Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas
15 października 2018
Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.
Obecnie spektrometria mas odgrywa ważną rolę w biologii strukturalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ważnych makrocząsteczek biologicznych w ich stanie naturalnym, zwłaszcza białek i kompleksów białkowych. Natywna spektrometria mas ma szerokie zastosowanie w różnych zespołach biomolekularnych, w tym w układach wielobiałkowych i kwasów nukleinowych.
Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i bardzo czuła. Może być używany do badania heterogenicznych próbek białek, umożliwia jednoczesną analizę wielu białek w stanie oligomerycznym. Procedurę zademonstruje Andy Lau, doktorant w mojej grupie.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wewnętrzne naczynia włosowate do nanoelektronrozpylania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować próbkę wolną od ligandów jako kontrolę dla każdego przebiegu, ponieważ bufor wymienia się każdą z nich na octan amonu. Następnie wybierz tryby czułości, akwizycji jonów dodatnich i mobilności TOF.
Następnie włącz pułapkę, API i gazy IMS. Do separacji IM użyj pokazanych tutaj punktów początkowych azotu i argonu i dostosuj w razie potrzeby. Ustaw odpowiedni zakres akwizycji m/z.
W przypadku nieznanego białka początkowe kroki optymalizacji powinny wykorzystywać szeroki zakres. Włóż pokrytą złotem kapilę do uchwytu kapilary. Następnie załaduj od dwóch do trzech mikrolitrów interesującego nas roztworu kompleksu białkowego do kapilary.
Delikatnie dokręć kapilarnę i umieść ją na stopniu źródła elektrorozpylania. Przesuń stolik w odpowiednie miejsce, aby rozpocząć pobieranie danych. Zastosuj niskie ciśnienie gazu nano-flow, aż na końcu kapilary utworzy się kropla.
Przesuń kapilarę w stosunku do stożka i monitoruj prąd jonowy, aby uzyskać stabilny prąd jonowy. Zastosuj napięcie kapilarne w zakresie od 0,9 do 1,6 kilowolta. Następnie ustaw stożek pobierania próbek, przesunięcie źródła, temperaturę źródła i przepływ gazu w stożku zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby uzyskać dobrze rozdzielcze widmo masowe i zmaksymalizowaną transmisję jonów, dostosuj parametry MS i monitoruj wynikającą z tego zmianę widm. Ustaw energię zderzenia pułapki na początkowy punkt początkowy między 10 a 50 woltów. Jeśli przesunięcia napięcia są niewystarczające, dostosuj energie zderzenia pułapki.
Ustaw pułapkę za pomocą jej napięcia na początkowy punkt początkowy między 20 a 45 woltów. Popraw desolwatację, optymalizując to napięcie. Następnie zoptymalizuj prędkość fali i wysokość fali, jak opisano w tekście, aby uzyskać najlepszą separację mobilności.
W badaniach z udziałem HerA i NurA należy przyjąć prędkość fali 40 metrów na sekundę i wysokość fali od 550 do 650 woltów. W celu analizy wiązania DNA należy wymieszać białko i DNA w stosunku molowym, który pozwala na tworzenie kompleksu białkowego DNA. Dodaj rosnące ilości któregokolwiek z poniższych, 5'O-3-tio-trifosforanu, soli tetralitu lub ADP.
Za pomocą odpowiedniego oprogramowania zmierz masy generowanych gatunków i zidentyfikuj wiązania ligandów, takie jak wiązanie ATP i ADP oraz stany oligomeryczne. Następnie należy wykorzystać intensywności jonów obserwowane w surowych widmach ESI MS, aby określić ilościowo odpowiadającą im względną liczebność gatunków. Po zoptymalizowaniu warunków przyrządu w celu zapewnienia stabilnej transmisji, należy jak najniżej zmniejszyć energię zderzenia i stożek próbkowania, zachowując przy tym dobrą jakość widm.
Użyj wcześniej określonej zoptymalizowanej prędkości fali i wysokości fali, aby uzyskać IM MS. Zmierz czas dryfu jonów przy trzech różnych prędkościach fal przy zachowaniu tej samej wysokości fali. Aby określić jon białkowy, CCS zmierzył cztery kalibry białek, dwa z masą powyżej badanego białka i dwa z masą poniżej, używając tych samych warunków oprzyrządowania. Najpierw przygotuj próbki białek i zbuforuj je wymień na octan amonu, jak opisano w protokole tekstowym.
Dodawaj rozpuszczalnik w 10% odstępach, aż do osiągnięcia pożądanej ilości. Inkubować na lodzie przez godzinę. Następnie należy uzyskać widmo IM-MS dla każdej próbki.
Korzystając z oprogramowania SUMMIT, przypisz podkompleksy białkowe i wygeneruj sieci interakcji białkowych. Alternatywnie można ręcznie wygenerować listę teoretycznych mas dla oczekiwanych gatunków. Aby rozpocząć badanie stabilności kompleksu białkowego, zapisz dane IM-MS, jednocześnie zwiększając napięcie przyspieszenia pułapki z 10 woltów do 200 woltów, które będzie stopniowo rozwijać się do białka i fazy gazowej.
Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania i generuj dwuwymiarowe wykresy rozwijające, układając znormalizowane rozkłady intensywności CCS przy każdym przyspieszającym napięciu dla każdego stanu ładowania. Wyniki natywnego stwardnienia rozsianego ujawniają stan oligomeryczny, skład i topologię kompleksu HerA i NurA. Ponieważ oddziaływania niekowalencyjne są zachowane w fazie gazowej, natywne MS eksperymentów miareczkowania gamma S i ADP są wykorzystywane do określenia wiązania nukleotydów parami w HerA i NurA.
Widma masowe stanów oligomerycznych HerA ujawniają, że zwiększenie stężenia gamma S ATP zwiększa względną intensywność heksamerycznego HerA. Eksperymentalne wartości CCS dla białek i ich kompleksów są następnie uzyskiwane z eksperymentów IM-MS. Uważa się, że wartości te są dobrze zgodne z teoretycznymi pomiarami krystalografii rentgenowskiej, która weryfikuje wykorzystanie wartości CCS do budowania modeli składania białek o niskiej rozdzielczości.
Analiza CIU i KEcom ujawnia, że HerA-NurA związana z DNA jest bardziej stabilna niż kompleks wolny od DNA. Analiza CIU MS i odpowiednich stanów wiązania ATP pokazuje, że cztery stany związane gamma S ATP zmniejszają stabilność zespoloną w fazie gazowej. Jednak stan związany z sześcioma gamma ATP S, w którym wszystkie miejsca są zajęte, jest postrzegany jako najbardziej stabilny.
Dokładne pomiary masy cząsteczkowej nienaruszonego kompleksu dostarczają cennych informacji na temat charakterystyki biomolekularnej. Możemy uzyskać informacje na temat złożonych szlaków składania, oligomeryzacji białek i wiązania ligandów. Połączenie wszystkich tych informacji pozwala na generowanie szczegółowych modeli funkcjonalnych zespołów biologicznych.
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia zastosowanie spektrometrii mas (MS) w biologii strukturalnej, w szczególności w analizie kompleksów białkowych oraz oddziaływań z ligandami. Integracja technik opartych na MS umożliwia badanie assemblacji makromolekularnych w ich stanach natywnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Spektrometria mas
- Analiza kompleksów białkowych
Wstęp
- Spektrometria mas jest kluczowa dla badania biologicznych makrocząsteczek.
- Natywna spektrometria mas umożliwia analizę białek w ich stanach natywnych.
- Technika ta jest szybka i wysoce czuła.
- Pozwala ona na jednoczesną analizę wielu białek w stanach oligomerycznych.
Cel badania
- W celu zademonstrowania zastosowania spektrometrii mas w analizie tworzenia kompleksów białkowych oraz wiązania ligandów.
- W celu optymalizacji parametrów MS dla lepszego pozyskiwania danych.
- W celu dostarczenia informacji na temat charakterystyki biomolekularnej i stabilności kompleksów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek białek i wymiana buforu.
- Optymalizacja parametrów MS w celu uzyskania odpowiedniej transmisji jonów i rozdzielczości.
- Zastosowanie spektrometrii mobilności jonowej (IMS) do analizy kompleksów białkowych.
- Analiza danych z wykorzystaniem oprogramowania do generowania sieci oddziaływań białkowych.
Główne wyniki
- Natywna spektrometria mas (MS) pozwala na ujawnienie stanów oligomerycznych oraz oddziaływań wiążących białek.
- Wyniki eksperymentalne są zgodne z pomiarami teoretycznymi uzyskanymi za pomocą krystalografii rentgenowskiej.
- Stabilność kompleksów białkowych można ocenić poprzez regulację energii kolizyjnej.
- Analiza wiązania ligandów dostarcza informacji na temat oddziaływań białko-DNA.
Wnioski
- Spektrometria mas jest potężnym narzędziem do badania dynamiki białek.
- Pozwala ona na generowanie szczegółowych modeli kompleksów biologicznych.
- Zrozumienie stabilności kompleksów oraz oddziaływań z ligandami jest kluczowe dla badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zintegrowana strukturalna spektrometria mas pozwala zespołom biofarmaceutycznym na zmniejszenie ryzyka podczas walidacji celu, dostarczając ilościowych informacji o stanie natywnym w zakresie montażu kompleksów białkowych, oligomeryzacji oraz wiązania ligandów. Podejście to wspiera wczesne decyzje w procesie odkrywania poprzez zapewnienie pewności strukturalnej w odniesieniu do hipotez mechanistycznych oraz redukcję niejednoznaczności w walidacji szlaków. Metoda ta zwiększa wartość prognostyczną w identyfikacji związków wiodących i rozwoju przedklinicznym, dostarczając powtarzalnych, międzyplatformowych danych strukturalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośredni pomiar stanów oligomeryzacji białek i stechiometrii podjednostek w warunkach natywnych.
- Wartość naukowa: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez charakteryzację indukowanych ligandem zmian konformacyjnych oraz interfejsów wiązania w kompleksach białko-naprawa DNA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybki i czuły skrining heterogenicznych próbek w celu oceny zaangażowania celu i tworzenia kompleksów w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wyznaczenie ilościowych przekrojów czynnych zderzeń (CCS) wywodzonych z ruchliwości jonów, które służą jako wzorce strukturalne dla standaryzacji i powtarzalności analiz.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów prac poprzez potwierdzenie integralności kompleksu oraz zajętości ligandów przed przesiewaniem związków.
- Wartość operacyjna: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki standaryzowanym protokołom wymiany buforu i przygotowania kapilar, które można zastosować dla wielu białek docelowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych pod kątem chorób informacji strukturalnych na temat kompleksów białek wiążących DNA, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów dla celów zaangażowanych w szlaki replikacji i naprawy.
- Wartość naukowa: Umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez korelację stopnia zajętości ligandem (np. ATP/ADP) ze stabilnością kompleksu za pomocą analiz rozwijania indukowanego zderzeniami oraz dystrybucji energii kinetycznej.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając ilościowych wskaźników stabilności, które stanowią podstawę kryteriów go/no-go w walidacji przedklinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną — dostarczając danych strukturalnych, które służą do weryfikacji hipotez, oceny związków oraz zachowania ciągłości translacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez rozstrzyganie stanów oligomerycznych oraz topologii kompleksów białkowych zaangażowanych w mechanizmy naprawy DNA.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość analizy dzięki powtarzalnemu rozdziałowi w mobilności jonowej oraz detekcji spektrometrycznej masy stanów apo i związanych z ligandem.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów masy, przekroju poprzecznego zderzeń oraz względnej zawartości, co umożliwia porównanie warunków wiązania ligandów i stabilności kompleksów.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację modeli strukturalnych w oparciu o eksperymentalne dane CCS, wspierając wybór celów zgodnych z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody charakterystyki różnorodnych kompleksów białkowych, w tym systemów błonowych i wiążących DNA, w ramach wielu projektów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej obserwacji zmian strukturalnych indukowanych przez ligand.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki zoptymalizowanym parametrom aparatury oraz ustandaryzowanym przepływom pracy w przygotowaniu próbek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając dowodów strukturalnych na wiązanie celu i stabilność kompleksu, co zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane profile strukturalne i dynamiczne uzyskane z danych natywnej MS.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie natywnej spektrometrii mas, mobilności jonów oraz interpretacji danych strukturalnych.
- Zależne od dostępu do platform MS o wysokiej rozdzielczości z funkcjami IM-MS i skalibrowaną kontrolą energii kolizyjnej.
- Wymaga standaryzacji przygotowania próbek pomiędzy zespołami, w tym wymiany buforu na lotny octan amonu.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów do różnych rozmiarów białek, kompleksów i typów ligandów w różnych systemach biologicznych.
- Wiadze się z praktycznymi ograniczeniami dotyczącymi stabilności kompleksów w fazie gazowej oraz koniecznością ortogonalnej walidacji za pomocą krystalografii lub cryo-EM w celu modelowania o wysokiej rozdzielczości.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Native MS Acquisition and Analysis for Investigating Protein Complexes and Protein-Ligand Complexes
3:51
Acquiring and Analyzing IM-MS
4:34
In-Solution Disruption of Protein Complexes for Native MS and IM-MS Led Structure Determination and Investigating Protein Complex Stability using Collision Induced Unfolding
5:45
Results: Integrative Structural Mass Spectrometry of Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes
7:05
Conclusion
