Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich
19 stycznia 2019
Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu mechanizmów napadów, takie jak to, jakie subpopulacje neuronalne są odpowiedzialne za początek i zakończenie napadu elektrograficznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona odtwarzać elektrograficzne zdarzenia napadowe, na żądanie, oraz modele in vivo i in vitro, które przypominają te obserwowane klinicznie. Technika ta może być również wykorzystana do poszukiwania potencjalnych terapii przeciwpadaczkowych, poprzez próbę wywołania elektrograficznych zdarzeń napadowych podczas stosowania różnych kandydatów na leki przeciwpadaczkowe.
Aby przygotować plastry kory mózgowej, przyklej przedkliniczną tkankę mózgową do etapu Vibratome, używając natychmiastowego kleju klejącego. Delikatnie umieść uchwyt specimin w tacce buforowej. Upewnij się, że grzbietowa część mózgu jest skierowana w stronę ostrza wibratomu.
Pokrój mózg na odcinki o grubości 450 mikrometrów, w kierunku grzbietowym do brzusznym. Wykonaj pierwsze nacięcie w przedklinicznym mózgu zwierzęcia, aby usunąć opuszkę węchową. Następnie wykonuj kolejne cięcia, aż do zaobserwowania obszaru motorycznego somatosensorycznego.
Użyj pipety o szerokim otworze. Przenieś docelowe plastry koronalne na szalkę Petriego zawierającą zimny roztwór preparacyjny. W przypadku plastrów koronalnych wykonaj poprzeczne cięcie tuż pod spoidłem neo korowym, a następnie przeciąć na linii środkowej, aby oddzielić półkule.
Następnie użyj nowej żyletki, aby odciąć nadmiar tkanki z plastrów. Bardzo ważne jest, aby skutecznie przeprowadzić procedurę krojenia mózgu. Każda chwila, w której tkanka mózgowa nie jest zanurzona w ACSF, wpływa negatywnie na jej jakość.
Uszkodzona, słabej jakości tkanka mózgowa jest mniej podatna na generowanie napadów elektrograficznych. Przenieś na chwilę grzbietową część wycinków koronalnych, które zawierają korę neo, na drugą szalkę Petriego wypełnioną ACSF o temperaturze 35 stopni Celsjusza. Następnie niezwłocznie przenieś plastry do komory inkubacyjnej, zawierającej ACSF o nachyleniu karbonizowanym o temperaturze 35 stopni Celsjusza.
Pozostaw plastry mózgu lekko zanurzone w komorze inkubacyjnej w temperaturze 35 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie wyjmij komorę inkubacyjną z łaźni wodnej i pozwól jej powrócić do temperatury pokojowej. Odczekaj godzinę, aż wycinki mózgu zregenerują się, zanim wykonasz zapisy elektrofizjologiczne.
W tej procedurze wytnij papier do soczewek, który jest nieco większy niż plasterek mózgu. Użyj pipety o szerokim otworze lub szczoteczki do detali, aby przenieść plasterek mózgu na wycięty papier do soczewek, który jest utrzymywany na miejscu za pomocą pęsety dentystycznej. Następnie przenieś papier do soczewek z plastrem mózgu do komory nagraniowej i zabezpiecz go na miejscu za pomocą sitka harfowego.
Następnie wylej wycinek mózgu w komorze nagraniowej z karbogenicznym ACSF w temperaturze 35 stopni Celsjusza w tempie trzech mililitrów na minutę. Użyj termometru cyfrowego, aby upewnić się, że komora zapisu ma od 33 do 36 stopni Celsjusza. Następnie wypełnij szklane elektrody 10 mikrolitrami ACSF za pomocą strzykawki Hamiltona.
Pod 20-krotnym mikroskopem stereoskopowym wprowadź szklaną elektrodę rejestrującą do powierzchownej warstwy korowej, dwóch, trzech, za pomocą ręcznych manipulatorów. Przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu za pomocą standardowego oprogramowania. Aby wywołać czynności podobne do napadów elektrograficznych, obficie wycinek mózgu należy napełnić ACSF zawierającym 4-AP w 100 mikromolach.
Przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu za pomocą standardowego oprogramowania. Aby wygenerować elektrograficzne zdarzenia podobne do napadów, wykorzystując strategię optogenetyczną na wycinkach mózgu myszy optogenetycznych, użyj ręcznego manipulatora, aby umieścić światłowód o średnicy przewodu 1000 mikronów bezpośrednio nad obszarem nagrywania. Zastosuj krótki impuls niebieskiego światła, aby zainicjować zdarzenie ictal.
Przyjazny dla użytkownika program oparty na MATLAB został opracowany specjalnie do wykrywania i klasyfikowania różnych typów zdarzeń padaczkowych, które występują w modelach napadów 4-AP in vitro i in vivo. Ten program do wykrywania jest dostępny w repozytorium GitHub Valiante Labs. Zastosowanie 100 mikromolowych 4-AP do dobrej jakości 450-mikronowych wycinków korowych mózgu od młodocianej myszy kanałowej VGAT, niezawodnie wywołało nawracające zdarzenia podobne do ictal w ciągu 15 minut.
Zastosowanie 100 mikromolowych 4-AP do plastrów o niskiej jakości skutkowało pękaniem lub gwałtownym wzrostem. Średnio 40% wycinków z każdego wypreparowanego przedklinicznego mózgu z powodzeniem wygenerowało zdarzenia podobne do ICTAL. Co więcej, 83% wypreparowanych myszy miało co najmniej jeden wycinek mózgu, który z powodzeniem wygenerował zdarzenia podobne do ICTAL.
W wycinkach mózgu ze spontanicznie występującymi zdarzeniami podobnymi do ictal, zastosowanie krótkiego 30-milisekundowego impulsu świetlnego na wycinku mózgu, niezawodnie wywołało zdarzenie podobne do ictal, które było identyczne pod względem morfologii. Te same odkrycia dokonano w wycinkach mózgu dwóch myszy z rodopsyny kanałowej. Tak więc, niezależnie od tego, która subpopulacja neuronalna została aktywowana, każde krótkie zdarzenie synchronizujące w izolowanej korowej sieci neuronowej prowadziło do wystąpienia zdarzenia podobnego do ICTAL.
Te podobne do ictal zdarzenia składały się z kolca wartowniczego, odpalenia podobnego do toniku, wystrzeliwania podobnego do klonicznego i aktywności podobnej do wybuchu pod koniec. Miały one podobny charakter do sygnatur elektrograficznych związanych z napadami klinicznymi. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne rodzaje przejść stanów mózgu, aby odpowiedzieć na pytania takie jak: jakie są mechanizmy neurobiologiczne leżące u podstaw przemian stanów mózgu?
I jak możemy regulować te przejścia, aby zapobiec wejściu w różne patologiczne stany mózgu?
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca koncentruje się na zastosowaniu modeli ostrych napadów drgawkowych, konkretnie z wykorzystaniem 4-aminopirydyny, w celu zbadania mechanizmów aktywności epileptyformnej w tkankach korowych myszy i człowieka. Możliwość wywoływania zdarzeń drgawkowych w zapisie elektrograficznym na żądanie pozwala na szczegółową analizę zachowania neuronów związanych z początkiem i zakończeniem napadu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Badania nad epilepsją
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw napadów drgawek jest kluczowe dla opracowania skutecznych metod leczenia.
- Modele ostrych napadów drgawek umożliwiają obserwację dynamiki napadów w czasie rzeczywistym.
- Rejestracje elektrofizjologiczne dostarczają wiedzy na temat inicjacji i propagacji napadów.
- Technika ta znajduje potencjalne zastosowanie w testowaniu leków przeciwdrgawkowych.
Cel badania
- Zbadanie subpopulacji neuronów odpowiedzialnych za rozpoczęcie i zakończenie napadów padaczkowych.
- Ocena skuteczności potencjalnych terapii przeciwdrgawkowych w sposób kontrolowany.
- Zbadanie charakterystyki zdarzeń o charakterze ictalnym w skrawkach kory mózgowej.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano świeże skrawki kory mózgowej przygotowane z tkanek mysich i ludzkich.
- Przeprowadzono pomiary elektrofizjologiczne w celu zmierzenia aktywności przypominającej napady drgawkowe wywołanej przez 4-aminopirydynę.
- Zastosowano szczegółowe protokoły krojenia i inkubacji, aby zapewnić żywotność tkanek.
- Wprowadzono strategie optogenetyczne w celu wywoływania zdarzeń iktalnych poprzez precyzyjną stymulację światłem.
- Opracowano oprogramowanie w środowisku MATLAB do wykrywania i klasyfikowania zdarzeń epileptiformnych.
Główne wyniki
- Protokół ten niezawodnie indukował zdarzenia o charakterze napadowym w wysokiej jakości skrawkach mózgu w ciągu 15 minut od aplikacji 4-AP.
- Stwierdzono, że 40% skrawków pomyślnie generowało te zdarzenia, co świadczy o skuteczności przygotowania tkanki.
- Reakcje obejmowały charakterystyczny impuls zwiastunowy (sentinel spike) oraz różne fazy wyładowań wskazujące na aktywność drgawkową.
- Podobne wyniki zaobserwowano w różnych modelach mysich, co podkreśla niezawodność tej techniki.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia niezawodną metodę indukowania i badania napadów elektrograficznych, dostarczając wiedzy na temat mechanizmów neuronalnych zaangażowanych w epilepsję.
- Wyniki wspierają badanie dynamiki napadów in vivo oraz in vitro.
- Zrozumienie tych mechanizmów może prowadzić do opracowania lepszych strategii leczenia epilepsji oraz innych zaburzeń powiązanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Indukcja zdarzeń drgawkowych w formie elektrograficznej na żądanie w ostrych modelach korowych umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw inicjacji i zakończenia napadu. Możliwość ta wspomaga walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków na padaczkę, pozwalając na powtarzalną, ilościową ocenę wpływu związków przeciwdrgawkowych na zdefiniowane fenotypy elektrofizjologiczne. Relewantność translacyjna jest zwiększona dzięki możliwości zastosowania tej metody zarówno w tkankach gryzoni, jak i ludzi, co ułatwia międzygatunkową walidację hipotez terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych subpopulacji neuronów odpowiedzialnych za początek i zakończenie napadu w zapisie elektrograficznym poprzez optogenetyczne lub farmakologiczne wyzwalanie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę do oceny, czy modulowanie konkretnych szlaków neuronalnych zapobiega zdarzeniom o charakterze ictalnym lub je modyfikuje, co wspiera testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne zdarzenia elektrograficzne przypominające napady o zdefiniowanej morfologii (kolce zwiastunowe, wyładowania toniczno-kloniczne, aktywność seryjna), odpowiednie do przesiewu wysokoprzepustowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowaną indukcję zdarzeń iktalnych za pomocą 4-AP, impulsów optogenetycznych lub aplikacji neuroprzekaźników (puffs), co pozwala na spójne testowanie związków w różnych laboratoriach.
- Wartość naukowa: Ułatwia ocenę potencjalnych leków przeciwdrgawkowych poprzez pomiar ich wpływu na częstotliwość, czas trwania lub cechy elektrograficzne napadów podczas indukcji na żądanie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykorzystanie ludzkiej tkanki korowej do generowania klinicznie istotnych zdarzeń przypominających napady, co zwiększa pewność predykcyjną w ocenie skuteczności terapeutycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości od wstępnych badań przesiewowych do chronicznych modeli epilepsji poprzez walidację, że wywołane zdarzenia replikują kliniczne sygnatury elektrograficzne.
- Wartość naukowa: Umożliwienie redukcji ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie specyficznych manipulacji neuronalnych ze zmianami w dynamice napadów, co wspiera wybór celów w rozwoju przedklinicznym.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając fizjologicznie istotny test do walidacji celu oraz przesiewania związków przed optymalizacją wiodącej struktury.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw inicjacji napadów poprzez precyzyjną, indukowaną na żądanie wywoływanie zdarzeń ictalnych w sieciach korowych.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów elektrofizjologicznych (częstotliwość, morfologia, czas trwania zdarzeń), które są niezbędne do standaryzacji testów i porównywania związków.
- Analityka: Umożliwia wykrywanie i klasyfikację zdarzeń epileptyformnych za pomocą oprogramowania opartego na MATLAB, dostarczając obiektywnych parametrów do oceny wpływu związków na dynamikę napadów.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje tkankę ludzką w celu zapewnienia istotności chorobowej, łącząc odkrycia z badaniami przedklinicznymi i klinicznymi nad epilepsją.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zestandaryzowaną, skalowalną platformę do oceny różnorodnych mechanizmów przeciwdrgawkowych w wielu projektach i modalnościach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności w neuronalnych mechanizmach generowania i rozprzestrzeniania się napadów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność indukcji napadów w preparatach tkanek gryzoni i ludzi, wspierając wieloośrodkowe kampanie przesiewowe.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji go/no-go, umożliwiając szybką, ilościową ocenę wpływu związków przeciwdrgawkowych na zdefiniowane punkty końcowe elektrofizjologiczne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zdolność do tłumienia lub modyfikowania zdarzeń typu ictal w modelach istotnych klinicznie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu elektrofizjologii, krojenia tkanek oraz technik optogenetycznego lub farmakologicznego wywoływania napadów.
- Metoda jest zależna od instrumentacji do rejestracji elektrofizjologicznej, precyzyjnej perfuzji płynów (np. 4-AP, ACSF) oraz stymulacji optycznej (w przypadku wyzwalania optogenetycznego).
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych protokołów przygotowania tkanki, aby zapewnić żywotność skrawków i spójne generowanie zdarzeń iktalnych, ponieważ jakość tkanki bezpośrednio wpływa na wskaźnik sukcesu.
- Wymagana jest adaptacja parametrów indukcji (np. stężenia 4-AP, czasu trwania impulsu światła, objętości podawanego neuroprzekaźnika) przy przechodzeniu z modeli tkankowych gryzoni na ludzkie.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność jakości skrawków oraz konieczność wprawnego obchodzenia się z materiałem w celu utrzymania stanu zdrowia tkanki podczas przygotowania i rejestracji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Preparation of Cortical Slices from the Somatosensory-motor Cortex
2:40
Electrophysiological Recordings of the Superficial Cortical Layer and Seizure Induction
4:43
Results: Acute In Vitro 4-AP Cortical Seizure Model and Ictal Events Generated by Optogenetics
6:19
Conclusion
