź amilorydowa to różnica między wartościami PD w nosie na końcu i na początku perfuzji błony śluzowej nosa podstawowym buforowanym roztworem soli zawierającym amiloryd. Odpowiedź wolna od chlorków to różnica między wartościami PD w nosie na końcu i na początku perfuzji błony śluzowej nosa bezchlorkowym buforowanym roztworem soli z dodatkiem amilorydu.
Odpowiedź forskoliny to różnica między wartościami PD w nosie na końcu i na początku perfuzji błony śluzowej nosa z roztworem soli wolnej od chlorków, plus forskolina i amiloryd. Całkowita odpowiedź chlorkowa jest sumą dwóch ostatnich parametrów uzyskanych przy zerowej perfuzji chlorków. Projekt może być wykorzystany do zbadania, zapewnienia transportu uciekinierów w myszy, ale także w bachorze, w modelu mukowiscydozy dużej i fretki.
I defekterzy transportu sodu w modelu myszy eunucha. Wszystkie transportery można badać, przyjmując protokół. Praca w jamie nosowej gryzoni jest niezwykle delikatna ze względu na istotną ścianę bodźców czuciowych z okolicy nosa twarzy.
Odpowiednie dawkowanie znieczulenia jest szczególnie trudne podczas operacji w jamie nosowej myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pomiaru różnicy potencjałów nosowych u myszy, który pozwala na ilościową ocenę funkcji transbłonowych transporterów jonowych. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w ocenie nowych terapii mukowiscydozy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Modele transgeniczne
Wprowadzenie
- Pomiar różnicy potencjałów w jamie nosowej jest metodą charakteryzacji myszy transgenicznych.
- Pomaga on w ocenie skuteczności nowych terapii mukowiscydozy.
- Technika ta jest korzystna w przypadku myszy w ciągłej hodowli.
- Minimalizuje ona związaną z tym śmiertelność i umożliwia wielokrotne testy u tego samego zwierzęcia.
Cel badania
- Pomiar różnicy potencjałów nosowych u myszy.
- Ocena funkcji transporterów jonowych, takich jak CFTR i ENaC.
- Ocena skuteczności nowych metod leczenia mukowiscydozy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie dwulumenowego cewnika nosowego.
- Pomiar różnicy potencjałów nosowych u myszy transgenicznych.
- Ocena funkcji transporterów jonowych.
- Ocena skuteczności terapii.
Główne wyniki
- Niezawodne pomiary uzyskane od myszy w ciągłej hodowli.
- Zmniejszenie śmiertelności związanej z procedurami testowymi.
- Możliwość powtarzania testów u tego samego zwierzęcia.
- Wgląd w skuteczność nowych terapii mukowiscydozy.
Wnioski
- Pomiar różnicy potencjałów nosowych jest cenną metodą w badaniach nad mukowiscydozą.
- Protokół ten zwiększa wiarygodność pomiarów w modelach mysich.
- Technika ta wspiera opracowywanie nowych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar różnicy potencjałów nosowych (NPD) u myszy zapewnia funkcjonalny odczyt transepitelowego transportu jonów, umożliwiając przedkliniczną ocenę terapeutyków stosowanych w mukowiscydozie (CF). Poprzez ilościowe określenie aktywności CFTR i ENaC in vivo, metoda ta wspomaga walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Powtarzalne testy u tego samego zwierzęcia zmniejszają zmienność i zwiększają pewność prognostyczną przy podejmowaniu decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w rozwoju terapii CF.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar funkcjonalnego transportu chlorków i sodu w modelach mysich z mukowiscydozą (CF).
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka modulatorów CFTR poprzez bezpośrednie fenotypowanie transportu jonów.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez rozróżnienie fenotypów CF od fenotypów typu dzikiego na podstawie odpowiedzi na amilorid, brak chlorków oraz forskolinę.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do standaryzacji analiz z wykorzystaniem dwuluminowych cewników nosowych i kontrolowanej perfuzji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki stabilnej weryfikacji przesunięcia potencjału elektrod oraz spójnych protokołów perfuzji roztworów.
- Wartość naukowa: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez pomiar odpowiedzi transporterów jonowych na roztwory amiloridu, roztwory wolne od chlorków oraz forskolina.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Utrzymuje istotność w kontekście choroby poprzez ilościowe określenie defektów funkcjonalnych transporterów CFTR i ENaC u myszy oddychających spontanicznie.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość translacyjną, umożliwiając przeprowadzenie wielu testów u jednego zwierzęcia, co redukuje zmienność międzyosobniczą.
- Wartość naukowa: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, zapewniając ilościowe zapisy PD, które korelują z genotypem.
Integracja potoków przetwarzania i przepływu pracy
Metoda NPD integruje się z procesem odkrywania leków, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, dostarczając funkcjonalnych danych dotyczących transportu jonów, które służą do oceny skuteczności terapeutycznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez pomiar podstawowych i stymulowanych różnic potencjałów nosowych u myszy transgenicznych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanej perfuzji roztworów buforowych i stabilnym odczytom napięcia.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (odpowiedź na amiloryd, odpowiedź bez chlorków, odpowiedź na forskolinę, całkowitą odpowiedź chlorkową) w celu porównania warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie wielokrotnych testów u tego samego zwierzęcia w celu monitorowania podłużnych efektów leczenia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalna metoda charakterystyki modelu CF w wielu iteracjach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez ilościowe fenotypowanie transportu jonów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki przygotowaniu cewnika, kalibracji elektrod oraz kontroli perfuzji.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w ocenie skuteczności modulatorów CFTR i ENaC.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, oparta na korekcji funkcjonalnego defektu transportu w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wiedza specjalistyczna w zakresie znieczulania gryzoni oraz technik kanulacji nosa.
- Instrumentacja obejmująca woltomierz o wysokiej impedancji, pompę perystaltyczną oraz podkładki grzewcze z regulacją temperatury.
- Standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania roztworów, weryfikacji przesunięcia elektrody oraz czasu perfuzji.
- Kwestie adaptacyjne dla różnych szczepów gryzoni i modeli mutacji CFTR.
- Ograniczenia praktyczne obejmują precyzję chirurgiczną przy dostępie do jamy nosowej oraz optymalizację głębokości znieczulenia w celu zapobiegania aspiracji oskrzelowej.
