25 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy protokół do określenia preferowanej temperatury środowiskowej larw Drosophila za pomocą ciągłego gradientu termicznego.
Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie somatosensacji, mechanizmu, za pomocą którego zwierzę, takie jak Drosophila melanogaster, wybiera preferowaną temperaturę otoczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona ustalić preferowaną temperaturę grupy larw w jednym teście w konfrontacji z ciągłym zakresem temperatur. Oprócz zapewnienia wglądu w preferencje temperaturowe larw drosophila, płytka impress może być również dostosowana do stosowania z innymi organizmami modelowymi, takimi jak robak C elegans.
Najpierw przygotuj pastę drożdżową, aby przygotować fiolki na krzyż. Wymieszaj granulki drożdży w wodzie destylowanej i zmiel je na pastę za pomocą tłuczka. Następnie dodaj odrobinę pasty drożdżowej blisko wewnętrznych ścianek standardowych fiolek Drosophila tuż nad powierzchnią żywności.
Aby wyprodukować larwy, zbierz od 12 do 35 samic i do połowy mniej samców, ale nie więcej niż 10 samców. Połączyć te grupy w fiolce zawierającej pastę drożdżową. Załadować przygotowane fiolki do tacki na 100 fiorolek.
Umieść 20 otwartych fiolek wypełnionych wodą na tacy, aby zapewnić wilgotność. Następnie zamknij tackę w przezroczystej plastikowej torbie i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach karmienia i krycia przenieś muchy do nowych fiolek z pokarmem, aby zebrać jaja.
Dotknij ich. Nie używaj dwutlenku węgla. Następnie pozwól muchom złożyć jaja przez trzy godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Później wyjmij dorosłe osobniki i umieść fiolki zawierające jaja z powrotem na tacy z fiolkami z wodą i zamknij torebkę. Następnie rozwijaj jaja w temperaturze 25 stopni Celsjusza do pożądanego stadium larwalnego. Aby przygotować gradient jednokierunkowy, najpierw utwórz środowisko otoczenia człowieka dla testu.
Umieść dwa aluminiowe klocki połączone z oddzielnymi kąpielami wodnymi na mokrych ręcznikach papierowych w odległości 10 centymetrów od siebie. Kąpiele wodne należy wcześniej rozgrzać. Następnie przygotuj 100 mililitrów 1% agarozy i dodaj 25 mililitrów do każdej płytki testowej na równej powierzchni.
Gdy agaroza zastygnie, delikatnie przetrzyj powierzchnię gąbką melaminową, aby powierzchnia była lekko szorstka. Następnie, aby zapewnić wydajny transfer temperatury, wypełnij wszelkie szczeliny między aluminiowymi blokami w płytkach testowych wodą dostarczaną z butelki z rozpylaczem. Teraz umieść płytki testowe na aluminiowych blokach i upewnij się, że granice znajdują się dwa centymetry od każdej krawędzi, aby dokładnie pasowały do krawędzi aluminiowych bloków.
Następnie spryskaj powierzchnię płytek warstwą wody, aby żele nie wyschły. Następnie przykryj system kartonowym pudełkiem, aby zmniejszyć parowanie i pomóc ustabilizować temperaturę powierzchni żelu. Odczekaj od pięciu do 10 minut, aby temperatura się zrównoważyła.
Następnie sprawdź temperaturę powierzchni na płycie w co najmniej 12 miejscach, aby upewnić się, że temperatura jest równomierna w całym tekście, podaj lub odejmij dwa stopnie Celsjusza. Następnie załóż pokrywę pudełka do czasu wykonania testu. Aby wyizolować czyste larwy, najpierw dodaj około 40 mililitrów 18% roztworu sacharozy do 50-mililitrowej probówki.
Następnie przenieś larwy ze stosów pokarmu do roztworu za pomocą czerpaki. Następnie dokładnie wymieszaj larwy w roztworze za pomocą czerpaka. Teraz poczekaj od 30 do 60 sekund, aż larwy uniosą się do górnej warstwy rurki.
Następnie wylej roztwór z larwami do kolejnej 50-mililitrowej probówki i uzupełnij świeżą 18% sacharozą. Ponownie poczekaj, aż larwy uniosą się w górę. Obecność jedzenia może mieć wpływ na wyniki.
Dlatego, aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest, aby dokładnie oczyścić larwy, aby zminimalizować zanieczyszczenie żywnością. Rób to delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia larw. Następnie umieść sitko o wielkości 300 mikronów na 50-mililitrowej probówce, a następnie usuń wszelkie martwe ciała dorosłych i pływające zanieczyszczenia z powierzchni roztworu sacharozy.
Teraz przelej larwy przez sitko, aby zebrać je na siatce. Następnie dwukrotnie przepuść około 50 mililitrów wody przez sitko, aby jeszcze bardziej oczyścić larwy. Następnie na pustym 35-milimetrowym naczyniu spłucz większość larw z sitka za pomocą wody.
Użyj pędzla, aby przenieść pozostałe larwy na siatkę. Następnie odsysaj większość wody z naczynia za pomocą mikropipety. Następnie umieść pokrywkę na naczyniu do góry nogami, aby larwy nie mogły uciec.
Teraz pozwól larwom dojść do siebie przez 10 do 20 minut przed rozpoczęciem testu. Najpierw wyjmij karton z żelu i szybko sprawdź temperaturę powierzchni żelu. Jeśli powierzchnia jest sucha, spryskaj ją niewielką ilością wody.
Jeśli żel jest dobry, załaduj od 100 do 200 larw na środek każdej płytki za pomocą małego pędzla. Następnie umieść pokrywkę na każdej płytce testowej, aby uwięzić larwy i przykryj zestaw kartonowym pudełkiem, aby zapobiec ekspozycji na światło. Test jest obecnie w toku.
Po 10 do 30 minutach wyjmij pudełko tekturowe i pokrywkę z mikropłytką. Następnie sfotografuj płytki z góry, aby zarejestrować położenie larw. Umieść pudełko nad aparatem, aby uniknąć odbicia na powierzchni żelu.
Aby oczyścić płytkę, odessaj wszystkie larwy w miejscu, w którym mogły się rozproszyć. Teraz oblicz procentowy rozkład larw w każdej strefie, korzystając z oprogramowania do analizy obrazu. Wykonaj linie co dwa centymetry, w oparciu o rozgraniczenia na płytce testowej i policz liczbę larw w każdej strefie.
Podczas liczenia należy zignorować larwy rozmieszczone w grzbietach 0,5 centymetra od każdej krawędzi, ponieważ grubość żelu i warunki temperatury nie są jednolite w pobliżu krawędzi. W zakresie od 18 stopni Celsjusza do 28 stopni Celsjusza gradient jednokierunkowy wykonywano za pomocą kąpieli wodnych ustawionych na 16,8 stopni Celsjusza i 31 stopni Celsjusza. Okazało się, że rozkład temperatury wzdłuż gradientu jest prawie liniowy.
Larwy kontrolne badano w różnym wieku. Larwy pierwszego, drugiego i wczesnego trzeciego stadium rozwojowego wykazywały szczytowe preferencje dla strefy 24 stopni Celsjusza. W połowie trzeciego stadium rozwoju większość larw zgromadziła się w strefie 18 stopni Celsjusza.
Niewędrujące larwy późnego stadium rozwoju były ciasno skupione w strefie 18 stopni Celsjusza. Skłonność do akumulacji w strefie 18 stopni Celsjusza w szczepie kontrolnym, którym był White 1118, nie była spowodowana efektem krawędziowym, ponieważ larwy w późnym trzecim stadium rozwojowym nadal gromadziły się w strefie 18 stopni Celsjusza, wykorzystując dwukierunkowy gradient. Kiedy przeanalizowaliśmy mutacje larw w późnym stadium rozwoju wymaganym do rozróżniania temperatury, wyniki uległy zmianie.
Larwy z mutacją zerową w trpA1 rozmieszczone równomiernie w całym gradiencie od 18 stopni Celsjusza do 28 stopni Celsjusza. Larwy, w których brakowało tylko izoform A i B lub izoform C i D trpA1, również wykazywały poważne upośledzenia. Larwy z mutacją w jednym z dwóch genów kodujących fosfolipazę c beta, norpA, również zostały zakłócone.
Jednak larwy z mutacją w genie kodującym drugą fosfolipazę c beta, plc21c, zachowywały się normalnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak uzyskać powtarzalne wyniki za pomocą ciągłego gradientu termicznego, co pozwoli Ci porównać preferencje temperaturowe larw typu dzikiego i zmutowanych Drosophila. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 30 minut dla jednego testu.
Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zwrócić uwagę na stan fiolek z muchami i nie używać larw, jeśli są wysuszone. Technika ta upraszcza odkrywanie nowych genów wymaganych przez larwy Drosophila do wyboru ulubionej temperatury w komfortowym zakresie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wyznaczania preferowanej temperatury środowiskowej larw Drosophila przy użyciu ciągłego gradientu termicznego. Badanie analizuje mechanizmy, za pomocą których Drosophila melanogaster wybiera optymalną temperaturę w kontekście somatosensoryki.
Zrozumienie mechanizmów preferencji temperatury u organizmów modelowych wspiera walidację celów w badaniach somatosensorycznych, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kanałów TRP i szlaków fosfolipazy C. Niniejszy test dostarcza ilościowych, powtarzalnych odczytów fenotypowych, które zwiększają pewność prognostyczną we wczesnych fazach odkrywania poprzez łączenie zaburzeń genetycznych z określonymi wynikami behawioralnymi. Adaptowalność tej metody w odniesieniu do różnych gatunków i etapów rozwoju wzmacnia ciągłość translacyjną w przesiewowych badaniach celów neurobehawioralnych.
Test ten integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając funkcjonalny odczyt zaangażowania celu term sensorycznego przed etapem identyfikacji związku wiodącego.