Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Obecnie spektrometria mas odgrywa ważną rolę w biologii strukturalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ważnych makrocząsteczek biologicznych w ich stanie naturalnym, zwłaszcza białek i kompleksów białkowych. Natywna spektrometria mas ma szerokie zastosowanie w różnych zespołach biomolekularnych, w tym w układach wielobiałkowych i kwasów nukleinowych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i bardzo czuła. Może być używany do badania heterogenicznych próbek białek, umożliwia jednoczesną analizę wielu białek w stanie oligomerycznym. Procedurę zademonstruje Andy Lau, doktorant w mojej grupie.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wewnętrzne naczynia włosowate do nanoelektronrozpylania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować próbkę wolną od ligandów jako kontrolę dla każdego przebiegu, ponieważ bufor wymienia się każdą z nich na octan amonu. Następnie wybierz tryby czułości, akwizycji jonów dodatnich i mobilności TOF.

Następnie włącz pułapkę, API i gazy IMS. Do separacji IM użyj pokazanych tutaj punktów początkowych azotu i argonu i dostosuj w razie potrzeby. Ustaw odpowiedni zakres akwizycji m/z.

W przypadku nieznanego białka początkowe kroki optymalizacji powinny wykorzystywać szeroki zakres. Włóż pokrytą złotem kapilę do uchwytu kapilary. Następnie załaduj od dwóch do trzech mikrolitrów interesującego nas roztworu kompleksu białkowego do kapilary.

Delikatnie dokręć kapilarnę i umieść ją na stopniu źródła elektrorozpylania. Przesuń stolik w odpowiednie miejsce, aby rozpocząć pobieranie danych. Zastosuj niskie ciśnienie gazu nano-flow, aż na końcu kapilary utworzy się kropla.

Przesuń kapilarę w stosunku do stożka i monitoruj prąd jonowy, aby uzyskać stabilny prąd jonowy. Zastosuj napięcie kapilarne w zakresie od 0,9 do 1,6 kilowolta. Następnie ustaw stożek pobierania próbek, przesunięcie źródła, temperaturę źródła i przepływ gazu w stożku zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby uzyskać dobrze rozdzielcze widmo masowe i zmaksymalizowaną transmisję jonów, dostosuj parametry MS i monitoruj wynikającą z tego zmianę widm. Ustaw energię zderzenia pułapki na początkowy punkt początkowy między 10 a 50 woltów. Jeśli przesunięcia napięcia są niewystarczające, dostosuj energie zderzenia pułapki.

Ustaw pułapkę za pomocą jej napięcia na początkowy punkt początkowy między 20 a 45 woltów. Popraw desolwatację, optymalizując to napięcie. Następnie zoptymalizuj prędkość fali i wysokość fali, jak opisano w tekście, aby uzyskać najlepszą separację mobilności.

W badaniach z udziałem HerA i NurA należy przyjąć prędkość fali 40 metrów na sekundę i wysokość fali od 550 do 650 woltów. W celu analizy wiązania DNA należy wymieszać białko i DNA w stosunku molowym, który pozwala na tworzenie kompleksu białkowego DNA. Dodaj rosnące ilości któregokolwiek z poniższych, 5'O-3-tio-trifosforanu, soli tetralitu lub ADP.

Za pomocą odpowiedniego oprogramowania zmierz masy generowanych gatunków i zidentyfikuj wiązania ligandów, takie jak wiązanie ATP i ADP oraz stany oligomeryczne. Następnie należy wykorzystać intensywności jonów obserwowane w surowych widmach ESI MS, aby określić ilościowo odpowiadającą im względną liczebność gatunków. Po zoptymalizowaniu warunków przyrządu w celu zapewnienia stabilnej transmisji, należy jak najniżej zmniejszyć energię zderzenia i stożek próbkowania, zachowując przy tym dobrą jakość widm.

Użyj wcześniej określonej zoptymalizowanej prędkości fali i wysokości fali, aby uzyskać IM MS. Zmierz czas dryfu jonów przy trzech różnych prędkościach fal przy zachowaniu tej samej wysokości fali. Aby określić jon białkowy, CCS zmierzył cztery kalibry białek, dwa z masą powyżej badanego białka i dwa z masą poniżej, używając tych samych warunków oprzyrządowania. Najpierw przygotuj próbki białek i zbuforuj je wymień na octan amonu, jak opisano w protokole tekstowym.

Dodawaj rozpuszczalnik w 10% odstępach, aż do osiągnięcia pożądanej ilości. Inkubować na lodzie przez godzinę. Następnie należy uzyskać widmo IM-MS dla każdej próbki.

Korzystając z oprogramowania SUMMIT, przypisz podkompleksy białkowe i wygeneruj sieci interakcji białkowych. Alternatywnie można ręcznie wygenerować listę teoretycznych mas dla oczekiwanych gatunków. Aby rozpocząć badanie stabilności kompleksu białkowego, zapisz dane IM-MS, jednocześnie zwiększając napięcie przyspieszenia pułapki z 10 woltów do 200 woltów, które będzie stopniowo rozwijać się do białka i fazy gazowej.

Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania i generuj dwuwymiarowe wykresy rozwijające, układając znormalizowane rozkłady intensywności CCS przy każdym przyspieszającym napięciu dla każdego stanu ładowania. Wyniki natywnego stwardnienia rozsianego ujawniają stan oligomeryczny, skład i topologię kompleksu HerA i NurA. Ponieważ oddziaływania niekowalencyjne są zachowane w fazie gazowej, natywne MS eksperymentów miareczkowania gamma S i ADP są wykorzystywane do określenia wiązania nukleotydów parami w HerA i NurA.

Widma masowe stanów oligomerycznych HerA ujawniają, że zwiększenie stężenia gamma S ATP zwiększa względną intensywność heksamerycznego HerA. Eksperymentalne wartości CCS dla białek i ich kompleksów są następnie uzyskiwane z eksperymentów IM-MS. Uważa się, że wartości te są dobrze zgodne z teoretycznymi pomiarami krystalografii rentgenowskiej, która weryfikuje wykorzystanie wartości CCS do budowania modeli składania białek o niskiej rozdzielczości.

Analiza CIU i KEcom ujawnia, że HerA-NurA związana z DNA jest bardziej stabilna niż kompleks wolny od DNA. Analiza CIU MS i odpowiednich stanów wiązania ATP pokazuje, że cztery stany związane gamma S ATP zmniejszają stabilność zespoloną w fazie gazowej. Jednak stan związany z sześcioma gamma ATP S, w którym wszystkie miejsca są zajęte, jest postrzegany jako najbardziej stabilny.

Dokładne pomiary masy cząsteczkowej nienaruszonego kompleksu dostarczają cennych informacji na temat charakterystyki biomolekularnej. Możemy uzyskać informacje na temat złożonych szlaków składania, oligomeryzacji białek i wiązania ligandów. Połączenie wszystkich tych informacji pozwala na generowanie szczegółowych modeli funkcjonalnych zespołów biologicznych.