Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Ta technika może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii. Na przykład określenie, w jaki sposób proporcje podzbioru monocytów lub ekspresja różnych markerów są zmieniane w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są bliskie swojemu rodzimemu stanowi oraz że stosowane są jasne instrukcje i uzasadnienie, aby zapewnić ustandaryzowaną metodę bramkowania.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć problemy, ponieważ wiele prac nie daje jasnych instrukcji dotyczących sposobu bramkowania komórek. Rozpocznij ten protokół od pobrania próbek krwi i oznaczenia liczby białych krwinek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozcieńczyć krew solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby dostosować stężenie do około 5 milionów białych krwinek na mililitr.

Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki głównej dla liczby probówek, łącząc krew, anty CD14-V450, anty CD16-APC i anty HLA-DR-PerCP. Odwirować i odpipetować 51,9 mikrolitrów mieszanki do każdej probówki. Dodaj przeciwciała markerowe M1 i M2 znakowane PE, a także markery limfocytów T, limfocytów B, neutrofili i komórek NK do odpowiednich probówek.

Wirować i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Teraz dodaj 250 mikrolitrów połączonego roztworu do lizy czerwonych krwinek i utrwalania białych krwinek i natychmiast delikatnie wymieszaj mieszaninę. Inkubuj zwirowaną mieszaninę przez 10 minut w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po 10 minutach dodaj 250 mikrolitrów PBS i odwiruj komórki w temperaturze 260 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach 1% formaldehydu. Przechowuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem do czasu przeprowadzenia analizy.

Cytometrię przepływową należy wykonać w ciągu 48 godzin od przygotowania próbki. Na początek sprawdź dziennik cytometru przepływowego, aby upewnić się, że personel placówki przeprowadził kontrolę jakości. Aby skonfigurować eksperyment z cytometrią przepływową, kliknij nowy eksperyment, a następnie nową próbkę i nową probówkę, aby dodać probówki.

Wybierz wykresy dwuwymiarowe, klikając ikonę i użyj menu rozwijanych, aby wybrać parametry dostępu. Upewnij się, że zawiera wykres CD16/CD14 i wykres wyświetlający detektor wraz z czasem, aby monitorować akwizycję. Włóż rurkę i kliknij, nabierz.

Sprawdź napięcie przyrządutagustawienia, upewniając się, że sygnały detektora nie są poza skalą. Obserwuj komórki wpadające do bramki monocytów na wykresie CD14/CD16. Ustaw próg nagrywania na 5 000 zdarzeń dla klasycznej bramki monocytów i kliknij rekord.

Kontynuuj rejestrowanie danych dla pozostałych probówek. Po zarejestrowaniu danych dla wszystkich rur należy wyeksportować dane dotyczące przepływu jako pliki fcs do analizy. Aby wykonać bramkowanie monocytów, otwórz pliki w oprogramowaniu do analizy, kliknij dwukrotnie nazwę rurki i wybierz parametry z menu rozwijanych, aby wyświetlić komórki na wykresie wysokości rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem wysokości rozproszenia do przodu.

Utwórz bramkę wykluczenia dubletu, klikając ikonę narzędzia bramki wielokątnej i otaczając komórki. Wybierz bramkowane komórki, klikając dwukrotnie region bramkowany. W nowym polu wyświetlania dostosuj parametry menu rozwijanego, aby wyświetlić komórki na wykresie obszaru punktowego do przodu i na wykresie obszaru punktowego z boku.

Kliknij ikonę prostokątnej bramki i obficie wybierz populację monocytów na podstawie właściwości rozpraszania do przodu i z boku, aby wykluczyć większość limfocytów, komórek NK i granulocytów. Wybierz bramkowane komórki i ponownie wyświetl je na wykresie CD14/CD16, wybierając parametry za pomocą menu rozwijanych. Kliknij na bramkę wielokąta, aby wybrać monocyty na podstawie ich charakterystycznego, odwróconego kształtu l.

Jeśli populacja nieklasyczna nie różni się od komórek po jej lewej stronie, zanieczyszczenie jest prawdopodobne i powinno zostać zbadane. Wybierz bramkowane komórki i wyświetl monocyty na wykresie CD/16 HLA-DR, korzystając z menu rozwijanych w celu wybrania parametrów. Kliknij bramkę wielokątną, aby wybrać komórki HLA-DR dodatnie i wykluczyć wszelkie pozostałe komórki NK i neutrofile.

Wybierz bramkowane komórki i wyświetl dodatnie komórki HLA-DR na wykresie CD14/HLA-DR za pomocą menu rozwijanych, aby wybrać parametry. Kliknij bramkę wielokątną i narysuj bramkę, aby wykluczyć komórki HLA-DR high/CD14 low B. Wybierz bramkowane komórki i użyj menu rozwijanych, aby wyświetlić je na wykresie CD16/CD14.

Z opcji wykresu wybierz wykres zebry, który umożliwi narysowanie bramek podzbioru monocytów, w celu określenia proporcji podzbioru. Teraz kliknij ikonę prostokątnej bramki i wybierz klasyczne monocyty, rysując przybliżoną prostokątną bramkę wokół populacji klasycznych monocytów CD14 wysokich/CD16 niskich. W obszarze wyświetlacz wybierz, pokaż mediany, aby wyświetlić medianę intensywności fluorescencji dla klasycznych monocytów.

Dostosuj bramkę w taki sposób, aby populacja miała równy rozkład od mediany po lewej i po prawej stronie i obejmowała wszystkie komórki po lewej stronie. Wybierz populację pośrednią, rysując prostokątną bramkę, która obejmuje komórki po prawej stronie klasycznej bramki. Dostosuj dolną część bramki, aby wykluczyć nieklasyczne komórki, wyrównując bramkę z dolną częścią koncentrycznych okręgów, które znajdują się całkowicie w klasycznej bramce monocytów.

Bramkuje nieklasyczny podzbiór, rysując prostokątne pole w dół od dolnej krawędzi podzbioru pośredniego, zaznaczając wszystkie komórki do dołu populacji. W obszarze wyświetlacz wybierz opcję pokaż częstotliwości bramki, aby określić procent każdego podzbioru monocytów. Na koniec wybierz komórki z każdego podzbioru monocytów.

Zmień parametry listy rozwijanej, aby utworzyć histogram dla każdego podzbioru monocytów, wyświetlający każdy marker. Następnie oblicz stopień wyrażenia, używając średniej mediany lub geometrycznej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazano tutaj pomyślnie bramkowane populacje monocytów.

A proporcje są zgodne z tymi w literaturze. Proporcje dla tej próby obliczono następująco: 88,1% klasyczne, 4,33% pośrednie i 7,49% nieklasyczne. Oceniając względne położenie innych populacji, jasne jest, że limfocyty T i neutrofile pokazane tutaj na niebiesko, podążają daleko poza monocytem, w kształcie odwróconej litery l, na wykresie CD16 / CD14.

Jednak zarówno komórki NK jak i populacje limfocytów B, pokazane tutaj na niebiesko, pokrywały się z nieklasyczną populacją monocytów. Mapy cieplne potwierdzające, że typy zanieczyszczających komórek zostały usunięte, są pokazane tutaj. Komórki NK zostały bramkowane przez krok HLA-DR CD16, podczas gdy komórki B zostały bramkowane przez etap HLA-DR CD / 14.

Ekspresja markerów M1 i M2 w kolorze niebieskim, w stosunku do ich kontrolnych izotypów w kolorze czerwonym, jest pokazana tutaj. CD120b, marker M1, wykazuje wyraźne przesunięcie w stosunku do kontroli izotypowej dla wszystkich podzbiorów monocytów. Dotyczy to również CD93, markera M2, przy czym ekspresja jest wyższa w wersji klasycznej, umiarkowana w półproduktach i niska w nieklasycznych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby upewnić się, że zanieczyszczające komórki są bramkowane, ponieważ w przeciwnym razie mogą one przyczynić się do ilościowej ekspresji. Po tej procedurze można zbadać inne markery. Aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, jak zmienia się ekspresja markerów monocytów w chorobie.

Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią i formaldehydem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i używanie kaptura chroniącego przed zagrożeniem biologicznym.