Biodetekcja optyczna
Biosensory optyczne wykorzystują światło do wykrywania wiązania cząsteczki docelowej. Czujniki te mogą wykorzystywać cząsteczkę etykiety, która wytwar…
Biosensory optyczne to czujniki, które wykrywają cel biologiczny lub cele zainteresowania za pomocą światła. Urządzenia te znalazły zastosowanie w opiece zdrowotnej, farmacji, monitorowaniu środowiska, bezpieczeństwie wewnętrznym, a nawet na polu bitwy. Biosensory optyczne dzielą się na czujniki oparte na etykietach i czujniki bez etykiet. Przykładem wykrywania opartego na znacznikach jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która wykorzystuje znaczniki fluorescencyjne lub fluorofory do ilościowego określenia amplifikowanego docelowego DNA. Przykładem metody bezznacznikowej jest powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR). W tym przypadku niezmieniona interakcja biomolekuł z powierzchnią czujnika jest określana ilościowo poprzez pomiar podstawowej cechy czujnika, takiej jak kąt odbicia. W tym filmie omówiono podstawy obu tych rodzajów technik biodetekcji optycznej i jej krytycznych elementów, zasady działania i typowe zastosowania biosensorów optycznych.
Po pierwsze, przyjrzyjmy się ogólnym zasadom biodetekcji optycznej opartej na etykietach. Zazwyczaj sonda lub element biorozpoznający, taki jak uzupełniające przeciwciało, jest mocowany na powierzchni czujnika przy użyciu tradycyjnej chemii unieruchamiającej. Roztwór próbki jest następnie przepływany przez powierzchnię czujników. Cząsteczka docelowa, która jest komplementarna w stosunku do unieruchomionego elementu biorozpoznającego, jest selektywnie wychwytywana ze złożonego roztworu próbki. Następnie nadmiar roztworu próbki zmywa się buforem lub wodą. Następnie, aby pomóc w wizualizacji i ilościowym określeniu ilości związanego celu, przez system przepływa cząsteczka wtórna, która jest komplementarna do celu i przyłączona do fluoroforu. Po pewnym czasie, gdy nastąpiło związanie cząsteczki wtórnej z celem, nadmiar niezwiązanego fluoroforu jest wypłukiwany. Intensywność związanego fluoroforu można następnie określić ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Intensywność ta jest najpierw wykreślana dla różnych znanych stężeń docelowych w celu utworzenia krzywej kalibracyjnej, która następnie pozwala na bezpośredni pomiar nieznanej ilości przechwyconego celu. W związku z tym techniki oparte na znakowaniu wykorzystują intensywność fluorescencji niezwykle czułych fluoroforów do ilościowego określenia stężenia biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu zasad działania biosensorów optycznych opartych na znacznikach, przyjrzyjmy się powszechnie używanemu przykładowi, obecnemu standardowi amplifikacji DNA, ilościowego PCR lub qPCR. Mieszanina reakcyjna qPCR zawiera znakowaną sondę do ilościowego określania reakcji w czasie rzeczywistym. Sekwencja sondy jest przyłączona zarówno do fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych, jak i wygaszających i wiąże się z określoną sekwencją DNA. Cząsteczka wygaszająca wygasza emisję fluoroforu, podczas gdy obie są podłączone do sondy. Podczas reakcji PCR enzym polimeraza degraduje DNA sondy i fizycznie oddziela reporter fluoroforu, zapobiegając w ten sposób wygaszaniu i powodując wzrost fluorescencji. Aby wykonać qPCR, najpierw dodaj wszystkie składniki reakcji, w tym znakowane sondy, do probówki lub studzienki PCR. Następnie umieść dołki PCR w specjalistycznym termocyklerze i wprowadź parametry dla każdego cyklu oraz liczbę cykli. Termocykler używany do qPCR zawiera źródło światła z niezbędnymi elementami optycznymi do wyboru długości fali oraz detektor do pomiaru intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym podczas reakcji PCR. Pod koniec każdego cyklu termicznego rejestruje się i wykreśla intensywność fluorescencji spowodowaną uwolnionymi fluoroforami. Intensywność fluorescencji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia docelowego w studzience reakcyjnej, a zatem dla znanej fluorescencji można obliczyć nieznane stężenie docelowe.
Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób można osiągnąć wykrywanie bez reporterów, takich jak fluorofory, przy użyciu bezznacznikowych technik wykrywania optycznego. W przypadku technik bezznacznikowych unieruchomienie elementu biorozpoznania jest takie samo jak w przypadku techniki opartej na znakowaniu. Każde przyłączenie biomolekuły do powierzchni tych czujników modyfikuje współczynnik załamania światła w bezpośrednim sąsiedztwie urządzenia optycznego. Cząsteczki docelowe wiążą się z powierzchnią funkcjonalizowanego urządzenia optycznego, tworząc cienką warstwę i dalej modyfikując współczynnik załamania światła. Te zmiany indeksu załamania światła można monitorować, śledząc zmianę częstotliwości drgań własnych lub częstotliwości rezonansowej systemu. Różnica w częstotliwościach rezonansowych przed i po związaniu celu, zwana przesunięciem f, jest wprost proporcjonalna do stężenia uchwyconego celu.
Przyjrzyjmy się teraz podstawowym zasadom powszechnie stosowanej techniki wykrywania optycznego bez etykiet, powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub SPR. Typowy instrument SPR łączy w sobie ruchome źródło laserowe, detektor optyczny do pomiaru przesunięcia intensywności oraz chip czujnika ze szklanym pryzmatem pokrytym z jednej strony złotem. Pokryty złotem pryzmat jest zintegrowany z układem fluidycznym umożliwiającym pracę przepływową. W eksperymencie cząsteczka sondy lub element biorozpoznający jest przymocowany do powierzchni złota. Element docelowy przepływa następnie po powierzchni i wiąże się z unieruchomioną sondą. Wykrywanie wykorzystuje zjawisko SPR. Dzieje się tak, gdy światło spolaryzowane jest wyświetlane na powierzchni metalu, takiego jak złoto, pod określonym kątem, theta SPR. Powoduje to generowanie plazmonów powierzchniowych, które są koherentnymi oscylacjami elektronów, które występują na granicy dwóch materiałów, które mają przenikalność o przeciwnych znakach. Gdy masa przyłączona do powierzchni czujnika zmienia się, zmienia się warunek rezonansowy plazmonów powierzchniowych. W rezultacie, gdy na powierzchni związany jest tylko element biorozpoznający, wiązka jest odbijana pod jednym kątem, theta. Następnie, gdy do powierzchni przyczepi się większa masa, taka jak przechwycony cel, obserwuje się zmniejszenie intensywności odbitego światła pod określonym kątem, obserwuje się theta SPR, ponieważ kąt odbicia zmienia się na theta dwa. Zmiana natężenia światła odbitego pod kątem rezonansowym, theta SPR, jest wtedy funkcją kąta odbitego światła i może być mierzona jako różnica kątów, theta jeden i theta dwa.
Teraz, gdy omówiliśmy zasady i procedury stojące za biosensorami optycznymi, zobaczmy, jak naukowcy stosują te techniki dzisiaj. Cytometr z komórkami przepływowymi to optyczny system biodetekcji, który jest powszechnie stosowany do liczenia komórek i pomiaru wielu innych właściwości i składników komórkowych. Próbka składająca się z wielu typów komórek, z których każda jest oznaczona unikalnym fluoroforem, jest przygotowywana w zawiesinie. Następnie próbka jest przepuszczana przez cytometr przepływowy w taki sposób, aby komórki przebiegały pojedynczo obok wiązki laserowej. Gdy każda komórka przechodzi przez wiązkę laserową, rozproszone i emitowane światło fluorescencyjne przez różne fluorofory jest oddzielnie oznaczane ilościowo, co daje bezpośrednie zliczanie różnych typów komórek w próbce. Innym zastosowaniem biosensorów optycznych jest wykrywanie bakterii w próbkach. Jednym ze sposobów na to jest użycie czujników rezonatora z pierścieniem optycznym. Składają się z zamkniętej pętli sprzężonej z falowodami wejściowymi i wyjściowymi światła. Gdy światło o długości fali rezonansowej jest przykładane do falodołu wejściowego, przechodzi przez pętlę i zwiększa intensywność w ciągu wielu rund z powodu konstruktywnych zakłóceń i jest wyprowadzane do falodołu wyjściowego. Przeciwciała specyficzne dla bakteryjnych białek powierzchniowych są unieruchamiane na powierzchni rezonatora pierścieniowego i uzyskuje się podstawowe widmo absorpcyjne. Następnie próbka bakteryjna jest przepływana na powierzchnię rezonatora, aby umożliwić wiązanie się bakterii z unieruchomionym ciałem, po czym uzyskuje się drugie widmo absorpcyjne. Jeśli interesująca nas bakteria zwiąże się, obserwuje się widoczne przesunięcie pików rezonansowych, które jest wprost proporcjonalne do stężenia docelowych bakterii.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat biodetekcji optycznej. Omówiliśmy podstawowe zasady wykrywania optycznego zarówno opartego na etykietach, jak i bezetykietowego, wraz z dwoma wybitnymi przykładami tych metod i niektórymi zastosowaniami tych technik. Dzięki za oglądanie.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Biosensory optyczne to czujniki, które wykrywają cel biologiczny lub cele zainteresowania za pomocą światła. Urządzenia te znalazły zastosowanie w opiece zdrowotnej, farmacji, monitorowaniu środowiska, bezpieczeństwie wewnętrznym, a nawet na polu bitwy. Biosensory optyczne dzielą się na czujniki oparte na etykietach i czujniki bez etykiet. Przykładem wykrywania opartego na znacznikach jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która wykorzystuje znaczniki fluorescencyjne lub fluorofory do ilościowego określenia amplifikowanego docelowego DNA. Przykładem metody bezznacznikowej jest powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR). W tym przypadku niezmieniona interakcja biomolekuł z powierzchnią czujnika jest określana ilościowo poprzez pomiar podstawowej cechy czujnika, takiej jak kąt odbicia. W tym filmie omówiono podstawy obu tych rodzajów technik biodetekcji optycznej i jej krytycznych elementów, zasady działania i typowe zastosowania biosensorów optycznych.
Po pierwsze, przyjrzyjmy się ogólnym zasadom biodetekcji optycznej opartej na etykietach. Zazwyczaj sonda lub element biorozpoznający, taki jak uzupełniające przeciwciało, jest mocowany na powierzchni czujnika przy użyciu tradycyjnej chemii unieruchamiającej. Roztwór próbki jest następnie przepływany przez powierzchnię czujników. Cząsteczka docelowa, która jest komplementarna w stosunku do unieruchomionego elementu biorozpoznającego, jest selektywnie wychwytywana ze złożonego roztworu próbki. Następnie nadmiar roztworu próbki zmywa się buforem lub wodą. Następnie, aby pomóc w wizualizacji i ilościowym określeniu ilości związanego celu, przez system przepływa cząsteczka wtórna, która jest komplementarna do celu i przyłączona do fluoroforu. Po pewnym czasie, gdy nastąpiło związanie cząsteczki wtórnej z celem, nadmiar niezwiązanego fluoroforu jest wypłukiwany. Intensywność związanego fluoroforu można następnie określić ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Intensywność ta jest najpierw wykreślana dla różnych znanych stężeń docelowych w celu utworzenia krzywej kalibracyjnej, która następnie pozwala na bezpośredni pomiar nieznanej ilości przechwyconego celu. W związku z tym techniki oparte na znakowaniu wykorzystują intensywność fluorescencji niezwykle czułych fluoroforów do ilościowego określenia stężenia biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu zasad działania biosensorów optycznych opartych na znacznikach, przyjrzyjmy się powszechnie używanemu przykładowi, obecnemu standardowi amplifikacji DNA, ilościowego PCR lub qPCR. Mieszanina reakcyjna qPCR zawiera znakowaną sondę do ilościowego określania reakcji w czasie rzeczywistym. Sekwencja sondy jest przyłączona zarówno do fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych, jak i wygaszających i wiąże się z określoną sekwencją DNA. Cząsteczka wygaszająca wygasza emisję fluoroforu, podczas gdy obie są podłączone do sondy. Podczas reakcji PCR enzym polimeraza degraduje DNA sondy i fizycznie oddziela reporter fluoroforu, zapobiegając w ten sposób wygaszaniu i powodując wzrost fluorescencji. Aby wykonać qPCR, najpierw dodaj wszystkie składniki reakcji, w tym znakowane sondy, do probówki lub studzienki PCR. Następnie umieść dołki PCR w specjalistycznym termocyklerze i wprowadź parametry dla każdego cyklu oraz liczbę cykli. Termocykler używany do qPCR zawiera źródło światła z niezbędnymi elementami optycznymi do wyboru długości fali oraz detektor do pomiaru intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym podczas reakcji PCR. Pod koniec każdego cyklu termicznego rejestruje się i wykreśla intensywność fluorescencji spowodowaną uwolnionymi fluoroforami. Intensywność fluorescencji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia docelowego w studzience reakcyjnej, a zatem dla znanej fluorescencji można obliczyć nieznane stężenie docelowe.
Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób można osiągnąć wykrywanie bez reporterów, takich jak fluorofory, przy użyciu bezznacznikowych technik wykrywania optycznego. W przypadku technik bezznacznikowych unieruchomienie elementu biorozpoznania jest takie samo jak w przypadku techniki opartej na znakowaniu. Każde przyłączenie biomolekuły do powierzchni tych czujników modyfikuje współczynnik załamania światła w bezpośrednim sąsiedztwie urządzenia optycznego. Cząsteczki docelowe wiążą się z powierzchnią funkcjonalizowanego urządzenia optycznego, tworząc cienką warstwę i dalej modyfikując współczynnik załamania światła. Te zmiany indeksu załamania światła można monitorować, śledząc zmianę częstotliwości drgań własnych lub częstotliwości rezonansowej systemu. Różnica w częstotliwościach rezonansowych przed i po związaniu celu, zwana przesunięciem f, jest wprost proporcjonalna do stężenia uchwyconego celu.
Przyjrzyjmy się teraz podstawowym zasadom powszechnie stosowanej techniki wykrywania optycznego bez etykiet, powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub SPR. Typowy instrument SPR łączy w sobie ruchome źródło laserowe, detektor optyczny do pomiaru przesunięcia intensywności oraz chip czujnika ze szklanym pryzmatem pokrytym z jednej strony złotem. Pokryty złotem pryzmat jest zintegrowany z układem fluidycznym umożliwiającym pracę przepływową. W eksperymencie cząsteczka sondy lub element biorozpoznający jest przymocowany do powierzchni złota. Element docelowy przepływa następnie po powierzchni i wiąże się z unieruchomioną sondą. Wykrywanie wykorzystuje zjawisko SPR. Dzieje się tak, gdy światło spolaryzowane jest wyświetlane na powierzchni metalu, takiego jak złoto, pod określonym kątem, theta SPR. Powoduje to generowanie plazmonów powierzchniowych, które są koherentnymi oscylacjami elektronów, które występują na granicy dwóch materiałów, które mają przenikalność o przeciwnych znakach. Gdy masa przyłączona do powierzchni czujnika zmienia się, zmienia się warunek rezonansowy plazmonów powierzchniowych. W rezultacie, gdy na powierzchni związany jest tylko element biorozpoznający, wiązka jest odbijana pod jednym kątem, theta. Następnie, gdy do powierzchni przyczepi się większa masa, taka jak przechwycony cel, obserwuje się zmniejszenie intensywności odbitego światła pod określonym kątem, obserwuje się theta SPR, ponieważ kąt odbicia zmienia się na theta dwa. Zmiana natężenia światła odbitego pod kątem rezonansowym, theta SPR, jest wtedy funkcją kąta odbitego światła i może być mierzona jako różnica kątów, theta jeden i theta dwa.
Teraz, gdy omówiliśmy zasady i procedury stojące za biosensorami optycznymi, zobaczmy, jak naukowcy stosują te techniki dzisiaj. Cytometr z komórkami przepływowymi to optyczny system biodetekcji, który jest powszechnie stosowany do liczenia komórek i pomiaru wielu innych właściwości i składników komórkowych. Próbka składająca się z wielu typów komórek, z których każda jest oznaczona unikalnym fluoroforem, jest przygotowywana w zawiesinie. Następnie próbka jest przepuszczana przez cytometr przepływowy w taki sposób, aby komórki przebiegały pojedynczo obok wiązki laserowej. Gdy każda komórka przechodzi przez wiązkę laserową, rozproszone i emitowane światło fluorescencyjne przez różne fluorofory jest oddzielnie oznaczane ilościowo, co daje bezpośrednie zliczanie różnych typów komórek w próbce. Innym zastosowaniem biosensorów optycznych jest wykrywanie bakterii w próbkach. Jednym ze sposobów na to jest użycie czujników rezonatora z pierścieniem optycznym. Składają się z zamkniętej pętli sprzężonej z falowodami wejściowymi i wyjściowymi światła. Gdy światło o długości fali rezonansowej jest przykładane do falodołu wejściowego, przechodzi przez pętlę i zwiększa intensywność w ciągu wielu rund z powodu konstruktywnych zakłóceń i jest wyprowadzane do falodołu wyjściowego. Przeciwciała specyficzne dla bakteryjnych białek powierzchniowych są unieruchamiane na powierzchni rezonatora pierścieniowego i uzyskuje się podstawowe widmo absorpcyjne. Następnie próbka bakteryjna jest przepływana na powierzchnię rezonatora, aby umożliwić wiązanie się bakterii z unieruchomionym ciałem, po czym uzyskuje się drugie widmo absorpcyjne. Jeśli interesująca nas bakteria zwiąże się, obserwuje się widoczne przesunięcie pików rezonansowych, które jest wprost proporcjonalne do stężenia docelowych bakterii.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat biodetekcji optycznej. Omówiliśmy podstawowe zasady wykrywania optycznego zarówno opartego na etykietach, jak i bezetykietowego, wraz z dwoma wybitnymi przykładami tych metod i niektórymi zastosowaniami tych technik. Dzięki za oglądanie.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.