Ocena stanu zdrowia dzikich ryb na podstawie sekcji zwłok

Ocena stanu zdrowia ryb oparta na sekcji zwłok jest wykorzystywana do oceny stanu zdrowia dzikich ryb do rutynowego monitorowania, specjalnych badań porównujących miejsca oraz jako podstawa do pobierania tkanek w celu bardziej dogłębnej analizy. Ryby są stale narażone na kombinację czynników stresogennych, takich jak złożone mieszaniny chemikaliów, patogenów i pasożytów. Te kombinacje stresorów mogą prowadzić do niekorzystnych skutków, takich jak zmniejszona odporność na choroby, rak i niewydolność rozrodcza.

Zademonstrowane techniki pozwalają na standaryzowaną ocenę widocznych nieprawidłowości oraz pobranie krwi i tkanek do histopatologii, otolitów do wieku i tkanek do innych dalszych analiz. Najpierw zademonstrujemy rutynową ocenę opartą na sekcji zwłok z pobraniem krwi, otolitu i tkanek do histopatologii na jednej rybie. Pobranie przedniej części nerki do testów funkcji immunologicznych oraz wątroby lub innej tkanki do ekspresji genów to dodatki do tej metody, które również zademonstrujemy.

Ważne jest, aby pobrać tkanki tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć jakichkolwiek zmian pośmiertnych. Zazwyczaj mamy więc proces na linii montażowej, w którym dwie do trzech osób zbierają tkanki, a ktoś rejestruje dane. Heather Walsh i Cheyenne Smith, doktoranci z Uniwersytetu Wirginii Zachodniej oraz Ryan Braham, świeżo upieczony absolwent studiów doktoranckich, zademonstrują różne etapy tego procesu.

Po pobraniu i uśmierceniu ryb zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, zważ i zmierz rybę oraz uzyskaj próbkę krwi. Następnie zmierz całkowitą długość ryby od czubka pyska do końca ogona. Wprowadzić strzykawkę z trzema CC z igłą o rozmiarze 22 lub 23, uprzednio pokrytą heparyną, przed obszarem ogonowym poniżej linii bocznej.

Skieruj potrzebę w górę, aż uderzy w kręgosłup i lekko ją wycofaj, aby uzyskać próbkę krwi. Przed przeniesieniem próbki krwi do probówki pobraniowej należy wyjąć igłę i umieścić ją w pojemniku na ostre przedmioty. W przypadku jednodniowych wycieczek krew może być przetrzymywana na mokrym lodzie do czasu powrotu do laboratorium.

Następnie jest odwirowywany w celu usunięcia osocza, które było przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Jeśli nie wracasz codziennie do laboratorium, konieczna jest wirówka i przechowywanie suchego lodu. Następnie udokumentuj wszelkie zewnętrzne nieprawidłowości lub zmiany na ciele, płetwach, oczach i skrzelach ryby.

Sprawdź ryby pod kątem pasożytów zewnętrznych, takich jak pijawki, larwy, torbiele metacerkaralne przywry i pasożyty skrzelowe. Następnie użyj nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszną od okolicy odbytu do wieczka. Usuń płat mięśniowy, aby odsłonić narządy wewnętrzne.

Zbadaj narządy wewnętrzne i udokumentuj ogólne i ogniskowe przebarwienia, obecność wypukłych obszarów, torbieli, pasożytów i nieprawidłowości wielkości. Następnie, aby usunąć wątrobę, przeciąć tętnicę wątrobową i tkankę łączną przedniego końca. Delikatnie wyjmij wątrobę z tuszy i przytnij wszelkie zrosty i połączenia z jelitami i tłuszczem tłuszczowym, uważając, aby nie przebić pęcherzyka żółciowego.

Zważ wątrobę. Następnie uzyskaj indeks hepatosomatyczny zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie usuń gonady i zważ je.

Ostrożnie, bez ciągnięcia, wytnij małe próbki tkanek. Umieścić próbki tkanek pochodzących od jednej ryby w tym samym pojemniku. Następnie wytnij co najmniej pięć, trzy do czterech milimetrów grubości kawałki z różnych obszarów wątroby i umieść je w pojemniku utrwalającym.

W zależności od wielkości umieść całą gonadę lub kawałki gonady w pojemniku utrwalającym. Następnie umieść mniejsze całe narządy i fragmenty innych większych narządów w pojemniku utrwalającym. Jeśli zaobserwuje się jakiekolwiek nieprawidłowe tkanki, zachowaj dodatkowy sąsiedni fragment normalnej tkanki.

Liczne struktury, takie jak łuski, płaszczki płetw i otolity, mogą być wykorzystywane do starzenia ryb. Tutaj używamy otolitów, ponieważ są one najdokładniejsze. Najpierw przetnij przesmyk skrzelowy i zegnij głowę do tyłu.

Następnie, aby zlokalizować prootyczny pęcherz, usuń tkankę łączną i mięśniową wokół dolnych części neurokraniumu. Użyj noża do kości, aby rozbić prootyczną bullę i odsłonić otolity. Otolity powinny być widoczne gołym okiem.

Umieść otolity w oznakowanej, niezamkniętej fiolce i przechowuj je w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będzie można przeprowadzić analizę wieku. Narażenie na liczne chemikalia i inne stresory środowiskowe może powodować immunosupresję. Limfocyty, makrofagi i granulocyty można wyizolować z tej tkanki, a w laboratorium można zmierzyć ich zdolność do zabijania patogenów, wytwarzania przeciwciał, reagowania na komórki nowotworowe i innych funkcji.

Za pomocą sterylnych nożyczek, skalpela i kleszczyków usuń przednią tkankę nerki. Umieść próbkę przedniej nerki w odpowiednim podłożu, aby utrzymać komórki przy życiu. Użyj sterylnego ręcznego młynka do tkanek, aby homogenizować próbkę do zawiesin jednokomórkowych.

I trzymaj próbki na mokrym lodzie. W celu zachowania RNA umieść dwa do trzech małych kawałków wątroby w odpowiednim środku konserwującym w stosunku 10 do jednego środka konserwującego do tkanki. W tym badaniu białe odrosty zebrano z trzech obszarów obaw Wielkich Jezior (AOC) oraz z miejsca referencyjnego rzeki Kewanee.

Odsetek ryb z guzami zewnętrznymi wahał się od 15,5% w AOC St.Louis do 58% w AOC w Milwaukee. Zaobserwowano kilka rodzajów zmian zewnętrznych, w tym dyskretne białe plamy, lekko wypukłe zmiany śluzowe i duże zmiany brodawczakowate. Wiele z dyskretnych białych plam i zmian śluzowych zaobserwowanych w tym badaniu, szczególnie w miejscu referencyjnym Kewanee, było zmianami hiperplastycznymi, a nie nowotworowymi.

Analiza histopatologiczna zidentyfikowała również guzy wątroby, których nie można było zidentyfikować za pomocą obserwacji wzrokowej. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 15 do 20 minut na rybę, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby wiedzieć, co jest normalne dla danego gatunku i być tak konsekwentnym i dokładnym, jak to tylko możliwe, w opisywaniu nieprawidłowości.

Uwzględnij rozmiar, kolor, teksturę i lokalizację. Przydatna jest dokumentacja fotograficzna. Technika ta może być stosowana w przypadku każdego gatunku ryb i jest przydatna do dokumentowania zdrowia ryb zarówno przestrzennie, jak i czasowo, aby lepiej zrozumieć niekorzystne skutki stresorów środowiskowych i zidentyfikować choroby inwazyjne.