Name: Ocena stanu zdrowia dzikich ryb na podstawie sekcji zwłok (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Naucz się oceny stanu zdrowia dzikich ryb metodą sekcji zwłok w celu monitorowania ekosystemów wodnych. Technika obejmuje dokumentację zmian zewnętrznych, pobieranie krwi i tkanek do histopatologii oraz analizę otolitów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez programy U.S. Geological Survey's Ecosystems (Chesapeake Bay Environments and Fisheries) i Environmental Health (Conmisants Biology) oraz Departament Zasobów Naturalnych Wirginii Zachodniej. Używanie nazw handlowych służy wyłącznie do celów identyfikacyjnych i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Leetown Science Center.
1. Zbieranie ryb
<ol>
	<li>Odłów żywe ryby, minimalizując poziom stresu. Wykorzystaj elektrolów z łodzi lub plecakowy, wędki lub sieci.</li>
	<li>Przechowuj ryby w zbiornikach z dopływem wody lub napowietrzanych pojemnikach do momentu pobrania próbek. 
	UWAGA: American Fisheries Society opublikowało szereg przewodników dotyczących odłowu, obchodzenia się z rybami oraz znieczulania/eutanazji26,27,28. Podczas pracy z rybami należy nosić rękawiczki.</li>
</ol>
2. Nekropsja ryb
<ol>
	<li>Uśmierć rybę.
	<ol>
		<li>Umieść ryby w środku anestetykującym, aż ruchy pokryw skrzelowych ustaną, a ryby stracą równowagę. Po kolejnych 2–10 min ryby zostaną poddane eutanazji, jednak czas ten może różnić się w zależności od gatunku. 
		UWAGA: Ryby można uśmiercić przy użyciu szeregu środków znieczulających (patrz Tabela materiałów (dla najczęściej stosowanych). Metoda eutanazji będzie zależeć od pomiarów laboratoryjnych, które zostaną przeprowadzone na pobranych tkankach29.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar cech biometrycznych.
	<ol>
		<li>Zważ rybę z dokładnością do jednego grama.</li>
		<li>Zmierz długość ryby z dokładnością do jednego milimetra.
		<ol>
			<li>Zmierz całkowitą długość od czubka pyska przy zamkniętych ustach do końca ogona, ściśniętego w linii prostej.</li>
			<li>Zmierz długość widlicową od widlicy ogona do czubka ryjca oraz długość standardową od czubka ryjca do końca ciała (początku ogona).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oblicz współczynnik kondycji, korzystając z następującego wzoru: 
		Wskaźnik kondycji = (całkowita masa ciała - masa gonad)/całkowita długość3. 
		Uwaga: Masę gonad odejmuje się od całkowitej masy ciała, ponieważ gonady mogą znacząco wpływać na całkowitą masę ciała, szczególnie u samic ryb w okresie przedtarłowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać próbkę krwi. 
	UWAGA: Krew pobiera się najczęściej z żyły ogonowej, lecz można ją również pobrać z aorty grzbietowej lub poprzez punkcję serca30.
	<ol>
		<li>Pobrać próbkę krwi obwodowej z żyły ogonowej za pomocą igły 22 lub 23 G zamocowanej do strzykawki o pojemności od 1 do 5 ml, w zależności od wielkości ryby. Wprowadzić igłę przednio-ogonowo, poniżej linii bocznej (Rycina 1A i 1B). Kieruj igłę ku górze, aż napotka kręgosłup, a następnie lekko ją wycofaj. Żyła znajduje się brzusznie względem nadlegającego kręgosłupa. 
		UWAGA: Jeśli planowane jest wykonanie rozmazów krwi lub wymagane jest serum, nie stosuje się przeciwkrzepliwa. W większości przypadków pobierana jest osocze, w związku z czym do powlekania igły i strzykawki oraz do probówki do pobierania krwi stosuje się przeciwkrzepliwa, takie jak heparyna sodowa, EDTA lub lit.np., probówka próżniowa).</li>
		<li>Usuń igłę i umieść ją w pojemniku na odpady ostre przed przelaniem krwi do probówki do pobierania. 
		UWAGA: Krew można przechowywać w lodzie, jednak w zależności od dalszych analiz należy ją odwirować tak szybko, jak to możliwe30.</li>
		<li>Jeśli planowana jest ocena nieprawidłowości jąder komórkowych lub różnicowe morfologiczne badanie krwi, należy niezwłocznie nanieść kroplę krwi na dwie czyste szklane laminki. Drugą laminkę należy podłożyć pod 45° pod kątem do kropli, którą następnie rozciąga się po powierzchni dzięki działaniu kapilarnemu. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu31.</li>
		<li>Wirować krew przy 1500–2500 x g g przez 15 min w celu sedymentacji komórek. Usunąć osocze/surowicę za pomocą sterylnej pipety transferowej, rozdzielić na alykwooty do fiolek kriogenicznych i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Procedura pobierania krwi z ryby; ekstrakcja strzykawką, badania biologiczne, pobieranie próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pobieranie próbki krwi z ryby. (A) Niedawno uśmiercona ryba zostaje ułożona na boku i lokalizowana jest linia boczna. (B) Igłę wprowadza się brzusznie w stosunku do linii bocznej (strzałka), kierując ją ku górze, aż dotknie kręgosłupa. Następnie igłę lekko wycofuje się i rozpoczyna zasysanie w celu pobrania krwi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>Przeprowadź ocenę stanu zdrowia każdej ryby w oparciu o sekcję zwłok. 
	UWAGA: Dostępnych jest wiele publikacji ilustrujących i opisujących zmiany chorobowe oraz anomalie32,33,34,35.
	<ol>
		<li>Zadokumentuj anomalie zewnętrzne, w tym zmiany na powierzchni ciała i płetwach (Rysunek 2), oczach i skrzela (Rysunek 3), pasożyty zewnętrzne, takie jak pijawki (Rysunek 2D), larwy owadów lub cysty metacerkarii trematodów (Rysunek 2D, 3B) oraz pasożyty skrzeli (Rysunek 3D). W arkuszach danych oraz, jeśli to możliwe, fotograficznie, udokumentuj rodzaj, lokalizację i wielkość zaobserwowanych anomalii.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną (Rysunek 4A) za pomocą nożyczek, wykonując cięcie od okolicy odbytowej do pokrywy skrzelowej, a następnie usuwając płat mięśniowy, aby odsłonić narządy wewnętrzne. 
		UWAGA: Jeśli przednia nerka ma zostać pobrana do oceny funkcji immunologicznych (patrz krok 5 poniżej) lub pobierane są próbki do badań bakteriologicznych bądź wirusologicznych, zewnętrzną powierzchnię ciała należy zdezynfekować 70% alkoholem, a próbki te należy pobrać przed przeprowadzeniem sekcji. Jeśli tkanki są wykorzystywane wyłącznie do obserwacji wizualnych, analizy osocza i histopatologii, technika sterylna nie jest wymagana.</li>
		<li>Zadokumentuj anomalie wewnętrzne (Rysunek 4), w tym ogólne lub ogniskowe odbarwienia różnych narządów (Rysunek 4B-4D), obecność wyniesień (Rysunek 4E), cyst, pasożytów oraz anomalie wielkości (powiększenie, zanik).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Badanie zmian skórnych u ryb; schemat wyróżnia możliwe markery chorobowe na okazach ryb." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykłady widocznych zmian zaobserwowanych na powierzchni ciała i płetwach ryb. (A) Mała, lekko erodyzowana zmiana (strzałka) na bocznej powierzchni ciała. (B) Duży zaczerwieniony obszar (strzałka) obejmujący ogonową powierzchnię ciała. (C) Wypukłe, czarne zmiany (strzałki) na powierzchni ciała i płetwach. (D) Pijawki (biała strzałka) i małe czarne plamki (czarne strzałki) na płetwie. Pasek skali = 3 mm. (E) Wypukła, wieloklapowa, blada zmiana (strzałka) na powierzchni ciała. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat anatomii skrzela ryby przedstawiający struktury wewnętrzne, z etykietami części do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykłady widocznych zmian chorobowych skrzeli i oczu ryb. (A) Blady obszar (strzałka) w soczewce oka. Pasek skali = 5 mm. (B) Białe cysty (białe strzałki) i małe czarne plamki (czarne strzałki) wywołane przez pasożytnicze trematody na operculum pokrywającym skrzela (a). Pasek skali = 1 cm. (C) Blady, erodowany obszar (strzałka) na skrzelu (a). Pasek skali = 5 mm. (D) Usunięte skrzelo wykazujące pasożyty (strzałki) przyczepione do włókien skrzelowych. Pasek skali = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment z sekcji ryby; identyfikacja wątroby i gonad; metoda w analizie badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykłady nekropsji i nieprawidłowości wewnętrznych u ryb. (A) Podczas nekropsji ryba jest rozcinana (wzdłuż białej strzałki), a płat mięśnia (czarna strzałka) usuwany, aby odsłonić gonadę (a) oraz śledzionę, przytrzymywane pęsetą i nożyczkami. (B) Wątroba cętkowana (a), jądra (b), jelito otoczone tkanką tłuszczową (c) i żołądek (d). Pasek skali = 5 mm. (C) Wątroba (a) z ciemnoczerwonym obszarem (strzałka), jajnik (b) i jelita (c). Pasek skali = 5 mm. (D) Wątroba z zielonkawymi obszarami przebarwień (strzałki). Pasek skali = 1 cm. (E) Przykład prawidłowych (a) i nieprawidłowych (b) jąder z wyniesionymi guzkami. Pasek skali = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="5">
	<li>Wyznaczenie indeksu hepatosomatycznego (HSI).
	<ol>
		<li>Usunąć wątrobę poprzez przecięcie tętnicy wątrobowej oraz tkanki łącznej w przedniej części. Delikatnie wyciągnąć organ, odcinając zrosty oraz inne połączenia z jelitami i tkanką tłuszczową. Należy uważać, aby nie przebić pęcherzyka żółciowego. Zważyć wątrobę. 
		UWAGA: Niektóre ryby, np. karpiowate, nie posiadają wyraźnie wydzielonej wątroby, lecz tkankę wątrobową otaczającą jelita i inne organy. W przypadku tych gatunków uzyskanie masy wątroby może być niemożliwe.</li>
		<li>Obliczyć indeks hepatosomatyczny (HSI), korzystając ze wzoru: 
		HSI=masa wątroby/całkowita masa ciała</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczenie indeksu gonadosomatycznego.
	<ol>
		<li>Usunąć gonady i zważyć je.</li>
		<li>Obliczyć indeks gonadosomatyczny (GSI), korzystając ze wzoru: 
		GSI = masa gonad/całkowita masa ciała</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Utrwalanie tkanek do badań patomorfologicznych
UWAGA: Do utrwalania tkanek w terenie można użyć szeregu utrwalaczy, w tym 10% neutralnej buforowanej formaliny oraz Z-fix, utrwalacza na bazie formaliny z dodatkiem cynku. Ten drugi jest preferowany, jeśli planowane jest zastosowanie metod takich jak hybrydyzacja in situ lub barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi.
<ol>
	<li>Ostrożnie wycinać, ale nie wyrywać próbek tkanek. Aby zapewnić prawidłową utrwalenie, poszczególne fragmenty tkanek powinny mieć rozmiar &lt;2 cm i grubość &lt;5 mm. Jako ogólną zasadę należy przyjąć, że dla właściwej konserwacji objętość utrwalacza powinna być około 10-krotnie większa niż objętość tkanki. Wszystkie próbki tkanek od jednej ryby umieścić w tym samym szczelnym pojemniku o odpowiedniej wielkości, zależnie od rozmiaru pobieranej próbki ryby.</li>
	<li>Fragmenty wszelkich nieprawidłowości zewnętrznych umieścić w pojemniku z utrwalaczem. Należy również dołączyć sąsiedni fragment prawidłowej tkanki. 
	UWAGA: Nieprawidłowa obsługa, taka jak kompresja lub inne uszkodzenia mechaniczne, długotrwała ekspozycja na powietrze lub światło słoneczne, a także zamrażanie, mogą powodować powstawanie artefaktów.</li>
	<li>Wyciąć co najmniej pięć fragmentów wątroby o grubości 3–4 mm z różnych obszarów i umieścić je w pojemniku z utrwalaczem. Należy uwzględnić obszary prawidłowe i nieprawidłowe, jeśli zostały zaobserwowane.</li>
	<li>W zależności od wielkości, do pojemnika z utrwalaczem umieścić całą gonadę lub kilka fragmentów pobranych wzdłuż jednej gonady.</li>
	<li>Do pojemnika z utrwalaczem umieścić całe organy (jeśli są małe) lub fragmenty wszystkich pozostałych organów (śledziony, przedniej i tylnej nerki, skrzeli, serca, jelita i żołądka). W przypadku zaobserwowania nieprawidłowej tkanki, należy zakonserwować również sąsiedni fragment prawidłowej tkanki.</li>
</ol>
4. Usunięcie otolitów do analizy wieku
UWAGA: Wiek może być istotną zmienną w badaniach nad chorobami i zdrowiem ryb. Chociaż do określania wieku wykorzystywano szereg struktur, w tym łuski i kolce, większość badań porównawczych wykazała, że otolity dają najlepsze wyniki36,37. Ryby kostnoszkieletowe posiadają trzy pary otolitów: lapillus, sagitta oraz asteriscus. Zazwyczaj do określania wieku pobiera się otolity sagitta lub lapillus, choć może się to różnić w zależności od gatunku. Techniki usuwania i określania wieku zostały opisane wcześniej38.
<ol>
	<li>Przetnij przemysłek skrzelowy i odgnij głowę do tyłu. Usuń tkankę łączną i mięśniową z dolnych części neurokranium, aby zlokalizować bąble prootyczne (prootic bullae), czyli wypukły obszar kostny.</li>
	<li>Nacinaj lub przetnij za pomocą cęgów do kości i rozłam, aby odsłonić otolity. Są one widoczne gołym okiem.</li>
	<li>Umieść otolity w opisanej fiolce lub kopercie na monety i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu analizy wieku poprzez liczenie pierścieni lub przyrostów38. W przypadku umieszczenia w fiolce, po powrocie do laboratorium otwórz zakrętkę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia przed przechowywaniem.</li>
</ol>
<img alt="Sekcja ryby w celu analizy skrzeli; kroki przedstawiające proces ekstrakcji za pomocą nożyczek i pęsety." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Usuwanie otolitów. (A) Przecina się przemyczko, a tkankę łączną i mięśnie odsuwa, aby odsłonić podstawę kręgosłupa i obszar neurospinalny. (B) Kość zostaje rozłupana, aby odsłonić otolity. (C) Otolity lapillares zostają usunięte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
5. Pobranie tkanek do testów funkcji odpornościowych
UWAGA: Przednia nerka jest głównym organem krwiotwórczym, źródłem limfocytów i makrofagów do testów funkcjonalnych i musi zostać usunięta aseptycznie, jeżeli komórki mają być hodowane do testów funkcjonalnych, takich jak mitogeneza, zdolność fagocytarna i zabójcza makrofagów39,40.
<ol>
	<li>Spryskaj zewnętrzną powierzchnię ryby 70% etanolem. Używając sterylnych nożyczek, skalpela i pęsety, otwórz jamę brzuszną i usuń tkankę przedniej części nerki, która jest ciemnoczerwonym organem znajdującym się przed pęcherzem pławny.</li>
	<li>Umieść próbkę przedniej części nerki w pożywce (np. Leibovitz's L-15), aby utrzymać żywotność komórek. Homogenizuj próbki nerek za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora tkankowego (np. homogenizatora Tenbroeck), aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Przechowuj na mokrym lodzie do momentu powrotu do laboratorium.</li>
</ol>
6. Konserwacja tkanek do analiz kwasów nukleinowych
UWAGA: Jeśli planowane są dalsze analizy molekularne, takie jak badanie ekspresji genów z wykorzystaniem ilości transkryptów41 lub ilościowy PCR42 (reakcja łańcuchowa polimerazy), należy jak najszybciej umieścić fragmenty tkanki przeznaczone do oceny w odpowiednim konserwancie (np. roztwór stabilizujący RNAlater).
<ol>
	<li>W celu konserwacji RNA umieść dwa do trzech małych fragmentów (2–3 mm) w odpowiednim konserwancie, zachowując stosunek objętości konserwanta do tkanki 10:1. 
	UWAGA: Próbki należy chronić przed światłem słonecznym lub nadmiernym ciepłem i transportować w lodzie kruszonym.</li>
	<li>W celu konserwacji DNA umieść dwa do trzech małych fragmentów tkanki w 95% etanolu (stosunek objętości etanolu do tkanki 10:1). Następnie utrzymuj próbki w lodzie kruszonym, a potem przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oparta na sekcji zwłok ocena stanu zdrowia ryb może być wykorzystana na dowolnym gatunku ryb, dla których badacz rozumie normalny wygląd zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych struktur. Stosowanie ustandaryzowanego podejścia pozwala na porównywanie miejsc i gatunków, a także sezonowych i czasowych zmian w populacji. Wyniki badań mogą być wykorzystane do identyfikacji skutków związanych z punktowymi i niepunktowymi źródłami zanieczyszczeń oraz do informowania o działaniach zarządczych. Może być również używany do śledzenia ulepszeń po zainicjowaniu działań zarządczych. Metodologia może być modyfikowana w celu poszerzenia dokumentacji zewnętrznych nieprawidłowości wizualnych na różne sposoby. Oceny, oparte wyłącznie na obserwacjach wizualnych, mogą być nieśmiertelne, stosunkowo niedrogie, a dane mogą być generowane szybko dla dużej liczby osób. W związku z tym mogą być przydatne do ocen rozpoznawczych lub wstępnych, do monitorowania zmian w czasie lub w połączeniu z innymi wskaźnikami. Jeśli długość i waga ryb są mierzone podczas obserwacji wizualnych, można również obliczyć współczynnik stanu. Chociaż oceny oparte wyłącznie na obserwacji wzrokowej nie dostarczają informacji na temat przyczyn lub powiązanych czynników ryzyka, długoterminowe tendencje dotyczące niektórych nieprawidłowości skórnych45 i parametrów biometrycznych46 wskazują na poprawę w niektórych obszarach związanych z poprawą jakości wody.
Ocena oparta na sekcji zwłok dostarcza więcej informacji, ponieważ badane są również narządy wewnętrzne i można obliczyć inne czynniki stanu, takie jak indeks hepatosomatyczny i indeks gonadosomatyczny. Goede iBarton opracowali metodę sekcji zwłok w terenie, która obejmowała parametry krwi, czynniki biometryczne, odsetek nieprawidłowości i wartości indeksu dla określonych nieprawidłowości. Udoskonalenie metody obejmowało ocenę dotkliwości niektórych zmiennych, która pozwoliła na obliczenie wskaźnika oceny stanu zdrowia, który można było porównać statystycznie23. Ten wskaźnik oceny stanu zdrowia został wykorzystany w regionalnych porównaniach lokalizacji 23,47,48 oraz w połączeniu z innymi wskaźnikami biologicznymi, w tym analizami osocza i histopatologicznymi, w programie Biomonitoringu Stanu i Trendów Środowiskowych U.S. Geological Survey, oceniającym potencjalne skutki narażenia na zanieczyszczenia w dużych rzekach w całym kraju 49,50,51. Indeks chorób ryb oparty na widocznych z zewnątrz chorobach i pasożytach, widocznych nowotworach wątroby i innych histopatologicznych zmianach wątroby został opracowany i szeroko stosowany na Morzu Północnym, Morzu Bałtyckim i u wybrzeży Islandii. Stwierdzono, że indeks ten jest ważnym narzędziem jako wskaźnik zdrowia ekosystemu52.
Istnieje kilka krytycznych czynników w przeprowadzaniu oceny opartej na sekcji zwłok ryb. Po pierwsze, oceny muszą być przeprowadzone na rybach natychmiast po śmierci. Zmiany w kolorze i konsystencji narządów mogą wystąpić dość szybko po śmierci. Dodatkowo niektóre pasożyty mogą opuścić żywiciela wkrótce po śmierci. Po drugie, ważne jest, aby wiedzieć, co jest normalne dla interesujących gatunków. Na przykład niektóre ryby mają zwykle tłuste, a co za tym idzie, blade wątroby, podczas gdy dla większości gatunków blada wątroba byłaby nienormalna. Ważne jest również, aby rozpoznać zmiany sezonowe, które występują naturalnie. Niektóre ryby będą miały zmiany koloru lub rozwiną guzki lęgowe w okresie tarła.
Ograniczenia oceny opartej na sekcji zwłok jako metody oceny zdrowia ryb obejmują niemożność 1) konsekwentnego identyfikowania "przyczyny" określonych zmian chorobowych oraz 2) identyfikowania skutków, które mogą nie być widoczne gołym okiem. Wady te można przezwyciężyć poprzez dodanie histopatologii, molekularnej lub kulturowej identyfikacji patogenów i pasożytów oraz ekspresji genów. Na przykład "guz" lub wypukła zmiana (obrzęk) może być rzeczywistą neoplazją lub może to być pasożyt, stan zapalny, obrzęk lub hiperplazja (wzrost liczby normalnych komórek), spowodowane ekspozycją na chemikalia, czynniki zakaźne lub inne czynniki drażniące. Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, ostateczne rozpoznanie guza lub nowotworu wymaga mikroskopowej patologii w celu zidentyfikowania rodzaju i nasilenia zmiany (tj . łagodnej lub złośliwej). Ocena białych "guzów" zewnętrznych przyssawki na podstawie obserwacji wzrokowej przeszacowała częstość występowania, szczególnie w miejscu referencyjnym. Wiele z podniesionych zmian nie było nowotworami, ale raczej zmianami rozrostowymi. Obecnie nie wiadomo, czy te zmiany hiperplastyczne są przednowotworowe. I odwrotnie, obserwacja wypukłych guzków w wątrobie znacznie zaniżyła częstość występowania nowotworów wątroby. W związku z tym konieczne było pobranie tkanek do badań patologicznych pod mikroskopem, aby odpowiednio zaradzić możliwości skreślenia z wykazu.

Działalność człowieka ma wiele negatywnych skutków dla środowiska wodnego. Ryby zamieszkują różne zbiorniki wodne, w których ludzka populacja odtwarza i często wykorzystuje jako źródło wody pitnej, a zatem są ważnymi wskaźnikami zdrowia środowiska wodnego. Dzikie ryby, które żyją i rozmnażają się w określonym środowisku, są narażone przez całe życie na różne czynniki stresogenne, w tym patogeny, pasożyty, złą jakość wody i zanieczyszczenia chemiczne. Tysiące chemikaliów dostaje się do naszych dróg wodnych przez ścieki przemysłowe i ludzkie, podmiejskie/miejskie wody burzowe i spływy rolnicze. Te złożone mieszaniny substancji chemicznych mogą mieć addytywny, synergistyczny lub antagonistyczny wpływ na narażone organizmy1,2,3. Ponadto inne stresory środowiskowe, takie jak podwyższony poziom składników odżywczych, podwyższona temperatura, niski poziom rozpuszczonego tlenu lub wahania pH, mogą nasilać skutki zanieczyszczeń chemicznych4,5. Stresory środowiskowe mogą również bezpośrednio wpływać na wyniki chorób zakaźnych poprzez zwiększanie liczby czynników zakaźnych6, zwiększając zjadliwość patogenów oportunistycznych7 lub tłumiąc odpowiedź immunologiczną i odporność na choroby gospodarza8,9,10. Z tych powodów rośnie zainteresowanie monitorowaniem skutków biologicznych lub negatywnych11,12,13,14, wykorzystując ryby i inne organizmy wodne do identyfikacji zagrożonych populacji i ekosystemów.
Monitorowanie negatywnych skutków wykorzystuje biomarkery na różnych poziomach organizacji, od organizmu do subkomórkowego lub molekularnego, do identyfikacji efektów subletalnych, które mogą wpływać na populacje i wskazywać na narażenie na różne stresory. Wskaźnikami na poziomie organizmu są widoczne nieprawidłowości i stany. Wskaźniki kondycji oparte na długości i wadze są obliczane w celu oceny dobrostanu lub sprawności populacji ryb. Najczęstszym z nich są współczynniki warunku Fultona (K) = (waga/długość3) 15. Innym wskaźnikiem jest obecność widocznych nieprawidłowości. W indywidualnych badaniach i programach monitorujących zastosowano różne metody w celu oceny, udokumentowania i oceny widocznych nieprawidłowości. Ocena oparta wyłącznie na nieprawidłowościach zewnętrznych, tj. odsetku osób z chorobami, uszkodzeniami płetw, guzami i anomaliami szkieletowymi, jest jednym z wskaźników wskaźnika integralności biotycznej (IBI), który ocenia zdrowie społeczności16. Podobna ocena określana jako DELT (deformacje, nadżerki, zmiany chorobowe, nowotwory) została również wykorzystana do oceny zdrowia społeczności ryb17. Jednak metody te oceniają tylko zewnętrzne nieprawidłowości wizualne, a nie zmiany wewnętrzne lub wczesne wskaźniki subletalne.
Oceny oparte na sekcji zwłok obejmują obserwacje zewnętrzne i wewnętrzne oraz pozwalają na pomiar dodatkowych wskaźników stanu. Indeks hepatosomatyczny (masa wątroby/całkowita masa ciała) był również używany jako wskaźnik kondycji lub rezerw energetycznych15, dla którego wyższa wartość indeksu oznacza zdrowsze ryby. Jednak wiele badań wykazało, że przerost lub wzrost rozmiaru wątroby występuje z powodu narażenia na różne zanieczyszczenia metabolizowane przez wątrobę18,19,20. W tym przypadku wyższy wskaźnik wskazywałby na narażenie na niektóre klasy chemiczne. Indeks gonadosomatyczny (masa gonad/całkowita masa ciała) to kolejny wskaźnik chorób ukierunkowany na zdrowie reprodukcyjne21. Obserwacje poczynione podczas oceny opartej na sekcji zwłok można wykorzystać do porównania częstości występowania poszczególnych typów zmian chorobowych lub odsetka osób zdrowych. Można je jednak również wykorzystać w bardziej ilościowej ocenie stanu zdrowia22,23.
Opisana tutaj standaryzowana ocena oparta na sekcji zwłok może być użyta do rozszerzenia rażąco widocznej oceny na wiele sposobów, w zależności od pytania, na które należy odpowiedzieć, wiedzy specjalistycznej i innych dostępnych zasobów. Nasze rutynowe podejście polega na zbieraniu danych biometrycznych (długość, waga, masa wątroby, masa gonad), krwi do analiz osocza/surowicy, dokumentowaniu widocznych nieprawidłowości zewnętrznych i wewnętrznych, zabezpieczaniu fragmentów narządów do analiz mikroskopowych i zbieraniu otolitów do analiz wieku. Ocena oparta na sekcji zwłok oraz analiza wieku i histopatologii różnych narządów pozwala na obliczenie i porównanie różnych wskaźników stanu, częstości występowania widocznych nieprawidłowości, a także mikroskopijnych zmian tkankowych, w zależności od płci, wieku, miejsca i okresu pobierania próbek. Dodatkowe kolekcje tkanek mogą być wykonane do wielu innych analiz, w tym mikroskopii elektronowej, bakteriologii, wirusologii, parazytologii i stężeń chemicznych. Metody te mogą być również częścią bardziej szczegółowych analiz wykorzystywanych do diagnozowania przyczyn śmierci ryb24 lub śmiertelności ryb żyjących w niewoli25. Przedstawiono metody pobierania tkanek do dwóch dodatkowych analiz, ekspresji genów i funkcjonalnych analiz immunologicznych.

<table><tbody><tr><td>Stoły składane</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krzesła składane</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>deski do preparowania</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tablica pomiarowa (mm)</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga zasilana bateryjnie (g) do wagi ryb</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga zasilana bateryjnie (mg) do odważników narządów</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obcinacze do kości</td><td>Wszelkie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>skalpele i ostrza</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki jednorazowe</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wiadra</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szczelne butelki Nalgene (250 ml)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-924-5C</td><td></td></tr><tr><td>Probówki próżniowe z heparyną sodową</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Jednorazowe&nbsp; 3 mL strzykawki z igłą 23 G</td><td>Kriowiale ThermoFischer Scientific</td><td>14-826-11</td><td></td></tr><tr><td>1 &ndash; 2 mL</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Używany do próbek osocza i RNAlater</td></tr><tr><td>Invitrogen RNAlater Roztwór stabilizujący</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Z-Fix Formaldehyd Utrwalacz</td><td>Anatech LTD</td><td>SKU-174</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>Syndel USA</td><td></td><td>znieczulenie do ryb</td></tr><tr><td>Koperty na monety</td><td>Dowolna</td><td></td><td>dla otolitów</td></tr><tr><td>Ołówki i długopisy</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% alkoholu</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karty katalogowe</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena stanu zdrowia dzikich ryb na podstawie sekcji zwłok

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Antropogeniczne wpływy, od zwiększonej ilości składników odżywczych i zanieczyszczeń chemicznych, po zmiany siedlisk i zmiany klimatu, mogą mieć znaczący wpływ na populacje ryb. Monitorowanie działań niepożądanych, wykorzystujące biomarkery od poziomu organizmu do poziomu molekularnego, można wykorzystać do oceny skumulowanego wpływu na ryby i inne organizmy. Zdrowie ryb jest wykorzystywane na całym świecie jako wskaźnik zdrowia ekosystemów wodnych. Ocena stanu zdrowia ryb oparta na sekcji zwłok dostarcza danych na temat widocznych nieprawidłowości i zmian chorobowych, pasożytów, stanu i wskaźników organosomatycznych. Można je porównywać według miejsca, pory roku i płci, a także czasowo, aby udokumentować zmiany w czasie. Oceny dotkliwości można przypisać do różnych obserwacji w celu obliczenia wskaźnika zdrowia ryb w celu bardziej ilościowej oceny. Wadą oceny opartej na sekcji zwłok jest to, że opiera się ona na obserwacjach wizualnych i czynnikach warunkowych, które nie są tak czułe jak biomarkery tkankowe i subkomórkowe dla skutków subletalnych. Dodatkowo rzadko udaje się zidentyfikować przyczyny lub czynniki ryzyka związane z obserwowanymi nieprawidłowościami. Tak więc, na przykład, wypukła zmiana lub "guz" na płetwach, wargach lub powierzchni ciała może być nowotworem. Jednak może to być również odpowiedź na pasożyta, przewlekłe zapalenie lub przerost normalnych komórek w odpowiedzi na czynnik drażniący. I odwrotnie, nowotwory, niektóre pasożyty, inne czynniki zakaźne i wiele zmian w tkankach nie są widoczne, a więc mogą być niedoceniane. Jednak podczas oceny opartej na sekcji zwłok można pobrać krew (osocze), tkanki do histopatologii (patologia mikroskopowa), genomika i inne analizy molekularne oraz otolity do starzenia. Te dalsze analizy, wraz z analizami geoprzestrzennymi, ocenami siedlisk, analizami jakości wody i zanieczyszczeń, mogą być ważne w kompleksowych ocenach ekosystemów.

Obszary Zagrożenia Wielkich Jezior (AOC) to obszary geograficzne, które zostały wyznaczone ze względu na ograniczenia różnych użytek korzystnych. Jednym z ograniczeń użytek korzystnych (BUI) w wielu AOC są guzy u ryb lub inne deformacje. Wydano miliony dolarów na rekultywację i przywrócenie każdego z tych obszarów, aby usunąć poszczególne BUI, a ostatecznie także sam AOC43. Kryteria usuwania BUI związanego z guzami u ryb różnią się w poszczególnych stanach (zobacz epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf oraz dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); jednak, jak wspomniano w dokumentach dotyczących usuwania z listy, istnieje wymóg określenia częstości występowania guzów wątroby, a w niektórych przypadkach także guzów skóry. We wielu przypadkach częstość tę porównuje się z niezanieczyszczonym obszarem referencyjnym poza AOC.
Oceny guza ryb BUI przeprowadzono w trzech AOC (rzeka St. Louis, rzeka Milwaukee i rzeka Sheboygan) oraz w miejscu referencyjnym poza AOC (rzeka Kewaunee) na jeziorach Superior i Michigan, wykorzystując ocenę opartą na badaniu zwłok białego podgrobka (Catostomus commersonii), a następnie analizę mikroskopijną tkanek skóry i wątroby. Ryby zebrano z rzek Milwaukee, Sheboygan i Kewaunee w latach 2012 i 201344, a z rzeki St. Louis – w 2015 roku (niepublikowane dane). Oceniono 200 białych podgrobków z Milwaukee, Kewaunee i St. Louis oraz 193 z Sheboygan.
Z definicji guz może być dowolnym obrzękiem lub wypukłym obszarem, choć powszechnie uważa się, że obrzęk spowodowany nieprawidłowym wzrostem tkanki z komórkami o nieprawidłowej budowie to nowotwór łagodny lub złośliwy. Uklenice białe zebrane ze wszystkich stanowisk wykazywały różnorodne zewnętrzne wypukłe zmiany, w tym małe, odrębne białe plamki, większe białe obszary, lekko wypukłe zmiany śluzowe oraz wielodzielne wypukłe obszary na powierzchni ciała i wargach (Rycina 6). Ryby ważono i mierzono w celu wyznaczenia współczynnika kondycji, rejestrowano nieprawidłowości zewnętrzne i wewnętrzne, a także pobierano próbki tkanki skóry i wątroby do badań histopatologicznych.
<img alt="Papillomatoza u ryb; zmiany makroskopowe na skórze karpi i ogonie, jak pokazano na szczegółowych obrazach badania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
Rycina 6: Uniesione zmiany skórne zaobserwowane u byczka białego z Wielkich Jezior. (A) Odrębna biała plama na powierzchni ciała. Szerokość podziałki = 5 mm. (B) Lekko uniesione zmiany śluzowe (strzałki) i wielodzielne zmiany (a) na tylnej powierzchni ciała. Szerokość podziałki = 1 cm. (C) Duża, wielodzielna zmiana na powierzchni ciała. Szerokość podziałki = 1 cm. (D) Liczne wielodzielne zmiany na wargach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Odsetek ryb z zewnętrznymi guzami lub podniesionymi, przebarwionymi obszarami wahał się od 15,5% w obszarze Milwaukee AOC do 58,0% w obszarze St. Louis AOC. Ogólnie rzecz biorąc, pojedyncze białe plamy były najrzadszymi zmianami widocznymi gołym okiem, podczas gdy zmiany na wargach i powierzchni ciała o wielodolnej strukturze występowały najczęściej. Liczba ryb z widocznymi guzkami wątroby była niska i wahała się od 1,5% w Kewaunee i St. Louis do 2,5% w Milwaukee (Tabela 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Rzeki i lata pobierania próbek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widoczne zmiany</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>St. Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osobne białe plamy</td>
			<td>16</td>
			<td>3</td>
			<td>3,1</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Śluzowate</td>
			<td>20</td>
			<td>9,5</td>
			<td>9,8</td>
			<td>30,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wielodolne</td>
			<td>22,5</td>
			<td>3</td>
			<td>29,5</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Łączna liczba podniesionych zmian skórnycha</td>
			<td>46</td>
			<td>15,5</td>
			<td>38,3</td>
			<td>58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widoczne guzki wątroby</td>
			<td>1,5</td>
			<td>1,5</td>
			<td>1,6</td>
			<td>2,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">aCałkowita liczba ryb z podniesionymi zmianami. Niektóre ryby miały wiele rodzajów zmian.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Obserwacje oparte na badaniach necropsyjnych byczka białego zebranego w obszarach zanieczyszczenia Wielkich Jezior oraz w miejscu referencyjnym (rzeka Kewaunee), przedstawione w procentach. 
Badanie wizualne może służyć do udokumentowania odsetka ryb z różnymi nieprawidłowościami. Jednakże, aby jednoznacznie zdiagnozować występowanie i typ nowotworu, tkanki należy zbadać mikroskopowo (histopatologia). Podczas badania mikroskopowego stwierdzono, że nie wszystkie guzy były nowotworami. Wiele pojedynczych białych plamek oraz zmian śluzowych, szczególnie w Kewaunee, stanowiło zmiany hiperplastyczne, a nie nowotwory (Tabela 2). Dodatkowo, w Kewaunee oraz St. Louis wszystkie zaobserwowane guzy skórne były łagodnymi brodawkami. W Sheboygan i Milwaukee zaobserwowano zarówno brodawki, jak i raka płaskonabłonkowego, czyli złośliwe guzy skóry (Tabela 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Próby rzek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ nowotworu</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>St. Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papilloma</td>
			<td>21</td>
			<td>5,2</td>
			<td>30,5</td>
			<td>37,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rak komórkowy płaskokomórkowy</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2,1</td>
			<td>10,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Łączna liczba nowotworów skóry</td>
			<td>21</td>
			<td>5,2</td>
			<td>32,6</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nowotwory przewodów żółciowycha</td>
			<td>2,5</td>
			<td>4</td>
			<td>6,2</td>
			<td>9,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nowotwory komórkowe wątrobyb</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2,1</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Łączna liczba nowotworów wątroby</td>
			<td>3,5</td>
			<td>4</td>
			<td>8,3</td>
			<td>15,0c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">aW tym cholangioma i cholangiocarcinoma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">bW tym gruczolak komórkowy wątroby i rak komórkowy wątroby</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">cNiektóre ryby miały zarówno nowotwory przewodów żółciowych, jak i wątroby</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Mikroskopowo potwierdzone zmiany nowotworowe u bystrzaka białego zebranego w obszarach dotkniętych problemami w Wielkich Jeziorach oraz na stanowisku referencyjnym (rzeka Kewaunee), przedstawione w procentach. 
Analiza histopatologiczna wykazała również guzy wątroby, których nie stwierdzono podczas obserwacji makroskopowej. Choć jedynie 1,5% ryb zebranych z Kewaunee i St. Louis miało widoczne węzły w wątrobie (Tabela 1), odpowiednio 3,5% i 4,0% miało nowotwory wykryte mikroskopowo (Tabela 2). Większa różnica wystąpiła w Sheboygan (1,6% widocznych vs. 8,3% mikroskopowych) oraz w Milwaukee (2,5% widocznych vs. 15,0% mikroskopowych). Badanie mikroskopowe pozwala ponadto na odróżnienie nowotworów pochodzących z przewodów żółciowych od tych pochodzących z komórek wątrobowych (Tabela 2) oraz na rozróżnienie guzów łagodnych i złośliwych.

Zdrowie dzikich ryb może być używane jako wskaźnik zdrowia ekosystemu wodnego. Oceny stanu zdrowia ryb oparte na sekcji zwłok dostarczają dokumentacji widocznych zmian lub nieprawidłowości, danych wykorzystywanych do obliczania wskaźników stanu, a także możliwości pobrania tkanek do oceny mikroskopowej, ekspresji genów i innych bardziej szczegółowych analiz.

Ocena stanu zdrowia dzikich ryb na podstawie sekcji zwłok

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

Ocena stanu zdrowia ryb oparta na sekcji zwłok jest wykorzystywana do oceny stanu zdrowia dzikich ryb do rutynowego monitorowania, specjalnych badań porównujących miejsca oraz jako podstawa do pobierania tkanek w celu bardziej dogłębnej analizy. Ryby są stale narażone na kombinację czynników stresogennych, takich jak złożone mieszaniny chemikaliów, patogenów i pasożytów. Te kombinacje stresorów mogą prowadzić do niekorzystnych skutków, takich jak zmniejszona odporność na choroby, rak i niewydolność rozrodcza.Zademonstrowane techniki pozwalają na standaryzowaną ocenę widocznych nieprawidłowości oraz pobranie krwi i tkanek do histopatologii, otolitów do wieku i tkanek do innych dalszych analiz. Najpierw zademonstrujemy rutynową ocenę opartą na sekcji zwłok z pobraniem krwi, otolitu i tkanek do histopatologii na jednej rybie. Pobranie przedniej części nerki do testów funkcji immunologicznych oraz wątroby lub innej tkanki do ekspresji genów to dodatki do tej metody, które również zademonstrujemy.Ważne jest, aby pobrać tkanki tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć jakichkolwiek zmian pośmiertnych. Zazwyczaj mamy więc proces na linii montażowej, w którym dwie do trzech osób zbierają tkanki, a ktoś rejestruje dane. Heather Walsh i Cheyenne Smith, doktoranci z Uniwersytetu Wirginii Zachodniej oraz Ryan Braham, świeżo upieczony absolwent studiów doktoranckich, zademonstrują różne etapy tego procesu.Po pobraniu i uśmierceniu ryb zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, zważ i zmierz rybę oraz uzyskaj próbkę krwi. Następnie zmierz całkowitą długość ryby od czubka pyska do końca ogona. Wprowadzić strzykawkę z trzema CC z igłą o rozmiarze 22 lub 23, uprzednio pokrytą heparyną, przed obszarem ogonowym poniżej linii bocznej.Skieruj potrzebę w górę, aż uderzy w kręgosłup i lekko ją wycofaj, aby uzyskać próbkę krwi. Przed przeniesieniem próbki krwi do probówki pobraniowej należy wyjąć igłę i umieścić ją w pojemniku na ostre przedmioty. W przypadku jednodniowych wycieczek krew może być przetrzymywana na mokrym lodzie do czasu powrotu do laboratorium.Następnie jest odwirowywany w celu usunięcia osocza, które było przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Jeśli nie wracasz codziennie do laboratorium, konieczna jest wirówka i przechowywanie suchego lodu. Następnie udokumentuj wszelkie zewnętrzne nieprawidłowości lub zmiany na ciele, płetwach, oczach i skrzelach ryby.Sprawdź ryby pod kątem pasożytów zewnętrznych, takich jak pijawki, larwy, torbiele metacerkaralne przywry i pasożyty skrzelowe. Następnie użyj nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszną od okolicy odbytu do wieczka. Usuń płat mięśniowy, aby odsłonić narządy wewnętrzne.Zbadaj narządy wewnętrzne i udokumentuj ogólne i ogniskowe przebarwienia, obecność wypukłych obszarów, torbieli, pasożytów i nieprawidłowości wielkości. Następnie, aby usunąć wątrobę, przeciąć tętnicę wątrobową i tkankę łączną przedniego końca. Delikatnie wyjmij wątrobę z tuszy i przytnij wszelkie zrosty i połączenia z jelitami i tłuszczem tłuszczowym, uważając, aby nie przebić pęcherzyka żółciowego.Zważ wątrobę. Następnie uzyskaj indeks hepatosomatyczny zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie usuń gonady i zważ je.Ostrożnie, bez ciągnięcia, wytnij małe próbki tkanek. Umieścić próbki tkanek pochodzących od jednej ryby w tym samym pojemniku. Następnie wytnij co najmniej pięć, trzy do czterech milimetrów grubości kawałki z różnych obszarów wątroby i umieść je w pojemniku utrwalającym.W zależności od wielkości umieść całą gonadę lub kawałki gonady w pojemniku utrwalającym. Następnie umieść mniejsze całe narządy i fragmenty innych większych narządów w pojemniku utrwalającym. Jeśli zaobserwuje się jakiekolwiek nieprawidłowe tkanki, zachowaj dodatkowy sąsiedni fragment normalnej tkanki.Liczne struktury, takie jak łuski, płaszczki płetw i otolity, mogą być wykorzystywane do starzenia ryb. Tutaj używamy otolitów, ponieważ są one najdokładniejsze. Najpierw przetnij przesmyk skrzelowy i zegnij głowę do tyłu.Następnie, aby zlokalizować prootyczny pęcherz, usuń tkankę łączną i mięśniową wokół dolnych części neurokraniumu. Użyj noża do kości, aby rozbić prootyczną bullę i odsłonić otolity. Otolity powinny być widoczne gołym okiem.Umieść otolity w oznakowanej, niezamkniętej fiolce i przechowuj je w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będzie można przeprowadzić analizę wieku. Narażenie na liczne chemikalia i inne stresory środowiskowe może powodować immunosupresję. Limfocyty, makrofagi i granulocyty można wyizolować z tej tkanki, a w laboratorium można zmierzyć ich zdolność do zabijania patogenów, wytwarzania przeciwciał, reagowania na komórki nowotworowe i innych funkcji.Za pomocą sterylnych nożyczek, skalpela i kleszczyków usuń przednią tkankę nerki. Umieść próbkę przedniej nerki w odpowiednim podłożu, aby utrzymać komórki przy życiu. Użyj sterylnego ręcznego młynka do tkanek, aby homogenizować próbkę do zawiesin jednokomórkowych.I trzymaj próbki na mokrym lodzie. W celu zachowania RNA umieść dwa do trzech małych kawałków wątroby w odpowiednim środku konserwującym w stosunku 10 do jednego środka konserwującego do tkanki. W tym badaniu białe odrosty zebrano z trzech obszarów obaw Wielkich Jezior (AOC) oraz z miejsca referencyjnego rzeki Kewanee.Odsetek ryb z guzami zewnętrznymi wahał się od 15,5% w AOC St.Louis do 58% w AOC w Milwaukee. Zaobserwowano kilka rodzajów zmian zewnętrznych, w tym dyskretne białe plamy, lekko wypukłe zmiany śluzowe i duże zmiany brodawczakowate. Wiele z dyskretnych białych plam i zmian śluzowych zaobserwowanych w tym badaniu, szczególnie w miejscu referencyjnym Kewanee, było zmianami hiperplastycznymi, a nie nowotworowymi.Analiza histopatologiczna zidentyfikowała również guzy wątroby, których nie można było zidentyfikować za pomocą obserwacji wzrokowej. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 15 do 20 minut na rybę, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby wiedzieć, co jest normalne dla danego gatunku i być tak konsekwentnym i dokładnym, jak to tylko możliwe, w opisywaniu nieprawidłowości.Uwzględnij rozmiar, kolor, teksturę i lokalizację. Przydatna jest dokumentacja fotograficzna. Technika ta może być stosowana w przypadku każdego gatunku ryb i jest przydatna do dokumentowania zdrowia ryb zarówno przestrzennie, jak i czasowo, aby lepiej zrozumieć niekorzystne skutki stresorów środowiskowych i zidentyfikować choroby inwazyjne.

necropsy-based-wild-fish-health-assessment

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Życie większości ryb opiera się na pływaniu. Niniejszy protokół opisuje techniki rejestrowania różnych sposobów pływania dostępnych dla pojedynczych osobników oraz ławic ryb, a także zawiera mierniki związane z fizjologią i zachowaniem podczas pływania.

Ocena wydajności pływania u ryb

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Ten protokół opisuje użycie wymazów z miski olejowej i analizy osadu w systemach danio pręgowanego, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności w porównaniu do samego użycia wartowników do wykrywania patogenów, takich jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa. Zaproponowano również system monitorowania jaj P. tomentosa w kwarantannie.

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Tutaj prezentujemy metody wysokoprzepustowego badania szeregu zachowań meksykańskich ryb jaskiniowych i istotnego barwienia systemu mechanosensorycznego. Metody te wykorzystują wolne oprogramowanie i niestandardowe skrypty, zapewniając praktyczną i opłacalną metodę badania zachowań.

Śledzenie behawioralne i obrazowanie neuromastu meksykańskich ryb jaskiniowych

To jest protokół do modelowania spektrum wielkości (relacji skalowania między indywidualną masą a gęstością populacji) dla połączonych danych o rybach i bezkręgowcach ze strumieni i rzek, w których można brodzić. Metody obejmują: techniki terenowe do ilościowego pobierania próbek ryb i bezkręgowców; metody laboratoryjne do standaryzacji danych terenowych; i statystyczna analiza danych.

Modelowanie spektrum wielkości makrobezkręgowców i ryb w ekosystemach strumieni

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Ten manuskrypt opisuje izolację i utrwalanie leukocytów pobranych z nerki głowy dorady oraz ocenę ich żywotności za pomocą cytometrii przepływowej. Prace te przyczyniają się do standaryzacji protokołów i wykorzystują przetwarzanie większej liczby próbek bez uszczerbku dla jakości próbek, promując postęp w wiedzy na temat immunologii ryb.

Izolacja, utrwalenie i charakterystyka młodocianych leukocytów nerkowych dorady za pomocą cytometrii przepływowej

Ten test biologiczny wykorzystuje model drapieżnej ryby do oceny obecności metabolitów odstraszających od karmienia z organicznych ekstraktów tkanek organizmów morskich w naturalnych stężeniach przy użyciu porównywalnej pod względem odżywczym matrycy pokarmowej.

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

Naucz się oceny stanu zdrowia dzikich ryb metodą sekcji zwłok w celu monitorowania ekosystemów wodnych. Technika obejmuje dokumentację zmian zewnętrznych, pobieranie krwi i tkanek do histopatologii oraz analizę otolitów.

Ocena stanu zdrowia dzikich ryb na podstawie sekcji zwłok

Przeglądaj więcej filmów