Name: Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinizowanych aksonach in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj spektralną mikroskopię reflektometryczną do analizy mielinizowanych aksonów in situ. Ta bezbarwnikowa metoda umożliwia obrazowanie nanostruktury w nienaruszonej tkance nerwowej myszy przy użyciu standardowego mikroskopu konfokalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Instytut Nauk Podstawowych (IBS-R015-D1) oraz przez Program Badań Nauk Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2017R1A6A1A03015642).

Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Sungkyunkwan.
1. Przygotowanie próbki
Uwaga: Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed kontaktem ze zwierzętami. Przeprowadzaj wszystkie zabiegi chirurgiczne w pomieszczeniu przeznaczonym do zabiegów chirurgicznych. Sterylne fartuchy chirurgiczne i rękawiczki powinny być noszone przez cały personel na sali operacyjnej przez cały czas.
<ol>
	<li>Utrwalenie tkanek
	<ol>
		<li>Przygotować dwie strzykawki o pojemności 10 ml, każda wypełniona solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS.</li>
		<li>Znieczulić 7-12-tygodniową mysz (C57BL/6J lub dowolną linię myszy dowolnej płci), podając mieszaninę zoletilu i ksylazyny (1:1, 20 mg/kg każdy) lub alternatywny odpowiedni reżim znieczulenia (np. mieszaninę 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.</li>
		<li>Gdy mysz osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (użyj metody reakcji szczypania palca u nogi), odsłoń serce, odcinając skórę i klatkę piersiową nożyczkami.</li>
		<li>Odetnij prawy przedsionek małymi nożyczkami, aby spuścić krew i przeprowadź sekwencyjną fuzję roztworu PBS i PFA przez lewą komorę za pomocą igły (szybkość perfuzji = 4 ml / min, objętość = 10 ml dla każdego roztworu). 
		Uwaga: Mysz staje się sztywna, jeśli procedura zostanie pomyślnie zakończona. Stosowanie maści do oczu lub sterylizacji nie jest konieczne, ponieważ zabieg jest nieuleczalny. Procedurę utrwalania można pominąć. Jednak ten krok jest zalecany w celu zminimalizowania deformacji strukturalnych, w tym mechanicznego uszkodzenia tkanek i niedokrwiennego obrzęku aksonów. Więcej informacji na temat fiksacji tkanek można znaleźć w artykule Gage'a, G. J. i wsp.10</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wycinka mózgu 
	<ol>
		<li>Odetnij głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi przez brzuszną klatkę piersiową i brzuch.</li>
		<li>Usuń skórę głowy i okostną za pomocą odpowiednio małych nożyczek, aż do całkowitego odsłonięcia czaszki.</li>
		<li>Złam kość czołową i odetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego od kości potylicznej za pomocą małych nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić mózgu.</li>
		<li>Delikatnie usuń czaszkę i oponę twardą kolejno za pomocą cienkich kleszczy.</li>
		<li>Wyciągnij mózg za pomocą miękkiej plastikowej łyżki, uważając, aby nie uszkodzić tkanki.</li>
		<li>Wyekstrahowany mózg opłukać i namoczyć w 4% roztworze PFA przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Pokrój nieruchomy mózg na sekcje 100 – 150 μm za pomocą wibratomu. 
		Uwaga: Więcej informacji na temat przygotowania tkanek można znaleźć w artykule Segev i wsp.11. W przypadku kolejnych zabiegów, tkanka powinna być pokrojona na odcinki cieńsze niż grubość przekładki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż wycinka mózgu
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 szkiełko podstawowe i 2 kwadratowe szklanki nakrywkowe (22 × 22 × 0,17 mm) dla każdego plastra chusteczki.</li>
		<li>Przetnij jedną z kwadratowych szklanek nakrywkowych na pół (dwa prostokątne kawałki) za pomocą noża do szkła.</li>
		<li>Przymocuj dwie przepołowione szklanki nakrywkowe za pomocą super kleju do szkła szkiełkowego. 
		Uwaga: Przestrzeń między dwoma przepołowionymi szklankami powinna być nieco większa niż rozmiar wycinka chusteczki.</li>
		<li>Zbierz plasterek mózgu za pomocą pędzla lub pipety i połóż chusteczkę na szkiełku szkiełkowym między przekładką. Uważaj, aby nie złożyć chusteczki.</li>
		<li>Dozuj 100 μl PBS na powierzchnię tkanki.</li>
		<li>Umieść drugą kwadratową szklankę nakrywkową na chusteczce. Na tym etapie należy unikać wtrącania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Uszczelnij wokół szkła nakrywkowego za pomocą lakieru do paznokci (lub alternatywnie odpowiednich klejów), aby zapobiec parowaniu PBS i zanieczyszczeniu pyłem podczas kolejnej sesji obrazowania. 
		Uwaga: Na tym etapie eksperymentator może zrobić pauzę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kalibracja
<ol>
	<li>Włączyć mikroskop co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem, aby umożliwić stabilizację termiczną źródła lasera (patrz Tabela materiałów). Następnie włącz oprogramowanie do skanowania spektralnego (patrz Spis materiałów) i kliknij przycisk Acquire w górnej części GUI (Rysunek 3a)".</li>
	<li>Włącz migawkę programową dla lasera światła białego (WLL) i lampy fotopowielacza (PMT) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a).</li>
	<li>Wybierz tryb xyΛ z listy rozwijanej w trybie akwizycji, a następnie tryb wprowadzania lasera zostanie automatycznie zmieniony ze stałego procentu na stałą moc. Odznacz pole wyboru Automatyczny ruch SP. Następnie ustaw okno spektralne lasera wejściowego na 470–670 nm, a rozmiar kroku spektralnego na 4 nm w ustawieniach skanowania lambda wzbudzenia λ (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3b).</li>
	<li>USTAW zakres spektralny PMT na 450-690, klikając dwukrotnie lub przesuwając pasek regulacji zakresu spektralnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3c). 
	Uwaga: Ten zakres spektralny powinien obejmować pełną szerokość pasma źródła wejściowego.</li>
	<li>Wybierz soczewkę obiektywową zanurzoną w wodzie, odpowiednio z dużą aperturą numeryczną (NA > 0,7) i podaj dowolną wartość PMT i mocy lasera, aby aktywować konfigurację AOBS i przycisk Live Scan. Przełącz ścieżkę optyczną, sprawdzając odbicie w konfiguracji AOBS (<silna klasa="xfig">Rysunek 3d).</li>
	<li>Zamontuj lustro referencyjne (patrz Tabela materiałów) na stoliku mikroskopu. Powierzchnia lustra powinna być zwrócona w stronę soczewki obiektywu. Jeśli nie jest łatwo umieścić lustro na stoliku mikroskopu, przymocuj lustro do płaskiej płyty (np. szkła szkiełkowego).</li>
	<li>Kontroluj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej z powierzchnią lustra.</li>
	<li>Dostosuj wzmocnienie PMT i moc lasera, biorąc pod uwagę zakres dynamiczny detektora, a następnie zmień tryb wprowadzania lasera ze stałego procentu na stałą moc. 
	Uwaga: Jak to zwykle bywa, przy 570 nm stosuje się wzmocnienie PMT 500 (V) i względną moc lasera 0,1%.</li>
	<li>Potwierdź w trybie pseudokolorowym, aby sprawdzić, czy nie ma nasycenia w całym zakresie długości fali. Jeśli zaobserwuje się nasycenie, zmniejsz moc lasera (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a).</li>
	<li>Uruchom pobieranie skanowania lambda.</li>
	<li>Zdjąć lustro ze stolika i powtórzyć tę samą akwizycję bez próbki, aby uzyskać ciemne odniesienie (tj. ciemne przesunięcie).</li>
	<li>Zapisz dane w formacie wielostosowym TIF.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu SpeRe
<ol>
	<li>Umieść zamontowaną tkankę na stoliku mikroskopu. Aby z grubsza wyrównać tkankę z płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu, użyj trybu fluorescencji szerokokątnej przez okular</li>.
	<li>Przy włączonym Live Scan kontroluj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej do interesującego obszaru tkanki. Aby uniknąć szumu tła z szkiełka nakrywkowego, wybierz obszar docelowy o głębokości co najmniej 15 μm z granicy faz szkło-chusteczka.</li>
	<li>Uzyskaj stos obrazów spektralnych dla obszaru docelowego, stosując tę samą procedurę, jak opisano w krokach 2.1–2.10.</li>
	<li>Zapisz dane dla tkanki i ciemnego offsetu w formacie Multistacked TIF. 
	Uwaga: Na tym etapie eksperymentator może zrobić pauzę.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz dane spektralne (wielowarstwowy TIF) dla lustra referencyjnego i tkanki mózgowej w ImageJ.</li>
	<li>Wybierz ROI (obszary zainteresowania) dla otwartych stosów obrazów — centralny obszar dla lustra referencyjnego i segment włókna aksonowego dla tkanki mózgowej.</li>
	<li>Uzyskaj nieprzetworzone widma dla wybranych ROI, uruchamiając polecenie Image → Stacks → Plot Z-axis profile (Obraz stosów) w menu ImageJ (ImageJ).</li>
	<li>Otwórz dane z ciemnego przesunięcia, jedno wykonane dla lustra referencyjnego, a drugie dla tkanki mózgowej.</li>
	<li>Aby uzyskać widma ciemnych przesunięć, uruchom polecenie Image → Stacks → Plot Z-axis profile (Obraz Wykres profilu osi Z) w menu ImageJ.</li>
	<li>Zapisz wszystkie uzyskane widma za pomocą opcji Kopiuj i wklej. 
	Uwaga: W przypadku obrazowania SpeRe zaleca się użycie centralnego pola obrazowania w celu zminimalizowania aberracji optycznych poza osią. Włókna aksonów mogą być strukturalnie niejednorodne na całej swojej długości. W związku z tym zaleca się wybranie zwrotu z inwestycji w małym segmencie aksonu, zwykle < 5 μm, w celu zminimalizowania artefaktu częściowej objętości.</li>
</ol>
5. Korekta linii bazowej i analiza sygnału SpeRe
<ol>
	<li>Odejmij widma przesunięte od widm lustra referencyjnego i tkanek mózgowych.</li>
	<li>Znormalizuj każde widmo, dzieląc maksymalne natężenie widma.</li>
	<li>Podziel znormalizowane widmo aksonu przez znormalizowane widmo lustra odniesienia i odejmij przesunięcie DC od znormalizowanego widma.</li>
	<li>Zmierz częstotliwość liczby falowej, dopasowując nabyte widmo do krzywej sinusoidalnej (patrz Tabela materiałów), a następnie przelicz uzyskaną liczbę falową na okresowość, biorąc odwrotność.</li>
	<li>Przelicz okresowość liczby falowej na średnicę aksonu, korzystając z równania w <silna klasa="xfig">Rysunek 4c.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

Autorzy deklarują sprzeczne interesy finansowe: J. Kwon i M. Choi są wynalazcami zgłoszonej do opatentowania technologii opisanej w niniejszym artykule.

SpeRe to nowa, bezznacznikowa metoda obrazowania oparta na interferometrii spektralnej, która po raz pierwszy oferuje informacje w nanoskali w żywych mielinizowanych aksonach. W obecnym protokole akwizycji rozdzielczość przestrzenna dla średnicy aksonu jest rzędu 10 nm. Co więcej, SpeRe wykorzystuje o rzędy wielkości niższą dawkę światła w porównaniu z innymi mikroskopami o wysokiej rozdzielczości; Dzięki temu jest wolny od fototoksyczności i fotowybielania. Projekt SpeRe stworzy nową drogę do badania dynamiki aksonów mi...

W układzie nerwowym ssaków mielina zapewnia szybkie przewodzenie impulsów nerwowych i integralność aksonów poprzez otaczanie włókien aksonalnych wielowarstwowymi osłonkami błoniastymi. Jej wielowarstwowa struktura składa się z naprzemiennych nanometrowych cienkich warstw tworzonych przez błony plazmatyczne (~5 nm), cytozol (~3 nm) oraz przestrzenie zewnątrzkomórkowe (~7 nm)1,2. Mikroskopia optyczna, w tym nowoczesna mikroskopia superrozdzielcza, nie nadaje się do obserwacji nanometrowej dynamiki mieliny ze względu na niewystarczającą rozdzielczość wynikającą z dyfrakcji optycznej3,4,5. Choć mikroskopia elektronowa pozwala na uzyskanie szczegółowych informacji o nanostrukturze mieliny, nie jest ona kompatybilna z żywymi układami biologicznymi ze względu na wysoce inwazyjne przygotowanie próbek, obejmujące fiksację chemiczną i ultramićciecie6,7. Do niedawna nie istniała technika pozwalająca na obserwację nanometrowej dynamiki zmielinizowanych aksonów in situ.
Schain i in. wcześniej zgłoszono, że aksony zmielinizowane wykazują kolorową refleksyjność światła8Dzięki zastosowaniu analizy spektroskopowej światła odbitego opracowaliśmy nową metodę obrazowania do obrazowania aksonów zmielinizowanych w skali nanometrycznej, nazwaną reflektometrią spektralną (SpeRe).9SpeRe opiera się na interferencji cienkowarstwowej występującej w wielowarstwowej strukturze osłonki mielinowej (Rycina 1). Przeprowadzona symulacja optyczna dla różnych aksonów wykazała, że widmo odbicia jest funkcją okresową liczby falowej, a jego okresowość (<img alt="Symbol prędkości fazowej \( \tilde{v}_p \) w równaniach propagacji fal." src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">) jest odwrotnie proporcjonalna do średnicy aksonu (d). Ta prosta zależność (<img alt="Równanie współczynnika dyfuzji (d=0,27/√v_p); wzór, analiza badawcza, zmienne statyczne." src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">) umożliwia łatwą kwantyfikację średnicy aksonów na podstawie danych SpeRe. Wykorzystując tę metodę, w naszej poprzedniej publikacji wykazaliśmy powszechne pęcznienie aksonów w przebiegu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu.
System SpeRe opiera się na mikroskopii konfokalnej i składa się ze specjalistycznego źródła laserowego oraz filtrów (Rysunek 2). Źródłem wejściowym jest laser białego światła, zapewniający szerokopasmową emisję widmową od zakresu widzialnego do podczerwieni. Do skanowania widmowego system wyposażony jest w dwa urządzenia akustyczno-optyczne: akustyczno-optyczny filtr strojący (AOTF), służący do dostarczania wybranej długości fali z szerokopasmowego źródła wejściowego, oraz akustyczno-optyczny rozdzielacz wiązki (AOBS), który kieruje wybraną odbitą długość fali do detektora. Oprogramowanie do konfokalnej mikroskopii hiperspektralnej (patrz Tabela materiałów) oferuje możliwość konfigurowalnego skanowania widmowego w celu sekwencyjnego pozyskiwania obrazów odbiciowych przy różnych długościach fali wejściowej. Ponadto aberracja chromatyczna może istotnie zakłócać pomiar widmowy; dlatego zaleca się stosowanie obiektywu apochromatycznego.
Należy zauważyć, że lasery białego światła generują nierównomierny sygnał widmowy, a komponenty optyczne również wpływają na profil widmowy. W związku z tym nabyte widma muszą zostać skalibrowane przed przeprowadzeniem dalszej analizy ilościowej. Jako wzorca zazwyczaj stosuje się chronione lustro srebrne, które zapewnia niemal stałą odbijalność (&gt; 97%) w całym zakresie widzialnym. Następnie nabyte widma dzieli się przez widma referencyjne uzyskane z lustra.
Krok spektralny w skanowaniu spektralnym określa prędkość akwizycji, dlatego musi on zostać zoptymalizowany. Ponieważ większy akson ma dłuższy okres spektralny, wymaga on gęstszego próbkowania spektralnego. Na przykład akson o średnicy 10 µm, będący jednym z największych fizjologicznych aksonów, ma okres spektralny wynoszący ~8 nm. Stosując kryterium próbkowania Nyquista, zastosowaliśmy interwał próbkowania spektralnego wynoszący 4 nm, aby objąć wszystkie fizjologiczne aksony w tkankach nerwowych myszy. Takie podejście zazwyczaj trwa kilka sekund dla pełnego skanowania spektralnego i nie nadaje się zatem do zastosowań in vivo, gdzie ruchy fizjologiczne (np. oddychanie i bicie serca) zakłócają stabilną akwizycję spektralną. Rozwiązaliśmy ten problem wcześniej, konstruując specjalistyczny mikroskop pionowy, zaprojektowany do pozyskiwania pełnego widma dla każdego punktu przy użyciu spektrometru matrycowego (prędkość akwizycji ≈ 30 ms na piksel).
W niniejszym raporcie opisujemy szczegółowy protokół obrazowania SpeRe na utrwalonym skrawku mózgu, który można przeprowadzić przy użyciu komercyjnego mikroskopu hiperspektralnego (patrz Tabela materiałów). Dzięki temu badacze nieposiadający specjalistycznej wiedzy z zakresu instrumentacji optycznej mogą samodzielnie przeprowadzić ten protokół. Omówiliśmy również potencjalne problemy oraz sposoby ich rozwiązywania podczas akwizycji i analizy danych SpeRe.

<table><tbody><tr><td>Nóż do szkła</td> <td>-</td><td></td> <td>można go kupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych.</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td> <td>-</td><td></td> <td>można go kupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych.</td></tr><tr><td>Obiektyw apochromatyczny 40&times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Typ zanurzeniowy w wodzie</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternatywnie można użyć Fluoromyelin Red (F34652).</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica SP8 TCS</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Szczegółowe informacje można znaleźć w rozdziale "Konfiguracja mikroskopu" w rozdziale Wprowadzenie.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Pokryty chronionym srebrem.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Technologie życia</td><td>14190-136-Paraformaldehyd</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Grubość: #1 (0,13 do 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Szkło przesuwne</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Grubość: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Używaj urządzenia dozującego, aby uniknąć kontaktu ze skórą lub oczami.</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000</td> DUAL-Vibratome <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td> <td>VT1200S-Laser</td><td></td></tr> <tr><td>światła białego</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 została wycofana z produkcji i zastąpiona przez EXU-6.</td></tr></tbody></table>

spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinizowanych aksonach in situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

W układzie nerwowym ssaków, mielina zapewnia izolację elektryczną, owijając włókna aksonów wielowarstwową spiralą. Zainspirowani wysoce zorganizowaną architekturą subkomórkową, opracowaliśmy niedawno nową metodę obrazowania, nazwaną reflektometrią spektralną (SpeRe), która umożliwia bezprecedensowe obrazowanie w nanoskali żywych mielinizowanych aksonów in situ bez znaczników. Podstawową zasadą jest uzyskanie informacji nanostrukturalnej poprzez analizę widma odbicia wielowarstwowej struktury subkomórkowej. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół krok po kroku do wykonywania podstawowego obrazowania SpeRe tkanek nerwowych przy użyciu komercyjnego konfokalnego systemu mikroskopowego, wyposażonego w laser światła białego i przestrajalny filtr. Zajmujemy się procedurami przygotowania próbek, pozyskiwania danych spektralnych i przetwarzania obrazu w celu uzyskania informacji nanostrukturalnej.

Zgodnie z protokołem, przygotowano stałą sekcję mózgu z barwieniem egzogennym za pomocą fluoroforu wiążącego mielinę (patrz Tabela materiałów). Obrazowanie SpeRe przeprowadzono na sekcji mózgu za pomocą komercyjnego konfokalnego mikroskopu hiperspektralnego w połączeniu z konfokalnym obrazowaniem fluorescencyjnym (Rycina 4a). W przypadku SpeRe natężenie optyczne wejściowe ustawiono na 5 µW/µm2 przy czasie przebywania piksela wynosz...

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół obrazowania mielinowanych aksonów w ustalonym wycinku mózgu przy użyciu bezznacznikowej techniki obrazowania w nanoskali opartej na reflektometrii spektralnej.

Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinizowanych aksonach in situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mieliny, takie jak plastyczność mieliny i demienina. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie nanostruktury mielinizowanego aksonu w nienaruszonej tkance mózgowej bez skomplikowanego znakowania lub przygotowywania próbki. Tutaj pokażemy aplikację w wycinku mózgu, ale tę technikę można rozszerzyć na żywe zwierzęta.Po utrwaleniu i pokrojeniu tkanki mózgowej myszy zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj jedno szkiełko podstawowe i dwie szklanki nakrywkowe na każdy plasterek tkanki. Użyj noża do szkła, aby przeciąć jedną z kwadratowych szklanek nakrywkowych na pół. Następnie utwórz przekładkę, używając superglue, aby przymocować dwa elementy do szkiełka podstawowego.Za pomocą szczoteczki lub pipety zbierz plasterek mózgu i połóż chusteczkę na szklanym szkiełku między przekładką, uważając, aby nie złożyć chusteczki. Dozuj 100 mikrolitrów PBS na powierzchnię tkanki. Następnie umieść drugą kwadratową szklankę nakrywkową na wierzchu chusteczki, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić wokół szkła nakrywkowego, aby zapobiec parowaniu PBS i zanieczyszczeniu pyłem podczas kolejnej sesji obrazowania. Co najmniej godzinę przed obrazowaniem włącz mikroskop, aby umożliwić stabilizację termiczną źródła lasera. Następnie włącz oprogramowanie do skanowania spektralnego i kliknij przycisk pobierania na górze graficznego interfejsu użytkownika.Włącz migawkę programową dla lasera światła białego i lampy fotopowielacza. W obszarze Tryb akwizycji wybierz tryb lambda XY z listy rozwijanej. Tryb wprowadzania lasera jest następnie automatycznie zmieniany ze stałego procentu na stałą moc.W ustawieniach wzbudzenia lambda, skanowania lambda odznacz pole automatycznego ruchu SP i ustaw okno spektralne dla lasera wejściowego na 470 do 670 nanometrów, a rozmiar kroku spektralnego na cztery nanometry. Ustaw zakres spektralny PMT na 450 do 690 nanometrów, klikając dwukrotnie lub przesuwając pasek regulacji zakresu spektralnego. Wybierz soczewkę obiektywową zanurzoną w wodzie odpowiednio do dużej przysłony numerycznej.Podaj dowolną wartość PMT i mocy lasera, aby aktywować konfigurację AOBS i przycisk skanowania na żywo. W obszarze konfiguracji AOBS przełącz się na ścieżkę optyczną, sprawdzając odbicie. Następnie zamontuj lustro referencyjne na stoliku mikroskopu powierzchnią skierowaną w stronę soczewki obiektywu.Jeśli nie jest łatwo umieścić lustro na stoliku mikroskopu, przyklej lustro do płaskiej płytki. Dostosuj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej z powierzchnią lustra. Następnie dostosuj wzmocnienie PMT i moc lasera, biorąc pod uwagę zakres dynamiczny detektora.Pod pseudokolorem sprawdź, czy nie ma nasycenia w całym zakresie długości fali. Jeśli zaobserwuje się nasycenie, zmniejsz moc lasera. Następnie uruchom akwizycję skanowania lambda.Zdejmij lustro ze stolika i powtórz tę samą akwizycję bez próbki, aby uzyskać ciemne odniesienie. Następnie zapisz dane w wielostosowym formacie TIF. Aby przeprowadzić akwizycję obrazu SpeRe, umieść zamontowaną tkankę na stoliku mikroskopu.Aby z grubsza wyrównać tkankę do płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu, przez okular użyj trybu fluorescencji szerokokątnego. Przy włączonym skanowaniu na żywo kontroluj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej do obszaru zainteresowania w tkance. Aby uniknąć szumów tła z szkiełka nakrywkowego, wybierz obszar docelowy o głębokości co najmniej 15 mikrometrów z powierzchni styku tkanki szklanej.Uzyskaj stos obrazów spektralnych dla obszaru docelowego, korzystając z tej samej procedury, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Następnie zapisz dane dla tkanki i ciemnego offsetu w formacie TIF z wieloma stosami. Aby przetworzyć obrazy w ImageJ, otwórz dane spektralne dla lustra referencyjnego i tkanki mózgowej.Wybierz ROI dla otwartych stosów obrazów, środkowy obszar dla lustra referencyjnego i segment włókna aksonowego dla tkanki mózgowej. Następnie uruchom obraz, układaj w stosy, kreśl profil osi Z, aby uzyskać surowe widma dla wybranych ROI. Włókna aksonów mogą być strukturalnie niejednorodne na całej swojej długości, dlatego zaleca się wybór ROI na małym segmencie aksonu, zwykle mniejszym niż pięć mikrometrów, w celu zminimalizowania artefaktów częściowej objętości.Otwórz dane z ciemnego przesunięcia, jeden wykonany dla lustra referencyjnego, a drugi dla tkanki mózgowej, i wykreśl profil osi Z, jak pokazano poniżej. Następnie użyj opcji kopiowania i wklejania, aby zapisać wszystkie uzyskane opcje. Aby przeprowadzić korekcję linii podstawowej i analizę sygnału SpeRe, odejmij widma przesunięcia od widm lustra referencyjnego i tkanek mózgowych.Znormalizuj każde widmo, dzieląc maksymalne natężenie widma. Wprowadź liczbę falową, biorąc odwrotność długości fali użytej w eksperymencie, znormalizuj widmo aksonu, dzieląc widmo lustra odniesienia i odejmij przesunięcie DC od znormalizowanego widma. A następnie uzyskaj częstotliwość liczby falowej, dopasowując nabyte widmo do sinusoidy.Przelicz uzyskaną częstotliwość liczby falowej na okresowość, biorąc odwrotność i przelicz okresowość liczby falowej na średnicę aksonu, korzystając z równania pokazanego tutaj. W tym eksperymencie utrwalone wycinki mózgu zostały fluorescencyjnie wybarwione na mielinie, a obrazowanie SpeRe przeprowadzono z dawką światła o rząd wielkości niższą niż w konwencjonalnej fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Sygnał SpeRe został zlokalizowany wzdłuż środka zmielinizowanych aksonów, zgodnie z przewidywaniami wynikającymi z geometrii odbicia optycznego.Z widma odbiciowego segmentu aksonu uzyskano okresowość liczby falowej, która następnie została przekształcona na średnicę aksonu. Ten wykres ilustruje poprzeczny profil intensywności fluorescencji z obszaru pudełkowego, a średnica zmierzona przez SpeRe okazała się być dobrze zgodna z pomiarem opartym na fluorescencji. Obrazowanie SpeRe opiera się na odbiciu optycznym.W ten sposób szkiełko nakrywkowe na bazie krzemionki może wprowadzać znaczny szum tła. W konfiguracji optyki szum tła był znaczny, gdy głębokość obrazowania od szkiełka nakrywkowego była mniejsza niż pięć mikrometrów, ale unikano go, gdy głębokość obrazowania była większa niż 15 mikrometrów. Etap kalibracji nie jest wymagany dla każdego eksperymentu, ale jest zalecany co najmniej raz w tygodniu.Po zakończeniu kalibracji procedurę obrazowania można zakończyć zazwyczaj w ciągu 20 sekund dla każdego pola view. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o uwzględnieniu dynamicznego opóźnienia detektora w przypadku skanowania pełnego spektrum. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać nanostrukturę z mielinizowanych aksonów za pomocą obrazów odbicia.

spectral-reflectometric-microscopy-on-myelinated-axons-in-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Źródło: Kwon, J., et al., Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinowanych aksonach in situ.  J. Vis. Exp. (2018) Ten film demonstruje zastosowanie reflektometrii spektralnej z hiperspektralnym mikroskopem konfokalnym do analizy wzorców interferencji i określania mielinowych średnic aksonów w utrwalonych wycinkach tkanki mózgowej.

Wykorzystanie reflektometrii spektralnej do określenia zmielinizowanych średnic aksonów w nieruchomym wycinku mózgu myszy

Źródło: McCullagh, E. A., et al. Koherentna spektroskopia Ramana Antystokesa (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne i koherentną spektroskopię Ramana antystokesa (CARS) w celu wizualizacji architektury neuronalnej w tkance mózgowej gryzoni. Barwienie Nissl znakuje ciała komórkowe poprzez wiązanie się z rybosomalnym RNA, podczas gdy obrazowanie CARS celuje w mielinę bogatą w lipidy za pomocą sygnałów indukowanych...

Koherentna spektroskopia Ramana antystokesa do wizualizacji mielinizowanych neuronów w tkance mózgowej myszy

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Prezentujemy protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową z wzbudzeniem dwufotonowym do jednoczesnej wizualizacji dynamiki uszkodzeń aksonów i mielin w czasie rzeczywistym. Ten proponowany protokół pozwala na badanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych czynników, które mogą wpływać na los centralnego mielinizowanego aksonu po urazie i przyczyniać się do trwałej niepełnosprawności klinicznej.

Model uszkodzenia rdzenia kręgowego indukowany laserem ex vivo do oceny mechanizmów zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Wizualizacja mielinizacji jest ważnym celem dla wielu badaczy zajmujących się układem nerwowym. CARS to technika kompatybilna z immunofluorescencją, która może natywnie obrazować lipidy w tkankach, takich jak mózg, oświetlając wyspecjalizowane struktury, takie jak mielina.

Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Poznaj spektralną mikroskopię reflektometryczną do analizy mielinizowanych aksonów in situ. Ta bezbarwnikowa metoda umożliwia obrazowanie nanostruktury w nienaruszonej tkance nerwowej myszy przy użyciu standardowego mikroskopu konfokalnego.

Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinizowanych aksonach in situ

Przeglądaj więcej filmów