Name: Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę ciągłego gradientu temperatury do badania preferencji termicznych larw Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala określić preferowaną temperaturę w jednym teście i znajduje zastosowanie w badaniach nad somatosensacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.M. jest wspierany przez fundusze z NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) i NIAID (1DP1AI124453).

<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, ważne jest, aby podjąć kroki w celu uzyskania odpowiedniej liczby larw do przeprowadzenia eksperymentów. Obejmują one wstępne karmienie much w fiolkach zawierających pastę drożdżową przez 2-3 dni, aby poprawić składanie jaj. Fiolki należy umieścić na tacy zawierającej fiolki z wodą i zamknąć w przezroczystej plastikowej torbie, która utrzymuje wilgotność pokarmu i wspomaga skuteczne odżywianie się larw, umożliwiając jednocześnie narażenie na normalne cykle światło-ciemność. Jednak ...

Termotaksja jest wykorzystywana przez zwierzęta mobilne do wyboru środowiska o najkorzystniejszych warunkach1,2,3. Jeśli klimat jest nadmiernie gorący lub zimny, takie zachowanie ma kluczowe znaczenie dla przetrwania. Ponadto wiele zwierząt jest wrażliwych na bardzo małe różnice temperatur w komfortowym zakresie i poszukuje otoczenia o idealnej temperaturze. Ma to szczególne znaczenie dla organizmów poikilotermicznych, takich jak muszki owocowe, które równoważą temperaturę swojego ciała z temperaturą otoczenia. Testy monitorujące termotaksję larw odegrały zasadniczą rolę w identyfikacji i wyjaśnieniu roli czujników molekularnych, takich jak kanały Drosophila Transient Receptor Potential (TRP)4,5,6, rhodopsins7,8 oraz receptory receptorów jonotropowych (IRs)9, które nadają tym zwierzętom wrażliwość na temperaturę w różnych zakresach temperatur.
Dwukierunkowy test wyboru zapewnia jedno podejście do badania preferencji termicznych larw6,7. Test polega na ustaleniu dwóch odrębnych stref temperaturowych i pozwala zwierzętom wybrać jedną stronę zamiast drugiej. Wyniki dwukierunkowych testów wyboru mogą być solidne, zwłaszcza jeśli różnice temperatur między tymi dwiema opcjami są duże. Ponadto, ponieważ każdy test obejmuje zestawienie tabelaryczne tylko dwóch grup, dane można wyrazić jako prosty indeks preferencji. Łatwość i prostota testów dwukierunkowego wyboru jest również podatna na genetyczne badania przesiewowe. Jednak głównym ograniczeniem jest to, że potrzeba wielu eksperymentów, aby ustalić preferowaną temperaturę zwierząt typu dzikiego lub zmutowanego.
Test gradientowy daje możliwość ustalenia preferowanej temperatury w pojedynczym teście8. Ponadto, w przeciwieństwie do testu wyboru dwukierunkowego, pozwala on na ocenę rozmieszczenia grupy zwierząt w konfrontacji z ciągłym zakresem temperatur. Jeden test gradientowy wykorzystuje szalkę Petriego i pojedyncze zwierzęta i dobrze nadaje się do charakteryzowania szczegółowego zachowania poszczególnych zwierząt10. Ponieważ jednak szalki Petriego są okrągłe, rozmiary stref temperaturowych różnią się i są stopniowo zmniejszane w zależności od odległości od środka. Dlatego ta konfiguracja nie jest idealna do monitorowania wyboru temperatury populacji zwierząt.
Aparat do ciągłego gradientu termicznego, który jest dobrze przystosowany do oceny preferencji temperaturowych grup larw, wykorzystuje prostokątną arenę i jest opisany tutaj. Urządzenie jest proste w budowie i montażu. Ponadto gradient jest liniowy i elastyczny, ponieważ można go wykorzystać do oceny termotaksji w dużych zakresach temperatur od 10 °C do 42 °C. Test jest szybki i prosty do wykonania oraz daje powtarzalne dane. Oprócz informowania o preferowanej temperaturze larw, ujawnia preferencje populacji zwierząt w całym zakresie liniowym w jednym eksperymencie. Ze względu na te zalety jest to doskonały wybór do identyfikacji genów wymaganych do termotaksji.

<table><tbody><tr><td>Gradientowy aparat testowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Chłodzona/podgrzewana kąpiel cyrkulacyjna 6L</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Ten model został wycofany z produkcji. Zaktualizowane modele zamienne obejmują: 1186R00 i 1197U04 dla 120 V, 60 Hz lub 1184L08 i 1197U04 dla 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Aluminiowa płytka testowa (do gradientu jednokierunkowego)</td><td></td><td></td><td>Rozmiar zewnętrzny: 14 x 10,1 x 0,9 cm, rozmiar wewnętrzny: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodowany na czarno.</td></tr><tr><td>Płyta aluminiowa (do dwukierunkowego gradientu)</td><td></td><td></td> <td>25 x 22 x 0,2 cm, anodowana na czarno.</td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td> aluminiowy <td>Wymiary zewnętrzne: 25,5 x 5 x 1,4 cm, parametry kanałów wewnętrznych pokazano na rysunku 1D.</td></tr><tr><td>Łącznik do aluminiowych bloków i rurek</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Sanitarne rurki silikonowe</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" ściana</td></tr><tr><td><mocna>Nazwa</mocny></td><td><silny>Firma</silny><</td><td>silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Items i odczynniki do testu </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Tłuczek do probówek do mikrowirówek 1,5 ml</td></tr><tr><td>Termometr</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Termopara</td><td>Fluke</td><td>typ K</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna pokrywka do mikropłytek</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>Szalka 35 mm</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Taśma opisowa (do gradientu dwukierunkowego)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Taśma do etykietowania Fisherbrand 2 cale x 14 jardów</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Przygotuj 1% roztwór</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Przygotuj 18% roztwór tuż przed rozpoczęciem oznaczania</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>malarski Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki</td> <td>wirówkoweDenville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 ml okrągła butelka z szerokim otworem</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (por 300 mm)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Opcjonalny przedmiot do mycia larw</td></tr><tr><td>Pudełko tekturowe (tacka na fiolki)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>22 400 ml</td></tr><tr><td>Mąka kukurydziana, żółta (o bardzo drobnych oczkach, flokowana) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1,609 g</td></tr><tr><td>Drożdże piwne 100 funtów</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Mąka sojowa (10 kg/szt.)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Agar, Typ II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo jasny syrop kukurydziany</td><td>Karo</td><td></td><td>1,700 mL</td></tr><tr><td>4-hydroksybenzoesan metylu (zawiesina w 200 proof etanolu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Kwas propionowy puriss. rocznie,>99,5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 ml</td></tr><tr><td>Kwas fosforowy&nbsp; odczynnik ACS, &ge; 85 % wag. w H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 ml</td><td>8,5 ml</td></tr></tbody></table>

test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw drosophila

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Wiele zwierząt, w tym muszka owocowa, Drosophila melanogaster, jest w stanie rozróżniać drobne różnice w temperaturze otoczenia, co pozwala im na poszukiwanie preferowanego krajobrazu termicznego. Aby określić preferencje temperaturowe larw w określonym zakresie liniowym, opracowaliśmy test wykorzystujący gradient temperatury. Aby ustalić gradient jednokierunkowy, dwa aluminiowe bloki są połączone z niezależnymi łaźniami wodnymi, z których każdy kontroluje temperaturę poszczególnych bloków. Dwa bloki wyznaczają dolną i górną granicę gradientu. Gradient temperatury ustala się poprzez umieszczenie aluminiowej płyty pokrytej agarozą na dwóch blokach sterowanych wodą, tak aby płyta obejmowała odległość między nimi. Końce aluminiowej płyty, która jest umieszczona na górze bloków wodnych, definiują minimalną i maksymalną temperaturę, a obszary pomiędzy tymi dwoma blokami tworzą liniowy gradient temperatury. Test gradientowy może być stosowany do larw w różnym wieku i może być stosowany do identyfikacji mutantów, które wykazują fenotypy, takie jak te z mutacjami wpływającymi na geny kodujące kanały TRP i opsyny, które są wymagane do dyskryminacji temperatury.

Aby ustanowić jednokierunkowy gradient w zakresie 18 °C-28 °C, ustawiliśmy temperaturę dwóch kąpieli wodnych na 16,8 °C i 31 °C. Uzyskano temperatury w 13 punktach poprzez pomiar temperatury w 26 pozycjach w górnych i dolnych częściach wszystkich 6 stref, na liniach granicznych między strefami oraz na skrajnych końcach powierzchni żelu agarozowego (Ryc. 2C, 2E). Rozkład temperatury wzdłuż gradientu był niemal liniowy (Y = 0,9672*X + 16,19, R<...

Tutaj prezentujemy protokół do określenia preferowanej temperatury środowiskowej larw Drosophila za pomocą ciągłego gradientu termicznego.

Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie somatosensacji, mechanizmu, za pomocą którego zwierzę, takie jak Drosophila melanogaster, wybiera preferowaną temperaturę otoczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona ustalić preferowaną temperaturę grupy larw w jednym teście w konfrontacji z ciągłym zakresem temperatur. Oprócz zapewnienia wglądu w preferencje temperaturowe larw drosophila, płytka impress może być również dostosowana do stosowania z innymi organizmami modelowymi, takimi jak robak C elegans.Najpierw przygotuj pastę drożdżową, aby przygotować fiolki na krzyż. Wymieszaj granulki drożdży w wodzie destylowanej i zmiel je na pastę za pomocą tłuczka. Następnie dodaj odrobinę pasty drożdżowej blisko wewnętrznych ścianek standardowych fiolek Drosophila tuż nad powierzchnią żywności.Aby wyprodukować larwy, zbierz od 12 do 35 samic i do połowy mniej samców, ale nie więcej niż 10 samców. Połączyć te grupy w fiolce zawierającej pastę drożdżową. Załadować przygotowane fiolki do tacki na 100 fiorolek.Umieść 20 otwartych fiolek wypełnionych wodą na tacy, aby zapewnić wilgotność. Następnie zamknij tackę w przezroczystej plastikowej torbie i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach karmienia i krycia przenieś muchy do nowych fiolek z pokarmem, aby zebrać jaja.Dotknij ich. Nie używaj dwutlenku węgla. Następnie pozwól muchom złożyć jaja przez trzy godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Później wyjmij dorosłe osobniki i umieść fiolki zawierające jaja z powrotem na tacy z fiolkami z wodą i zamknij torebkę. Następnie rozwijaj jaja w temperaturze 25 stopni Celsjusza do pożądanego stadium larwalnego. Aby przygotować gradient jednokierunkowy, najpierw utwórz środowisko otoczenia człowieka dla testu.Umieść dwa aluminiowe klocki połączone z oddzielnymi kąpielami wodnymi na mokrych ręcznikach papierowych w odległości 10 centymetrów od siebie. Kąpiele wodne należy wcześniej rozgrzać. Następnie przygotuj 100 mililitrów 1% agarozy i dodaj 25 mililitrów do każdej płytki testowej na równej powierzchni.Gdy agaroza zastygnie, delikatnie przetrzyj powierzchnię gąbką melaminową, aby powierzchnia była lekko szorstka. Następnie, aby zapewnić wydajny transfer temperatury, wypełnij wszelkie szczeliny między aluminiowymi blokami w płytkach testowych wodą dostarczaną z butelki z rozpylaczem. Teraz umieść płytki testowe na aluminiowych blokach i upewnij się, że granice znajdują się dwa centymetry od każdej krawędzi, aby dokładnie pasowały do krawędzi aluminiowych bloków.Następnie spryskaj powierzchnię płytek warstwą wody, aby żele nie wyschły. Następnie przykryj system kartonowym pudełkiem, aby zmniejszyć parowanie i pomóc ustabilizować temperaturę powierzchni żelu. Odczekaj od pięciu do 10 minut, aby temperatura się zrównoważyła.Następnie sprawdź temperaturę powierzchni na płycie w co najmniej 12 miejscach, aby upewnić się, że temperatura jest równomierna w całym tekście, podaj lub odejmij dwa stopnie Celsjusza. Następnie załóż pokrywę pudełka do czasu wykonania testu. Aby wyizolować czyste larwy, najpierw dodaj około 40 mililitrów 18% roztworu sacharozy do 50-mililitrowej probówki.Następnie przenieś larwy ze stosów pokarmu do roztworu za pomocą czerpaki. Następnie dokładnie wymieszaj larwy w roztworze za pomocą czerpaka. Teraz poczekaj od 30 do 60 sekund, aż larwy uniosą się do górnej warstwy rurki.Następnie wylej roztwór z larwami do kolejnej 50-mililitrowej probówki i uzupełnij świeżą 18% sacharozą. Ponownie poczekaj, aż larwy uniosą się w górę. Obecność jedzenia może mieć wpływ na wyniki.Dlatego, aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest, aby dokładnie oczyścić larwy, aby zminimalizować zanieczyszczenie żywnością. Rób to delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia larw. Następnie umieść sitko o wielkości 300 mikronów na 50-mililitrowej probówce, a następnie usuń wszelkie martwe ciała dorosłych i pływające zanieczyszczenia z powierzchni roztworu sacharozy.Teraz przelej larwy przez sitko, aby zebrać je na siatce. Następnie dwukrotnie przepuść około 50 mililitrów wody przez sitko, aby jeszcze bardziej oczyścić larwy. Następnie na pustym 35-milimetrowym naczyniu spłucz większość larw z sitka za pomocą wody.Użyj pędzla, aby przenieść pozostałe larwy na siatkę. Następnie odsysaj większość wody z naczynia za pomocą mikropipety. Następnie umieść pokrywkę na naczyniu do góry nogami, aby larwy nie mogły uciec.Teraz pozwól larwom dojść do siebie przez 10 do 20 minut przed rozpoczęciem testu. Najpierw wyjmij karton z żelu i szybko sprawdź temperaturę powierzchni żelu. Jeśli powierzchnia jest sucha, spryskaj ją niewielką ilością wody.Jeśli żel jest dobry, załaduj od 100 do 200 larw na środek każdej płytki za pomocą małego pędzla. Następnie umieść pokrywkę na każdej płytce testowej, aby uwięzić larwy i przykryj zestaw kartonowym pudełkiem, aby zapobiec ekspozycji na światło. Test jest obecnie w toku.Po 10 do 30 minutach wyjmij pudełko tekturowe i pokrywkę z mikropłytką. Następnie sfotografuj płytki z góry, aby zarejestrować położenie larw. Umieść pudełko nad aparatem, aby uniknąć odbicia na powierzchni żelu.Aby oczyścić płytkę, odessaj wszystkie larwy w miejscu, w którym mogły się rozproszyć. Teraz oblicz procentowy rozkład larw w każdej strefie, korzystając z oprogramowania do analizy obrazu. Wykonaj linie co dwa centymetry, w oparciu o rozgraniczenia na płytce testowej i policz liczbę larw w każdej strefie.Podczas liczenia należy zignorować larwy rozmieszczone w grzbietach 0,5 centymetra od każdej krawędzi, ponieważ grubość żelu i warunki temperatury nie są jednolite w pobliżu krawędzi. W zakresie od 18 stopni Celsjusza do 28 stopni Celsjusza gradient jednokierunkowy wykonywano za pomocą kąpieli wodnych ustawionych na 16,8 stopni Celsjusza i 31 stopni Celsjusza. Okazało się, że rozkład temperatury wzdłuż gradientu jest prawie liniowy.Larwy kontrolne badano w różnym wieku. Larwy pierwszego, drugiego i wczesnego trzeciego stadium rozwojowego wykazywały szczytowe preferencje dla strefy 24 stopni Celsjusza. W połowie trzeciego stadium rozwoju większość larw zgromadziła się w strefie 18 stopni Celsjusza.Niewędrujące larwy późnego stadium rozwoju były ciasno skupione w strefie 18 stopni Celsjusza. Skłonność do akumulacji w strefie 18 stopni Celsjusza w szczepie kontrolnym, którym był White 1118, nie była spowodowana efektem krawędziowym, ponieważ larwy w późnym trzecim stadium rozwojowym nadal gromadziły się w strefie 18 stopni Celsjusza, wykorzystując dwukierunkowy gradient. Kiedy przeanalizowaliśmy mutacje larw w późnym stadium rozwoju wymaganym do rozróżniania temperatury, wyniki uległy zmianie.Larwy z mutacją zerową w trpA1 rozmieszczone równomiernie w całym gradiencie od 18 stopni Celsjusza do 28 stopni Celsjusza. Larwy, w których brakowało tylko izoform A i B lub izoform C i D trpA1, również wykazywały poważne upośledzenia. Larwy z mutacją w jednym z dwóch genów kodujących fosfolipazę c beta, norpA, również zostały zakłócone.Jednak larwy z mutacją w genie kodującym drugą fosfolipazę c beta, plc21c, zachowywały się normalnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak uzyskać powtarzalne wyniki za pomocą ciągłego gradientu termicznego, co pozwoli Ci porównać preferencje temperaturowe larw typu dzikiego i zmutowanych Drosophila. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 30 minut dla jednego testu.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zwrócić uwagę na stan fiolek z muchami i nie używać larw, jeśli są wysuszone. Technika ta upraszcza odkrywanie nowych genów wymaganych przez larwy Drosophila do wyboru ulubionej temperatury w komfortowym zakresie.

a-temperature-gradient-assay-to-determine-thermal-preferences

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na stymulacji ograniczonej przestrzennie (lokalnej) nocyceptorów termicznych1,2, natomiast drugi obejmuje całkowitą (globalną) aktywację większości lub wszystkich takich neuronów3. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych neuronów sensorycznych nocyceptywnych Drosophila.

Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Ten film opisuje test preferencji smakowych, metodę behawioralną używaną do pomiaru atrakcyjności lub unikania kolorowych roztworów, które smakują inaczej, poprzez ocenę zabarwienia brzucha muchy po spożyciu preferowanej substancji. Przedstawiony protokół przedstawia procedurę zastosowaną do pomiaru preferencji muszek w stosunku do roztworów o różnych stężeniach sacharozy.

Test preferencji smakowych: metoda pomiaru zachowań żywieniowych u Drosophila

Larwy Drosophila mają dedykowane neurony czuciowe - nocyceptory - których reakcja na potencjalnie szkodliwe bodźce termiczne wyzwala u zwierzęcia zachowania awersyjne - lub tak zwane "nocyfensywne". Ten film opisuje metodę oceny nocycepcji termicznej poprzez rejestrowanie zachowania larw w odpowiedzi na miejscowe przyłożenie sondy ciepła do naskórka. Metoda ta jest zatem nazywana testem lokalnej sondy ciepła.

Test lokalnej sondy ciepła: metoda oceny nocyceptycji wysokich temperatur u larw Drosophila

Muszki owocowe Drosophila potrafią rozróżniać niewielkie zmiany temperatury i dlatego wybierają środowiska o sprzyjających warunkach termicznych. Ten film opisuje test behawioralny, który testuje preferencje temperaturowe larw Drosophila na liniowym gradiencie termicznym.

Test gradientu temperatury: metoda badania preferencji temperatury u larw Drosophila

Niedawno zidentyfikowaliśmy nową metodę rytmu preferencji temperatury (TPR) u Drosophila, w której preferowana temperatura u muszek wzrasta w ciągu dnia i spada w nocy. TPR jest regulowany niezależnie od innego okołodobowego wyjścia, aktywności lokomotorycznej. Tutaj opisujemy budowę i analizę TPR u Drosophila.

Projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu okołodobowego u Drosophila

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Tutaj demonstrujemy nowatorski test do badania zimnej nocycepcji u larw Drosophila. Test ten wykorzystuje specjalnie skonstruowaną sondę Peltiera, zdolną do zastosowania ogniskowego szkodliwego bodźca zimna i skutkuje wymiernymi zachowaniami specyficznymi dla zimna. Technika ta pozwoli na dalszą komórkową i molekularną sekcję zimnej nocycepcji.

Nowy test na zimną nocycepcję u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do automatycznego określania sprawności lokomotorycznej Drosophila przy zmieniających się temperaturach za pomocą programowalnej areny kontrolowanej temperaturą, która wytwarza szybkie i dokładne zmiany temperatury w czasie i przestrzeni.

Zautomatyzowana metoda określania wydajności Drosophila w odpowiedzi na zmiany temperatury w czasie i przestrzeni

Limity termiczne mogą przewidywać środowisko, które organizmy tolerują, co jest cenną informacją w obliczu gwałtownych zmian klimatycznych. Opisano tutaj wysokoprzepustowe protokoły do oceny krytycznych minimów termicznych i czasu wykańczania ciepła u owadów. Oba protokoły maksymalizują przepustowość i minimalizują koszt testów.

Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

Owady mają optymalny zakres temperatur otoczenia, w którym starają się pozostać, a wiele czynników zewnętrznych i wewnętrznych może zmienić tę preferencję. W tym miejscu opisujemy opłacalną i prostą metodę badania wyboru temperatury, która pozwala owadom swobodnie wykazywać swoje naturalne zachowania.

Określanie preferencji temperaturowych komarów i innych ektotermów

Ten raport opisuje metodę pomiaru czasu do powalenia dorosłej Drosophila melanogaster za pomocą Monitora Aktywności Drosophila (DAM2) w odpowiedzi na stresor cieplny przewodnictwa powietrza w komorze inkubatora. DAM2 mierzy aktywność, rejestrując ruchy poszczególnych much, gdy przecinają one wiązkę podczerwieni. Analizę danych ułatwia stworzony przez autorów nowatorski plik wykonywalny.

Testy tolerancji ciepła przy użyciu systemu monitorowania aktywności Drosophila: przewodnik po wykonywalnej aplikacji do analizy danych

Poznaj metodę ciągłego gradientu temperatury do badania preferencji termicznych larw Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala określić preferowaną temperaturę w jednym teście i znajduje zastosowanie w badaniach nad somatosensacją.

Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów