Name: Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę charakterystyki podzbiorów monocytów ludzkich za pomocą cytometrii przepływowej krwi pełnej. Protokół obejmuje gating populacji i ocenę ekspresji markerów powierzchniowych M1 oraz M2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cytometria przepływowa została wykonana w Głównym Ośrodku Cytometrii Przepływowej, który jest wspierany przez Westmead Institute for Medical Research, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales oraz National Health and Medical Research Council. Badanie to było wspierane przez Fundusz Badań i Edukacji w Dziedzinie Chemii Klinicznej.

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych na Ludziach (HREC) WSLHD (zatwierdzenie AU RED HREC/15/WMEAD/289).
1. Przygotowanie próbki do cytometrii przepływu krwi pełnej
UWAGA: Ponieważ ludzka krew jest potencjalnie zakaźna, próbka powinna być wykonana w kapturze chroniącym przed zagrożeniem biologicznym.
<ol>
	<li>Zbierz próbki krwi od uczestników do 3 ml probówek z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).</li>
	<li>Określ liczbę białych krwinek (WBC) za pomocą analizatora hematologicznego lub hemocytometru.</li>
	<li>Rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (pH ~7,4) w celu dostosowania stężenia do ~5 x 106 WBC/ml.</li>
	<li>Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla liczby probówek (np. dla 14 probówek przygotuj 16 razy mieszankę główną), łącząc 16 razy objętości 50 μl krwi, 0,75 μl anty CD14-V450, 0,5 μl anty CD16-APC i 0,625 μL anty HLA-DR-PerCP. Odwirować i odpipetować 51,9 μl mieszanki do każdej probówki (Tabela 1). 
	UWAGA: Przeciwciała należy miareczkować w celu określenia optymalnych stężeń barwienia dla zastosowanych przeciwciał fluorescencyjnych.</li>
	<li>Dodać markery powierzchniowe (M1 i M2 lub kontrola izotypu, znakowane fikoerytryną (PE)) (przykład zgodnie z tabelą 2) i markery znakowane PE dla limfocytów T (CD3), limfocytów B (CD19), neutrofili (CD66b) i komórek NK (CD56) (Tabela 3). Wirować i inkubować przez 30 minut, 4 °C w ciemności. 
	UWAGA: Markery dla limfocytów, neutrofili i komórek NK są uwzględniane tylko w celu walidacji metody bramkowania.</li>
	<li>Dodać 250 μl połączonego roztworu do lizy czerwonych krwinek/utrwalania krwinek czerwonych, natychmiast delikatnie przetrząsnąć i inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 250 μl PBS i odwiruj komórki w temperaturze 260 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 300 μl 1% formaldehydu. 
	UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny. Używaj rękawic nitrylowych i używaj w dygestorium.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu przeprowadzenia analizy. 
	UWAGA: Zaleca się wykonanie analizy przepływu w ciągu 48 godzin od przygotowania próbki.</li>
</ol>
2. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Sprawdź dziennik cytometru przepływowego, aby upewnić się, że personel obiektu przeprowadził kontrolę jakości. 
	UWAGA: Aby zapewnić spójność między analizami, zaleca się kontrolę jakości przyrządu i utrzymanie stałych docelowych intensywności fluorescencji za pomocą kulek kontrolnych.</li>
	<li>Aby skonfigurować eksperyment cytometrii przepływowej, kliknij "Nowy eksperyment", a następnie "nowa próbka" i "nowa probówka", aby dodać probówki. Wybierz wykresy dwuwymiarowe, klikając ikonę i użyj menu rozwijanych, aby wybrać parametry osi. Upewnij się, że zawiera wykres CD16/CD14 i wykres wyświetlający detektor wraz z czasem do monitorowania akwizycji.</li>
	<li>Włóż rurkę i kliknij "Pobierz". Sprawdź napięcie przyrządutagustawienia upewnienia się, że sygnały detektora nie są poza skalą.</li>
	<li>Obserwuj komórki wpadające do bramki monocytów na wykresie CD14/CD16. Ustaw próg nagrywania na 5 000 zdarzeń dla klasycznej bramki monocytów i kliknij "Nagraj".</li>
	<li>Kontynuuj rejestrowanie danych dla pozostałych probówek. Po zarejestrowaniu danych dla wszystkich rur należy wyeksportować dane o przepływie jako pliki .fcs do analizy. 
	UWAGA: Aby zapewnić dokładność, należy nagrywać pojedyncze elementy sterujące kompensacją kolorów. Macierz kompensacji można obliczyć i zastosować do danych przed analizą, aby uwzględnić rozlanie widmowe15,16.</li>
</ol>
3. Bramkowanie monocytów
<ol>
	<li>Otwórz pliki w oprogramowaniu analitycznym. Kliknij dwukrotnie nazwę rury i wybierz parametry z menu rozwijanych, aby wyświetlić komórki na wykresie FSC(A)/FSC(H) z obszarem rozproszenia do przodu. Utwórz bramkę wykluczenia dubletu, klikając ikonę narzędzia bramki wielokątnej i otaczając komórki, jak w (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wybierz bramkowane komórki (klikając dwukrotnie na obszar bramkowany) i w nowym polu wyświetlania dostosuj parametry menu rozwijanego, aby wyświetlić komórki na wykresie FSC(A)/bocznym rozproszeniem SSC(A). Kliknij ikonę prostokątnej bramki i obficie wybierz populację monocytów na podstawie właściwości rozpraszania do przodu i boku, aby wykluczyć większość limfocytów, komórek NK i granulocytów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Wybierz bramkowane komórki i ponownie wyświetl je na wykresie CD14/CD16, wybierając parametry za pomocą menu rozwijanych. Kliknij bramkę wielokąta, aby wybrać monocyty na podstawie ich charakterystycznego kształtu "┐" (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Wybierz bramkowane komórki i wyświetl monocyty na wykresie CD16/HLA-DR za pomocą menu rozwijanych w celu wybrania parametrów. Kliknij bramkę wielokąta, aby wybrać komórki dodatnie HLA-DR i wykluczyć wszelkie pozostałe komórki NK i neutrofile17 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Wybierz bramkowane komórki i wyświetl dodatnie komórki HLA-DR na wykresie CD14/HLA-DR za pomocą menu rozwijanych, aby wybrać parametry. Kliknij bramkę wielokąta i narysuj bramkę, aby wykluczyć wysokie komórki HLA-DR/niskie CD14 (komórki B wyrażają wysokie poziomy HLA-DR, ale nie CD14) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Może dojść do zanieczyszczenia limfocytami B i dlatego należy je zbadać. Jeśli populacja nieklasyczna w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C nie różni się od komórek po jej lewej stronie, to prawdopodobne jest zanieczyszczenie. Krok 3.5 można pominąć, jeśli limfocyty B nie nakładają się na nieklasyczne monocyty.</li>
	<li>Wybierz bramkowane komórki i użyj menu rozwijanych, aby wyświetlić je na wykresie CD16/CD14. Z opcji wykresu wybierz "Wykres zebry", który umożliwi narysowanie bramek podzbioru monocytów w celu określenia proporcji podzbioru (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F). 
	UWAGA: Jeśli wykres zebry nie jest dostępny w oprogramowaniu do analizy, odpowiedni może być wykres pseudokolorowy (gładki) lub konturowy.</li>
	<li>Kliknij ikonę prostokątnej bramki i wybierz klasyczne monocyty, rysując przybliżoną prostokątną bramkę wokół CD14 wysokiej/CD16 niskiej, klasycznej populacji monocytów. W sekcji "Wyświetlanie" wybierz "Pokaż mediany", aby wyświetlić medianę intensywności fluorescencji dla klasycznych monocytów. Dostosuj bramkę w taki sposób, aby populacja miała równy rozkład od mediany po lewej i prawej stronie, obejmując wszystkie komórki po lewej stronie.</li>
	<li>Wybierz populację pośrednią, rysując prostokątną bramkę, która obejmuje komórki po prawej stronie klasycznej bramki. Dostosuj dolną część bramki, aby wykluczyć nieklasyczne komórki, wyrównując bramkę z dolną częścią koncentrycznych okręgów, które znajdują się całkowicie w klasycznej bramce monocytów, co zapewnia, że podzbiór pośredni ma ekspresję CD14 porównywalną z główną populacją klasyczną zgodną z obecną nomenklaturą.</li>
	<li>Bramkuj nieklasyczny podzbiór, rysując prostokątną ramkę w dół od dolnej krawędzi podzbioru pośredniego, zaznaczając wszystkie komórki na dole populacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
	<li>W sekcji "Wyświetlacz" wybierz "Pokaż częstotliwości bramek", aby określić procent każdego podzbioru monocytów.</li>
</ol>
4. Walidacja metody bramkowania
<ol>
	<li>Aby ustalić, czy potencjalnie zanieczyszczające typy komórek są skutecznie wykluczane, najpierw zidentyfikuj różne populacje komórek z przeciwciałami przeciwko limfocytom T (CD3), komórkom B (CD19), neutrofilom (CD66b) i komórkom NK (CD56) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Tutaj limfocyty T i neutrofile nie znajdują się blisko kształtu "┐" monocytów i są bramkowane w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki NK zostały usunięte w kroku 3.4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D), a komórki B zostały usunięte w kroku 3.5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E), jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 3. Jeśli komórki NK lub komórki B nie są wyłączone, ponownie wyreguluj bramki.</li>
</ol>
5. Ekspresja fenotypowego markera monocytowego
<ol>
	<li>Wybierz komórki z każdego podzbioru monocytów. Zmień parametry listy rozwijanej, aby utworzyć histogram dla każdego podzbioru monocytów (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1F) wyświetlający każdy marker i jego pasujący izotyp (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>Obliczyć stopień ekspresji każdego markera (mediana lub średnia geometryczna) w porównaniu z odpowiednią kontrolą izotypu.</li>
</ol>

<ol><li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li>
<li>Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD14%28bright%29+CD16%2B+monocyte+subset+is+expanded+in+rheumatoid+arthritis+and+promotes+expansion+of+the+Th17+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population.</a> Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).</li>
<li>Wildgruber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3BIntermediate%26%2334%3B+CD14%2B%2BCD16%2B+monocyte+subset+increases+in+severe+peripheral+artery+disease+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The &#34;Intermediate&#34; CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans.</a> Scientific Reports. 6, 39483(2016).</li>
<li>Heine, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+subpopulations+and+cardiovascular+risk+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease.</a> Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B%2BCD16%2B+monocytes+independently+predict+cardiovascular+events%3A+a+cohort+study+of+951+patients+referred+for+elective+coronary+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li>
<li>Bories, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+alternative+macrophage+differentiation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+obese+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).</li>
<li>Fadini, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbalanced+monocyte+polarisation+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+patients+with+type+2+diabetes+has+an+impact+on+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy.</a> Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).</li>
<li>Satoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbalanced+M1%2FM2+phenotype+of+peripheral+blood+monocytes+in+obese+diabetic+patients%3A+effect+of+pioglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone.</a> Diabetes Care. 33 (1), 7(2010).</li>
<li>Chen, X., Devaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+from+metabolic+syndrome+subjects+exhibit+a+proinflammatory+M1+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Syndrome+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).</li>
<li>Williams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+classical+monocytes+display+unbalanced+M1%2FM2+phenotype+with+increased+atherosclerotic+risk+and+presence+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Angiology%22%5BJournal%5D)">Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease.</a> International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li>
<li>Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+intermediate+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human intermediate monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 4, 339(2013).</li>
<li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+different+strategies+for+human+monocyte+subsets+gating+within+the+large-scale+prospective+CARE+FOR+HOMe+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study.</a> Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).</li>
<li>Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+inflammatory+profile+is+specific+for+individuals+and+associated+with+altered+blood+lipid+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels.</a> Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).</li>
<li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li>
<li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2C+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14%28hi%29+%2FCD16%28neg%29+monocytes%3A+Expansion+of+CD14%28hi%29+%2FCD16%28pos%29+and+contraction+of+CD14%28lo%29+%2FCD16%28pos%29+monocytes+in+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li>
<li>Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Classical+monocytes+display+inflammatory+features%3A+Validation+in+Sepsis+and+Systemic+Lupus+Erythematous%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous.</a> Scientific Reports. 5, 13886(2015).</li>
<li>Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+CD11b%2FCD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li>
<li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).</li>
<li>Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDagur%2C+PK+%22Current+protocols+in+cytometry%22">Current protocols in cytometry</a>. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).</li>
<li>Einwallner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+matters%3A+Red+cell+lysis+with+FACS+Lyse+affects+the+flow+cytometric+enumeration+of+circulating+leukemic+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).</li>
<li>Tsujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Heterogeneity+of+Human+Peripheral+Blood+Monocyte+Subsets+on+Myocardial+Salvage+in+Patients+With+Primary+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).</li>
<li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+lymphocyte%2C+monocyte+and+dendritic+cell+subsets+in+normal+rhesus+macaques+by+12-color+flow+cytometry%3A+Clarification+on+DC+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity.</a> Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).</li>
<li>Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+protocol+for+enumeration+of+endothelial+progenitor+cells+and+monocyte+subsets+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood.</a> Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).</li>
<li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+heterogeneity+in+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease.</a> Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).</li>
<li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SuperSAGE+evidence+for+CD14%2B%2BCD16%2B+monocytes+as+a+third+monocyte+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset.</a> Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).</li>
<li>Heimbeck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+single-platform+assay+for+human+monocyte+subpopulations%3A+Lower+CD14%2BCD16%2B%2B+monocytes+in+females%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females.</a> Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Refined+Definition+of+Monocyte+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets.</a> Frontiers in Immunology. 4, 23(2013).</li>
<li>Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+analysis+of+monocyte+subsets+in+cardiovascular+disease.+Joint+consensus+document+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29+Working+Groups+%22Atherosclerosis+%26+Vascular+Biology%22+and+%22Thrombosis%22%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis".</a> Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).</li>
<li>Shantsila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+characterization+of+human+monocyte+subsets%3A+possible+implications+for+cardiovascular+disease+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).</li>
<li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes%3A+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886(2011).</li>
<li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Blood+Monocyte+Subsets%3A+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Cytometria przepływu krwi pełnej jest idealnym podejściem do badania monocytów, ponieważ komórki są badane w warunkach zbliżonych do ich fizjologicznego mikrośrodowiska, co daje wgląd w ich rolę w infekcjach i stanach zapalnych. Co więcej, użycie świeżych (tj. nieprzetworzonych) próbek krwi minimalizuje zmiany lub transformacje komórek, które mogą wystąpić w wyniku przechowywania lub obchodzenia sięz 18,19, takich jak te, o których wiadomo, że występują w przypadku monocytów rozmrożonych w zamrażarce20. Zaleca się szybkie przygotowanie próbki, ponieważ niektóre markery są regulowane w górę, jeśli próbki są przechowywane w temperaturze pokojowej przed przetwarzaniem19. Optymalne stężenia markerów M1 i M2 określono przez miareczkowanie i należy to zrobić dla każdego nowego przeciwciała, aby ograniczyć niespecyficzne wiązanie, zapewniając jednocześnie, że stopień przesunięcia jest spowodowany ekspresją antygenu, a nie ograniczony przez brak przeciwciała. Usunięcie czerwonych krwinek i utrwalenie białych krwinek za pomocą roztworu do lizy jest ważnym krokiem w tym protokole, ponieważ obecność czerwonych krwinek może zakłócać cytometrię przepływową 21,22. Należy pamiętać, że chociaż niektóre roztwory do lizy są kompatybilne z barwieniem bez mycia, wyraźniejsze populacje są widoczne w naszych rękach, gdy używany jest etap mycia.
Prawidłowa konfiguracja cytometru przepływowego ma również kluczowe znaczenie przy porównywaniu ekspresji markerów monocytów. Zalecamy, aby badacze utrzymywali stałe docelowe intensywności fluorescencji kulek kontrolnych i przeprowadzali kontrolę jakości urządzenia, które ma być używane w celu zapewnienia spójnych wyników dla różnych próbek pobranych w różnych dniach. Oprócz tego kontrole izotypów są wykorzystywane do pomocy w interpretacji wszelkich niespecyficznych sygnałów tła generowanych przez niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Monocyty mają wysoki poziom receptorów Fc11 i dlatego są podatne na niespecyficzne wiązanie. Warto zauważyć, że poziom niespecyficznego wiązania różni się dla różnych podzbiorów, a zatem użycie kontroli izotypu staje się ważne przy porównywaniu stopnia ekspresji markera między podzbiorami.
Innym ważnym kryterium, które należy wziąć pod uwagę, są zastosowane stopnie bramkowania. Niektóre badania sugerują, że kluczowe jest narysowanie szczelnej bramy wokół populacji monocytów na wykresie FSC(A)/SSC(A), aby pozbyć się większości niemonocytowych komórek CD16 dodatnich 23,24,25, ale może to prowadzić do utraty niektórych monocytów, ponieważ komórki niemonocytowe mogą nakładać się na monocyty na poletkach FSC/SSC 26. Raczej, aby wykluczyć wszelkie inne komórki krwi, które mogą zanieczyszczać monocyty, konieczne jest włączenie trzeciego markera monocytów oprócz CD14 i CD1626,27. Z tego powodu HLA-DR jest często stosowany i jest idealny, ponieważ nie ulega ekspresji przez komórki NK ani neutrofile17,28. Chociaż limfocyty (limfocyty B i limfocyty T) mogą wykazywać ekspresję HLA-DR, różnią się one od monocytów pod względem ekspresji CD14. Podczas gdy HLA-DR jest idealnym trzecim markerem, CD86 również został zarekomendowany 5,27,29, ale nie został tutaj zastosowany, ponieważ jest również markerem M1, a zatem oceniono jego stopień ekspresji w podzbiorach monocytów.
Walidacja zastosowanej strategii bramkowania ma kluczowe znaczenie. Podczas gdy wiadomo, że komórki NK nakładają się na nieklasyczne, jeśli nie są bramkowane28, zauważamy, że komórki B mogą również nakładać się na nieklasyczne (Figura 2B); To, czy tak jest w przypadku innych badań, może zależeć od wyboru fluorochromu, konfiguracji instrumentu, czułości detektora, a nawet badanego stanu chorobowego. W tym przypadku nakładające się na siebie komórki B wykazywały wysoką ekspresję HLA-DR i nie były bramkowane przez selekcję komórek HLA-DR dodatnich na rysunku 1D. Zamiast tego, aby usunąć limfocyty B, użyliśmy dodatkowego wykresu CD14 / HLA-DR, gdzie komórki B oddzielają się od nieklasycznych ze względu na ich wyższą ekspresję HLA-DR i niską ekspresję CD14.
Istnieje również wiele różnych sposobów, w jakie bramy dla samych monocytów zostały narysowane w literaturze; Należą do nich ćwiartki (podzbiory są oddzielone znacznikami kwadrantów) oraz prostokątne lub trapezowe pola13 (z osobnymi ramkami narysowanymi dla każdego podzbioru), które ponadto różnią się rozmieszczeniem, wyznaczając, gdzie kończy się jeden podzbiór, a zaczyna drugi. Różnice te prawdopodobnie odzwierciedlają fakt, że monocyty istnieją jako kontinuum komórek, różnicujących się od klasycznych do nieklasycznych, a nie jako wyraźnie odrębne populacje. Ponieważ jednak różnice w technikach identyfikacji samych podzbiorów mogą prowadzić do różnic w obliczonych proporcjach podzbiorów monocytów, ważne jest, aby metoda bramkowania była w miarę obiektywna, a nie subiektywna, ponieważ dzięki temu metoda będzie bardziej solidna i odtwarzalna. W niektórych badaniach stosuje się kontrolę izotypu dla CD16 w celu określenia granicy między podzbiorami klasycznymi i pośrednimi30. Z drugiej strony, w celu zdefiniowania separacji między półproduktami i nieklasycznymi, zaproponowano, aby granica odcięcia była pionowa lub ukośna, przy czym wybór należy do badaczy, z zastrzeżeniem, że powinna być odtwarzalna, ale zalecono bramkę prostokątną w celu ułatwienia porównań między badaniami 13,30,31. W tym przypadku większą obiektywność uzyskano poprzez wykreślenie danych na wykresie zebry i zastosowanie obiektywnych reguł wizualnych, ponieważ wykresy zebry zapewniają dodatkową wskazówkę wizualizacyjną poprzez mieszanie gradientu kolorów do każdego równego przedziału prawdopodobieństwa w porównaniu z tradycyjnym wykresem konturowym. Prawa granica klasycznego podzbioru została narysowana w taki sposób, że populacja była równomiernie rozłożona wokół mediany populacji. Podział na półprodukty i nieklasyczne został również ustandaryzowany poprzez wyrównanie podstawy półproduktów z dolną częścią koncentrycznych okręgów w populacji klasycznej (tj. populacja pośrednia wyraźnie wyraża wysokie poziomy CD14, zgodnie ze standardową nomenklaturą1).
Podczas gdy niektóre badania sugerowały użycie dodatkowych markerów, takich jak receptor chemokiny C-C typu 2 (CCR2) lub 6-sulfoLacNAc (SLAN) w celu uzyskania pomyślnego zliczenia monocytów i ujawnienia ich znaczenia klinicznego32,33, w naszych rękach poziom ekspresji wielu markerów funkcjonalnych monocytów różni się znacznie u poszczególnych osób14. Taka zmienność może ograniczać przydatność tych markerów do definiowania podzbiorów na podstawie ich wyrażenia. Zautomatyzowane podejścia obliczeniowe zostały również wykorzystane do wizualizacji i grupowania podzbiorów monocytów, w tym wizualnego interaktywnego osadzania stochastycznego sąsiada (viSNE), osadzania stochastycznego sąsiada z rozkładem t (tSNE) lub analizy progresji drzewa rozpinającego zdarzeń znormalizowanych gęstości (SPADE)34,35, które mogą zapewnić wizualną reprezentację komórek na podstawie zestawu użytych wielu markerów. Chociaż wykazano, że zwiększa to dokładność strategii bramkowania w klasyfikacji podzbiorów monocytów, uznaje się, że wadą jest wymagana liczba przeciwciał (i odpowiadających im kanałów fluoroforowych). Jego przydatność będzie zależeć od zadawanych pytań; Dodatkowa złożoność może nie być uzasadniona, na przykład w badaniach wyliczeniowych.
Monocyty bramkowane naszą techniką wykazują proporcje zgodne z literaturą, a ekspresję markerów powierzchniowych przez trzy podzbiory można łatwo określić. Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj technika i metodologia zapewnia ustandaryzowaną i prostą metodę liczenia proporcji podzbioru monocytów i oceny ekspresji markerów powierzchniowych, które można rozszerzyć na inne markery, potwierdzając w ten sposób ich funkcjonalne role w różnych innych warunkach.

Monocyty to rodzaj białych krwinek, które odgrywają główną rolę w promowaniu i rozwiązywaniu stanów zapalnych. Rozpoznawane są trzy główne podzbiory monocytów: monocyty klasyczne (~85%), pośrednie (~5%) i nieklasyczne (~10%), które charakteryzują się poziomem klastra różnicowania (CD)14 i ekspresją CD161. Proporcje podzbiorów monocytów mogą się różnić w zależności od występowania choroby, np. zwiększony odsetek produktów pośrednich w różnych stanach zapalnych2,3 w tym choroby sercowo-naczyniowe, gdzie poziom produktów pośrednich jest związany ze zdarzeniami klinicznymi4,5. Co więcej, w stanach chorobowych monocyty mogą również ulegać zmianom funkcjonalnym, przy czym wiele zmian można wykryć za pomocą różnicy w wyrażeniu markera powierzchniowego6,7. Jednym z takich przykładów jest pochylenie monocytów M1, wzrost markerów związanych z makrofagami M1, który zaobserwowano w chorobach układu krążenia, cukrzycy, otyłości i zespole metabolicznym7,8,9,10.
Pomimo popularności cytometrii przepływowej do oceny proporcji i funkcji podzbioru monocytów, istnieje znaczna zmienność w przygotowaniu próbek i bramkowaniu podzbiorów między badaniami, co utrudnia porównywanie wyników między takimi badaniami. Co ważne, nie ma konsensusu co do rozgraniczenia podzbiorów monocytów, jednak ustandaryzowane podejście jest niezbędne, biorąc pod uwagę kliniczne znaczenie zmian proporcji podzbiorów w kilku chorobach. Część trudności w bramkowaniu wynika z faktu, że monocyty różnicują się od klasycznych przez pośrednie do nieklasycznych podzbiorów11 i jako takie, monocyty istnieją jako ciągłe spektrum, a nie odrębne populacje12. Co ciekawe, Zawada i wsp. wykazali, że użycie bramkowania prostokątnego lub trapezowego podzbioru pośredniego, oba skutkowały wyższym podzbiorem pośrednim, który przewidywał punkt końcowy układu sercowo-naczyniowego13. Podkreśla to, że przynajmniej przy obliczaniu proporcji kluczową kwestią jest zastosowanie spójnej strategii bramkowania między różnymi próbkami (i badaniami), a nie próba ostatecznego rozróżnienia podzbiorów. Podczas gdy ostateczne bramkowanie może być ważniejsze przy ocenie funkcji, zmiana w wyrażeniu znacznika między podzbiorami jest przyrostowa12,14, a zatem ponownie, spójność w bramkowaniu jest być może kluczowa. W związku z tym potrzebna jest obiektywna metoda bramkowania, która w sposób powtarzalny rozdziela podzbiory monocytów między różne próbki. Celem przedstawionej tutaj metody jest bramkowanie podzbiorów monocytów z jasnym wyjaśnieniem i uzasadnieniem zastosowanej techniki bramkowania oraz ocena podzbiorów pod kątem ekspresji markerów powierzchniowych, zapewniając w ten sposób metodę, która pozwala badaczom mieć pewność co do stosowania tej techniki podczas oceny różnych próbek.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do pobierania krwi Becton</td><td>Dickinson</td><td>367286</td><td></td></tr><tr><td>Vacuitainer BD K2E 5,5 mg plus probówki do pobierania krwi -3,0 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>7128959</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforem (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>5ml polistyrenowa probówka FACS z okrągłym dnem (styl 12 mm x 75 mm)</td><td>Technologie invitro</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD14 V450 [M&phi; P9]</td> <td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD16 APC [3G8]</td><td>Abcam Australia</td><td>ab140477</td><td></td></tr><tr><td>Per CP Przeciwciało anty-ludzkie HLA-DR [L243]</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz IgG1 &kappa; Kontrola izotypu [MOPC-21]</td> <td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Lot # 4283901</td></tr><tr><td>PE Mysz Przeciwciało anty-ludzkie CD163 [GHI/61]</td> <td>BD Biosciences</td><td>556018</td><td>Lot # 2335626</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD64 myszy PE [10.1]</td> <td>BD Biosciences</td><td>558592</td><td>Lot # 36768</td></tr><tr><td>PE Mysz Przeciwciało anty-ludzkie CD86 [2331 (FUN-1)]</td><td>BD Biosciences</td><td>555658</td><td>Lot # 3109766</td></tr><tr><td>Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD11b / Mac-1 [ ICRF44]</td> <td>BD Biosciences</td><td>561001</td><td>Lot # 3228959</td></tr><tr><td>PE Kontrola izotypu myszy IgG2A [20102]</td> <td>R& D Systems</td><td>IC003P</td><td>Lot # 1212031</td></tr><tr><td>PE Ludzkie przeciwciało TNF RII/TNFRSF1B [22235]</td> <td>R& Systemy D</td><td>FAB226P</td><td>Lot # 612051</td></tr><tr><td>Mysz PE IgG1, &kappa; Kontrola izotypu [MOPC-21]</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>Lot # B220359</td></tr><tr><td>PE Przeciwciało anty-ludzkie CD93 [VIMD2]</td><td>BioLegend</td><td>336107</td><td>Lot # B143544</td></tr><tr><td>Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD3 [SK7]</td><td>BD Biosciences</td><td>347347</td><td>Lot # 3010929</td></tr><tr><td>Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD19 [HIB19]</td><td>BD Biosciences</td><td>561741</td><td>Lot # 2307721</td></tr><tr><td>Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD56 [B159]</td><td>BD Biosciences</td><td>561903</td><td>Lot # 3011796</td></tr><tr><td>PE Przeciwciało anty-ludzkie CD66b [G10F5]</td><td>BioLegend</td><td>305105</td><td>Lot # B154037</td></tr><tr><td>OptiLyse C</td><td>Beckman Coulter</td><td>A11895</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 37%</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td> Automatyczny analizator hematologiczny,<td></td><td></td></tr><tr><td> XT-1800i</td> Wirówka <td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GS-6R</td><td>Oprogramowanie Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Tree Star Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocyty są kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do różnych zaburzeń zapalnych i zmian w tych komórkach, w tym ich proporcji i funkcji w podzbiorach, co może mieć patologiczne znaczenie. Idealną metodą badania zmian w monocytach jest cytometria pełnego przepływu krwi, ponieważ minimalne obchodzenie się z próbkami tą metodą ogranicza sztuczną aktywację komórek. Jednak stosuje się wiele różnych podejść do bramkowania podzbiorów monocytów, co prowadzi do niespójnej identyfikacji podzbiorów między badaniami. Tutaj demonstrujemy metodę wykorzystującą cytometrię pełnego przepływu krwi do identyfikacji i scharakteryzowania podzbiorów ludzkich monocytów (klasycznych, pośrednich i nieklasycznych). Opisujemy, jak przygotować próbki krwi do cytometrii przepływowej, bramkować podzbiory (upewnić się, że komórki zanieczyszczające zostały usunięte) i określać ekspresję podzbioru monocytów markerów powierzchniowych - w tym przykładzie markerów M1 i M2. Protokół ten można rozszerzyć na inne badania, które wymagają standardowej metody bramkowania do oceny proporcji podzbioru monocytów i ekspresji innych markerów funkcjonalnych w podzbiorze monocytów.

Zastosowana tutaj strategia bramkowania monocytów oraz analiza cytometrii przepływowej (Rysunek 1) pozwoliły na skuteczne wyodrębnienie subpopulacji monocytów i określenie ich względnych proporcji. Proporcje (dla tej próbki) obliczono jako: 88,1% monocytów klasycznych, 4,33% pośrednich i 7,49% nieklasycznych. Bramki dla tych subpopulacji nie były zanieczyszczone limfocytami B, limfocytami T, neutrofilami ani komórkami NK, co potwierdzono odpowiednio za pomocą markerów CD19, CD3, CD56 i CD66b. Ocena względnego położenia pozostałych populacji wyraźnie pokazuje, że limfocyty T i neutrofile znajdują się daleko poza obszarem o kształcie „┐” charakterystycznym dla monocytów na wykresie CD16/CD14 (Rysunek 2A oraz 2D). Jednakże zarówno populacje komórek NK, jak i limfocytów B nakładały się na populację monocytów nieklasycznych (Rysunek 2B oraz 2C). Kroki strategii bramkowania (Rysunek 1D oraz 1E) potwierdziły wykluczenie komórek NK (Rysunek 3A) oraz limfocytów B (Rysunek 3B). Chociaż populacja limfocytów B zawierała niewielką część monocytów nieklasycznych, ich ilość była pomijalna.
Po wyodrębnieniu subpopulacji oceniono stopień, w jakim wykazywały one ekspresję różnych markerów powierzchniowych: M1 (CD64, CD86 i CD120b) oraz M2 (CD163, CD11b i CD93). Markery wykazały pozytywną ekspresję w porównaniu z odpowiadającymi im kontrolami izotypowymi, co widoczne jest jako przesunięcie histogramów (Rycina 4). Mediana markerów była wyższa niż w przypadku kontroli izotypowych.
Zastosowanie tej strategii bramkowania do próbki krwi, która została podzielona na cztery probówki, osobno barwiona i analizowana, daje porównywalne wyniki między probówkami (Tabela 4).
<img alt="Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej; analiza danych populacji komórek, markerów CD; panel wykresów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywna strategia bramkowania monocytów w pełnej krwi ludzkiej. (A) Wykres FSC(A) vs. FSC(H): Bramkowanie komórek o równej powierzchni i wysokości, co pozwala na usunięcie agregatów (większe FSC(A) w stosunku do FSC(H)) oraz debris (bardzo niskie FSC) K= 1000. (B) Wykres FSC(A) vs. SSC(A): Szeroka selekcja monocytów na podstawie ich właściwości SSC/FSC. (C) Wykres CD16 vs. CD14: Bramkowanie w celu wyboru monocytów na podstawie ich charakterystycznego kształtu „┐”. (D) Wykres CD16 vs. HLA-DR: Bramkowanie w celu wyboru komórek dodatnich dla HLA-DR i usunięcia komórek NK. (E) CD14 vs. HLA-DR: Bramkowanie w celu wykluczenia limfocytów B (HLA-DR high/CD14 low) z populacji monocytów. (F) Wybrane monocyty ponownie wyświetlone na wykresie CD16 vs. CD14 w celu bramkowania subpopulacji monocytów. Dla A-F kolor reprezentuje gęstość komórek, gdzie niebieski i zielony oznaczają niską gęstość, czerwony i pomarańczowy wysoką gęstość, a pomarańczowy gęstość średnią. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej; bramkowanie limfocytów; wykres rozrzutu; markery CD; schemat różnicowania komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Walidacja strategii bramkowania poprzez identyfikację potencjalnych komórek zanieczyszczających. Potencjalne komórki zanieczyszczające są identyfikowane za pomocą markerów (A) limfocytów T (CD3), (B) limfocytów B (CD19), (C) komórek NK (CD56) oraz (D) neutrofili (CD66b). Panele po lewej stronie przedstawiają identyfikację każdej populacji po bramkowaniu zgodnie z Rycina 1A i 1B, gdzie kolor reprezentuje gęstość komórek od wysokiej (czerwony) do niskiej (niebieski). Panele po prawej stronie przedstawiają każdą populację komórek (niebieski) nałożoną na końcowy wykres monocytów CD16/CD14, aby ukazać bliskość tych populacji względem monocytów (czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające populacje komórek; monocyty, komórki NK, limfocyty B; markery CD, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Potwierdzenie, że etapy bramkowania usuwają komórki zanieczyszczające. Mapy ciepła przedstawiające stopień ekspresji od wysokiego (czerwony) do niskiego (niebieski) dla (A) CD56 i (B) CD19. Etapy bramkowania skutecznie wykluczają komórki z wysoką ekspresją CD56 (komórki NK) oraz wysoką ekspresją CD19 (limfocyty B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej markerów M1 (CD120b-PE) i M2 (CD93-PE) dla stanów makrofagów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ekspresja markerów M1 (CD120b) i M2 (CD93) w monocytach. Wygładzone histogramy ekspresji markerów monocytów M1 i M2 (kolor niebieski) wykazujące wyraźne przesunięcie względem izotypu (kolor czerwony) dla (A) monocytów klasycznych, (B) pośrednich oraz (C) nieklasycznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciało</td>
			<td>Objętość (50 µL krew)</td>
			<td>Objętość (16x) 800 µL krew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 - V450</td>
			<td>0.75 µL</td>
			<td>12 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 - APC</td>
			<td>0.5 µL</td>
			<td>8 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0.625 µL</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przeciwciała do analizy krwi pełnej metodą przepływową i master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Probówka</td>
			<td>przeciwciała znakowane PE</td>
			<td>Code</td>
			<td>Dopasowanie izotypu</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Objętość robocza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>Brak danych</td>
			<td>1.0 µg/20 µL </td>
			<td>0.625 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD IgG1  </td>
			<td>0.125 µg/20 µL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD IgG1  </td>
			<td>0.06 µg/20µL</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>ND</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD IgG1  </td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD IgG1  </td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>R &amp;D (IC003P)</td>
			<td>ND</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R &amp;D (FAB226P)</td>
			<td>R &amp;D IgG2a</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>ND</td>
			<td>0,2 mg/ml</td>
			<td>2.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>BL IgG1</td>
			<td>50 µg/mL</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem M1/M2-PE do analizy krwi pełnej metodą cytometrii przepływowej.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Probówka</td>
			<td >Przeciwciało</td>
			<td >Objętość robocza</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >11</td >
			<td >CD3</td >
			<td >5 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >12</td >
			<td >CD19</td >
			<td >5 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >13</td >
			<td >CD66b</td >
			<td >1.25 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >14</td >
			<td >CD56</td >
			<td >5 µL</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem PE dla limfocytów (komórek T, komórek B), neutrofili i komórek NK.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Probówka</td>
			<td >% klasyczne</td>
			<td >% pośrednie</td>
			<td >% nieklasyczne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1</td>
			<td >84.3</td>
			<td >5.11</td>
			<td >10.1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2</td>
			<td >84.2</td>
			<td >5.05</td>
			<td >10.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3</td>
			<td >84.3</td>
			<td >5.03</td>
			<td >10.7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4</td>
			<td >81.6</td>
			<td >5.03</td>
			<td >12.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Proporcje podgrup monocytów z jednej próbki krwi, barwionej i analizowanej osobno.

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Ta technika może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii. Na przykład określenie, w jaki sposób proporcje podzbioru monocytów lub ekspresja różnych markerów są zmieniane w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są bliskie swojemu rodzimemu stanowi oraz że stosowane są jasne instrukcje i uzasadnienie, aby zapewnić ustandaryzowaną metodę bramkowania.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć problemy, ponieważ wiele prac nie daje jasnych instrukcji dotyczących sposobu bramkowania komórek. Rozpocznij ten protokół od pobrania próbek krwi i oznaczenia liczby białych krwinek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozcieńczyć krew solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby dostosować stężenie do około 5 milionów białych krwinek na mililitr.Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki głównej dla liczby probówek, łącząc krew, anty CD14-V450, anty CD16-APC i anty HLA-DR-PerCP. Odwirować i odpipetować 51,9 mikrolitrów mieszanki do każdej probówki. Dodaj przeciwciała markerowe M1 i M2 znakowane PE, a także markery limfocytów T, limfocytów B, neutrofili i komórek NK do odpowiednich probówek.Wirować i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Teraz dodaj 250 mikrolitrów połączonego roztworu do lizy czerwonych krwinek i utrwalania białych krwinek i natychmiast delikatnie wymieszaj mieszaninę. Inkubuj zwirowaną mieszaninę przez 10 minut w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po 10 minutach dodaj 250 mikrolitrów PBS i odwiruj komórki w temperaturze 260 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach 1% formaldehydu. Przechowuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem do czasu przeprowadzenia analizy.Cytometrię przepływową należy wykonać w ciągu 48 godzin od przygotowania próbki. Na początek sprawdź dziennik cytometru przepływowego, aby upewnić się, że personel placówki przeprowadził kontrolę jakości. Aby skonfigurować eksperyment z cytometrią przepływową, kliknij nowy eksperyment, a następnie nową próbkę i nową probówkę, aby dodać probówki.Wybierz wykresy dwuwymiarowe, klikając ikonę i użyj menu rozwijanych, aby wybrać parametry dostępu. Upewnij się, że zawiera wykres CD16/CD14 i wykres wyświetlający detektor wraz z czasem, aby monitorować akwizycję. Włóż rurkę i kliknij, nabierz.Sprawdź napięcie przyrządutagustawienia, upewniając się, że sygnały detektora nie są poza skalą. Obserwuj komórki wpadające do bramki monocytów na wykresie CD14/CD16. Ustaw próg nagrywania na 5 000 zdarzeń dla klasycznej bramki monocytów i kliknij rekord.Kontynuuj rejestrowanie danych dla pozostałych probówek. Po zarejestrowaniu danych dla wszystkich rur należy wyeksportować dane dotyczące przepływu jako pliki fcs do analizy. Aby wykonać bramkowanie monocytów, otwórz pliki w oprogramowaniu do analizy, kliknij dwukrotnie nazwę rurki i wybierz parametry z menu rozwijanych, aby wyświetlić komórki na wykresie wysokości rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem wysokości rozproszenia do przodu.Utwórz bramkę wykluczenia dubletu, klikając ikonę narzędzia bramki wielokątnej i otaczając komórki. Wybierz bramkowane komórki, klikając dwukrotnie region bramkowany. W nowym polu wyświetlania dostosuj parametry menu rozwijanego, aby wyświetlić komórki na wykresie obszaru punktowego do przodu i na wykresie obszaru punktowego z boku.Kliknij ikonę prostokątnej bramki i obficie wybierz populację monocytów na podstawie właściwości rozpraszania do przodu i z boku, aby wykluczyć większość limfocytów, komórek NK i granulocytów. Wybierz bramkowane komórki i ponownie wyświetl je na wykresie CD14/CD16, wybierając parametry za pomocą menu rozwijanych. Kliknij na bramkę wielokąta, aby wybrać monocyty na podstawie ich charakterystycznego, odwróconego kształtu l.Jeśli populacja nieklasyczna nie różni się od komórek po jej lewej stronie, zanieczyszczenie jest prawdopodobne i powinno zostać zbadane. Wybierz bramkowane komórki i wyświetl monocyty na wykresie CD/16 HLA-DR, korzystając z menu rozwijanych w celu wybrania parametrów. Kliknij bramkę wielokątną, aby wybrać komórki HLA-DR dodatnie i wykluczyć wszelkie pozostałe komórki NK i neutrofile.Wybierz bramkowane komórki i wyświetl dodatnie komórki HLA-DR na wykresie CD14/HLA-DR za pomocą menu rozwijanych, aby wybrać parametry. Kliknij bramkę wielokątną i narysuj bramkę, aby wykluczyć komórki HLA-DR high/CD14 low B. Wybierz bramkowane komórki i użyj menu rozwijanych, aby wyświetlić je na wykresie CD16/CD14.Z opcji wykresu wybierz wykres zebry, który umożliwi narysowanie bramek podzbioru monocytów, w celu określenia proporcji podzbioru. Teraz kliknij ikonę prostokątnej bramki i wybierz klasyczne monocyty, rysując przybliżoną prostokątną bramkę wokół populacji klasycznych monocytów CD14 wysokich/CD16 niskich. W obszarze wyświetlacz wybierz, pokaż mediany, aby wyświetlić medianę intensywności fluorescencji dla klasycznych monocytów.Dostosuj bramkę w taki sposób, aby populacja miała równy rozkład od mediany po lewej i po prawej stronie i obejmowała wszystkie komórki po lewej stronie. Wybierz populację pośrednią, rysując prostokątną bramkę, która obejmuje komórki po prawej stronie klasycznej bramki. Dostosuj dolną część bramki, aby wykluczyć nieklasyczne komórki, wyrównując bramkę z dolną częścią koncentrycznych okręgów, które znajdują się całkowicie w klasycznej bramce monocytów.Bramkuje nieklasyczny podzbiór, rysując prostokątne pole w dół od dolnej krawędzi podzbioru pośredniego, zaznaczając wszystkie komórki do dołu populacji. W obszarze wyświetlacz wybierz opcję pokaż częstotliwości bramki, aby określić procent każdego podzbioru monocytów. Na koniec wybierz komórki z każdego podzbioru monocytów.Zmień parametry listy rozwijanej, aby utworzyć histogram dla każdego podzbioru monocytów, wyświetlający każdy marker. Następnie oblicz stopień wyrażenia, używając średniej mediany lub geometrycznej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazano tutaj pomyślnie bramkowane populacje monocytów.A proporcje są zgodne z tymi w literaturze. Proporcje dla tej próby obliczono następująco: 88,1% klasyczne, 4,33% pośrednie i 7,49% nieklasyczne. Oceniając względne położenie innych populacji, jasne jest, że limfocyty T i neutrofile pokazane tutaj na niebiesko, podążają daleko poza monocytem, w kształcie odwróconej litery l, na wykresie CD16 / CD14.Jednak zarówno komórki NK jak i populacje limfocytów B, pokazane tutaj na niebiesko, pokrywały się z nieklasyczną populacją monocytów. Mapy cieplne potwierdzające, że typy zanieczyszczających komórek zostały usunięte, są pokazane tutaj. Komórki NK zostały bramkowane przez krok HLA-DR CD16, podczas gdy komórki B zostały bramkowane przez etap HLA-DR CD / 14.Ekspresja markerów M1 i M2 w kolorze niebieskim, w stosunku do ich kontrolnych izotypów w kolorze czerwonym, jest pokazana tutaj. CD120b, marker M1, wykazuje wyraźne przesunięcie w stosunku do kontroli izotypowej dla wszystkich podzbiorów monocytów. Dotyczy to również CD93, markera M2, przy czym ekspresja jest wyższa w wersji klasycznej, umiarkowana w półproduktach i niska w nieklasycznych.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby upewnić się, że zanieczyszczające komórki są bramkowane, ponieważ w przeciwnym razie mogą one przyczynić się do ilościowej ekspresji. Po tej procedurze można zbadać inne markery. Aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, jak zmienia się ekspresja markerów monocytów w chorobie.Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią i formaldehydem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i używanie kaptura chroniącego przed zagrożeniem biologicznym.

characterization-human-monocyte-subsets-whole-blood-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowano zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do wzbogacania krążących komórek z jądrem z krwi obwodowej poprzez lizę erytrocytów, co zapewnia izolację wysokiej jakości próbki bez utraty komórek.

Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Poznaj metodę charakterystyki podzbiorów monocytów ludzkich za pomocą cytometrii przepływowej krwi pełnej. Protokół obejmuje gating populacji i ocenę ekspresji markerów powierzchniowych M1 oraz M2.

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów