Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu mechanizmów napadów, takie jak to, jakie subpopulacje neuronalne są odpowiedzialne za początek i zakończenie napadu elektrograficznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona odtwarzać elektrograficzne zdarzenia napadowe, na żądanie, oraz modele in vivo i in vitro, które przypominają te obserwowane klinicznie. Technika ta może być również wykorzystana do poszukiwania potencjalnych terapii przeciwpadaczkowych, poprzez próbę wywołania elektrograficznych zdarzeń napadowych podczas stosowania różnych kandydatów na leki przeciwpadaczkowe.

Aby przygotować plastry kory mózgowej, przyklej przedkliniczną tkankę mózgową do etapu Vibratome, używając natychmiastowego kleju klejącego. Delikatnie umieść uchwyt specimin w tacce buforowej. Upewnij się, że grzbietowa część mózgu jest skierowana w stronę ostrza wibratomu.

Pokrój mózg na odcinki o grubości 450 mikrometrów, w kierunku grzbietowym do brzusznym. Wykonaj pierwsze nacięcie w przedklinicznym mózgu zwierzęcia, aby usunąć opuszkę węchową. Następnie wykonuj kolejne cięcia, aż do zaobserwowania obszaru motorycznego somatosensorycznego.

Użyj pipety o szerokim otworze. Przenieś docelowe plastry koronalne na szalkę Petriego zawierającą zimny roztwór preparacyjny. W przypadku plastrów koronalnych wykonaj poprzeczne cięcie tuż pod spoidłem neo korowym, a następnie przeciąć na linii środkowej, aby oddzielić półkule.

Następnie użyj nowej żyletki, aby odciąć nadmiar tkanki z plastrów. Bardzo ważne jest, aby skutecznie przeprowadzić procedurę krojenia mózgu. Każda chwila, w której tkanka mózgowa nie jest zanurzona w ACSF, wpływa negatywnie na jej jakość.

Uszkodzona, słabej jakości tkanka mózgowa jest mniej podatna na generowanie napadów elektrograficznych. Przenieś na chwilę grzbietową część wycinków koronalnych, które zawierają korę neo, na drugą szalkę Petriego wypełnioną ACSF o temperaturze 35 stopni Celsjusza. Następnie niezwłocznie przenieś plastry do komory inkubacyjnej, zawierającej ACSF o nachyleniu karbonizowanym o temperaturze 35 stopni Celsjusza.

Pozostaw plastry mózgu lekko zanurzone w komorze inkubacyjnej w temperaturze 35 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie wyjmij komorę inkubacyjną z łaźni wodnej i pozwól jej powrócić do temperatury pokojowej. Odczekaj godzinę, aż wycinki mózgu zregenerują się, zanim wykonasz zapisy elektrofizjologiczne.

W tej procedurze wytnij papier do soczewek, który jest nieco większy niż plasterek mózgu. Użyj pipety o szerokim otworze lub szczoteczki do detali, aby przenieść plasterek mózgu na wycięty papier do soczewek, który jest utrzymywany na miejscu za pomocą pęsety dentystycznej. Następnie przenieś papier do soczewek z plastrem mózgu do komory nagraniowej i zabezpiecz go na miejscu za pomocą sitka harfowego.

Następnie wylej wycinek mózgu w komorze nagraniowej z karbogenicznym ACSF w temperaturze 35 stopni Celsjusza w tempie trzech mililitrów na minutę. Użyj termometru cyfrowego, aby upewnić się, że komora zapisu ma od 33 do 36 stopni Celsjusza. Następnie wypełnij szklane elektrody 10 mikrolitrami ACSF za pomocą strzykawki Hamiltona.

Pod 20-krotnym mikroskopem stereoskopowym wprowadź szklaną elektrodę rejestrującą do powierzchownej warstwy korowej, dwóch, trzech, za pomocą ręcznych manipulatorów. Przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu za pomocą standardowego oprogramowania. Aby wywołać czynności podobne do napadów elektrograficznych, obficie wycinek mózgu należy napełnić ACSF zawierającym 4-AP w 100 mikromolach.

Przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu za pomocą standardowego oprogramowania. Aby wygenerować elektrograficzne zdarzenia podobne do napadów, wykorzystując strategię optogenetyczną na wycinkach mózgu myszy optogenetycznych, użyj ręcznego manipulatora, aby umieścić światłowód o średnicy przewodu 1000 mikronów bezpośrednio nad obszarem nagrywania. Zastosuj krótki impuls niebieskiego światła, aby zainicjować zdarzenie ictal.

Przyjazny dla użytkownika program oparty na MATLAB został opracowany specjalnie do wykrywania i klasyfikowania różnych typów zdarzeń padaczkowych, które występują w modelach napadów 4-AP in vitro i in vivo. Ten program do wykrywania jest dostępny w repozytorium GitHub Valiante Labs. Zastosowanie 100 mikromolowych 4-AP do dobrej jakości 450-mikronowych wycinków korowych mózgu od młodocianej myszy kanałowej VGAT, niezawodnie wywołało nawracające zdarzenia podobne do ictal w ciągu 15 minut.

Zastosowanie 100 mikromolowych 4-AP do plastrów o niskiej jakości skutkowało pękaniem lub gwałtownym wzrostem. Średnio 40% wycinków z każdego wypreparowanego przedklinicznego mózgu z powodzeniem wygenerowało zdarzenia podobne do ICTAL. Co więcej, 83% wypreparowanych myszy miało co najmniej jeden wycinek mózgu, który z powodzeniem wygenerował zdarzenia podobne do ICTAL.

W wycinkach mózgu ze spontanicznie występującymi zdarzeniami podobnymi do ictal, zastosowanie krótkiego 30-milisekundowego impulsu świetlnego na wycinku mózgu, niezawodnie wywołało zdarzenie podobne do ictal, które było identyczne pod względem morfologii. Te same odkrycia dokonano w wycinkach mózgu dwóch myszy z rodopsyny kanałowej. Tak więc, niezależnie od tego, która subpopulacja neuronalna została aktywowana, każde krótkie zdarzenie synchronizujące w izolowanej korowej sieci neuronowej prowadziło do wystąpienia zdarzenia podobnego do ICTAL.

Te podobne do ictal zdarzenia składały się z kolca wartowniczego, odpalenia podobnego do toniku, wystrzeliwania podobnego do klonicznego i aktywności podobnej do wybuchu pod koniec. Miały one podobny charakter do sygnatur elektrograficznych związanych z napadami klinicznymi. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne rodzaje przejść stanów mózgu, aby odpowiedzieć na pytania takie jak: jakie są mechanizmy neurobiologiczne leżące u podstaw przemian stanów mózgu?

I jak możemy regulować te przejścia, aby zapobiec wejściu w różne patologiczne stany mózgu?