1: Biodetekcja optyczna

Biosensory optyczne to czujniki, które wykrywają cel biologiczny lub cele zainteresowania za pomocą światła. Urządzenia te znalazły zastosowanie w opiece zdrowotnej, farmacji, monitorowaniu środowiska, bezpieczeństwie wewnętrznym, a nawet na polu bitwy. Biosensory optyczne dzielą się na czujniki oparte na etykietach i czujniki bez etykiet. Przykładem wykrywania opartego na znacznikach jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która wykorzystuje znaczniki fluorescencyjne lub fluorofory do ilościowego określenia amplifikowanego docelowego DNA. Przykładem metody bezznacznikowej jest powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR). W tym przypadku niezmieniona interakcja biomolekuł z powierzchnią czujnika jest określana ilościowo poprzez pomiar podstawowej cechy czujnika, takiej jak kąt odbicia. W tym filmie omówiono podstawy obu tych rodzajów technik biodetekcji optycznej i jej krytycznych elementów, zasady działania i typowe zastosowania biosensorów optycznych.

Po pierwsze, przyjrzyjmy się ogólnym zasadom biodetekcji optycznej opartej na etykietach. Zazwyczaj sonda lub element biorozpoznający, taki jak uzupełniające przeciwciało, jest mocowany na powierzchni czujnika przy użyciu tradycyjnej chemii unieruchamiającej. Roztwór próbki jest następnie przepływany przez powierzchnię czujników. Cząsteczka docelowa, która jest komplementarna w stosunku do unieruchomionego elementu biorozpoznającego, jest selektywnie wychwytywana ze złożonego roztworu próbki. Następnie nadmiar roztworu próbki zmywa się buforem lub wodą. Następnie, aby pomóc w wizualizacji i ilościowym określeniu ilości związanego celu, przez system przepływa cząsteczka wtórna, która jest komplementarna do celu i przyłączona do fluoroforu. Po pewnym czasie, gdy nastąpiło związanie cząsteczki wtórnej z celem, nadmiar niezwiązanego fluoroforu jest wypłukiwany. Intensywność związanego fluoroforu można następnie określić ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Intensywność ta jest najpierw wykreślana dla różnych znanych stężeń docelowych w celu utworzenia krzywej kalibracyjnej, która następnie pozwala na bezpośredni pomiar nieznanej ilości przechwyconego celu. W związku z tym techniki oparte na znakowaniu wykorzystują intensywność fluorescencji niezwykle czułych fluoroforów do ilościowego określenia stężenia biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania.

Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu zasad działania biosensorów optycznych opartych na znacznikach, przyjrzyjmy się powszechnie używanemu przykładowi, obecnemu standardowi amplifikacji DNA, ilościowego PCR lub qPCR. Mieszanina reakcyjna qPCR zawiera znakowaną sondę do ilościowego określania reakcji w czasie rzeczywistym. Sekwencja sondy jest przyłączona zarówno do fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych, jak i wygaszających i wiąże się z określoną sekwencją DNA. Cząsteczka wygaszająca wygasza emisję fluoroforu, podczas gdy obie są podłączone do sondy. Podczas reakcji PCR enzym polimeraza degraduje DNA sondy i fizycznie oddziela reporter fluoroforu, zapobiegając w ten sposób wygaszaniu i powodując wzrost fluorescencji. Aby wykonać qPCR, najpierw dodaj wszystkie składniki reakcji, w tym znakowane sondy, do probówki lub studzienki PCR. Następnie umieść dołki PCR w specjalistycznym termocyklerze i wprowadź parametry dla każdego cyklu oraz liczbę cykli. Termocykler używany do qPCR zawiera źródło światła z niezbędnymi elementami optycznymi do wyboru długości fali oraz detektor do pomiaru intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym podczas reakcji PCR. Pod koniec każdego cyklu termicznego rejestruje się i wykreśla intensywność fluorescencji spowodowaną uwolnionymi fluoroforami. Intensywność fluorescencji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia docelowego w studzience reakcyjnej, a zatem dla znanej fluorescencji można obliczyć nieznane stężenie docelowe.

Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób można osiągnąć wykrywanie bez reporterów, takich jak fluorofory, przy użyciu bezznacznikowych technik wykrywania optycznego. W przypadku technik bezznacznikowych unieruchomienie elementu biorozpoznania jest takie samo jak w przypadku techniki opartej na znakowaniu. Każde przyłączenie biomolekuły do powierzchni tych czujników modyfikuje współczynnik załamania światła w bezpośrednim sąsiedztwie urządzenia optycznego. Cząsteczki docelowe wiążą się z powierzchnią funkcjonalizowanego urządzenia optycznego, tworząc cienką warstwę i dalej modyfikując współczynnik załamania światła. Te zmiany indeksu załamania światła można monitorować, śledząc zmianę częstotliwości drgań własnych lub częstotliwości rezonansowej systemu. Różnica w częstotliwościach rezonansowych przed i po związaniu celu, zwana przesunięciem f, jest wprost proporcjonalna do stężenia uchwyconego celu.

Przyjrzyjmy się teraz podstawowym zasadom powszechnie stosowanej techniki wykrywania optycznego bez etykiet, powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub SPR. Typowy instrument SPR łączy w sobie ruchome źródło laserowe, detektor optyczny do pomiaru przesunięcia intensywności oraz chip czujnika ze szklanym pryzmatem pokrytym z jednej strony złotem. Pokryty złotem pryzmat jest zintegrowany z układem fluidycznym umożliwiającym pracę przepływową. W eksperymencie cząsteczka sondy lub element biorozpoznający jest przymocowany do powierzchni złota. Element docelowy przepływa następnie po powierzchni i wiąże się z unieruchomioną sondą. Wykrywanie wykorzystuje zjawisko SPR. Dzieje się tak, gdy światło spolaryzowane jest wyświetlane na powierzchni metalu, takiego jak złoto, pod określonym kątem, theta SPR. Powoduje to generowanie plazmonów powierzchniowych, które są koherentnymi oscylacjami elektronów, które występują na granicy dwóch materiałów, które mają przenikalność o przeciwnych znakach. Gdy masa przyłączona do powierzchni czujnika zmienia się, zmienia się warunek rezonansowy plazmonów powierzchniowych. W rezultacie, gdy na powierzchni związany jest tylko element biorozpoznający, wiązka jest odbijana pod jednym kątem, theta. Następnie, gdy do powierzchni przyczepi się większa masa, taka jak przechwycony cel, obserwuje się zmniejszenie intensywności odbitego światła pod określonym kątem, obserwuje się theta SPR, ponieważ kąt odbicia zmienia się na theta dwa. Zmiana natężenia światła odbitego pod kątem rezonansowym, theta SPR, jest wtedy funkcją kąta odbitego światła i może być mierzona jako różnica kątów, theta jeden i theta dwa.

Teraz, gdy omówiliśmy zasady i procedury stojące za biosensorami optycznymi, zobaczmy, jak naukowcy stosują te techniki dzisiaj. Cytometr z komórkami przepływowymi to optyczny system biodetekcji, który jest powszechnie stosowany do liczenia komórek i pomiaru wielu innych właściwości i składników komórkowych. Próbka składająca się z wielu typów komórek, z których każda jest oznaczona unikalnym fluoroforem, jest przygotowywana w zawiesinie. Następnie próbka jest przepuszczana przez cytometr przepływowy w taki sposób, aby komórki przebiegały pojedynczo obok wiązki laserowej. Gdy każda komórka przechodzi przez wiązkę laserową, rozproszone i emitowane światło fluorescencyjne przez różne fluorofory jest oddzielnie oznaczane ilościowo, co daje bezpośrednie zliczanie różnych typów komórek w próbce. Innym zastosowaniem biosensorów optycznych jest wykrywanie bakterii w próbkach. Jednym ze sposobów na to jest użycie czujników rezonatora z pierścieniem optycznym. Składają się z zamkniętej pętli sprzężonej z falowodami wejściowymi i wyjściowymi światła. Gdy światło o długości fali rezonansowej jest przykładane do falodołu wejściowego, przechodzi przez pętlę i zwiększa intensywność w ciągu wielu rund z powodu konstruktywnych zakłóceń i jest wyprowadzane do falodołu wyjściowego. Przeciwciała specyficzne dla bakteryjnych białek powierzchniowych są unieruchamiane na powierzchni rezonatora pierścieniowego i uzyskuje się podstawowe widmo absorpcyjne. Następnie próbka bakteryjna jest przepływana na powierzchnię rezonatora, aby umożliwić wiązanie się bakterii z unieruchomionym ciałem, po czym uzyskuje się drugie widmo absorpcyjne. Jeśli interesująca nas bakteria zwiąże się, obserwuje się widoczne przesunięcie pików rezonansowych, które jest wprost proporcjonalne do stężenia docelowych bakterii.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat biodetekcji optycznej. Omówiliśmy podstawowe zasady wykrywania optycznego zarówno opartego na etykietach, jak i bezetykietowego, wraz z dwoma wybitnymi przykładami tych metod i niektórymi zastosowaniami tych technik. Dzięki za oglądanie.