Name: Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj natywną spektrometrię mas do analizy kompleksów białkowych i interakcji z ligandami. Ta metoda pozwala badać makromolekularne zespoły w ich natywnym stanie z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Karlowi-Peterowi Hopfnerowi i Robertowi Thomasowi Byrne'owi za uprzejme dostarczenie próbek białek HerA i HerA-NurA oraz za pomoc w projektowaniu eksperymentalnym. Dziękujemy również dr Eamonnowi Readingowi za jego recenzję manuskryptu. Z wdzięcznością dziękujemy naszym instytucjom finansującym: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] i Royal Society [RG150216 do A.P.].

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Stwardnienie rozsiane odgrywa coraz ważniejszą rolę w charakterystyce stechiometrii, oddziaływań i architektury podjednostek kompleksów białkowych. Dane IM-MS mogą być wykorzystywane do definiowania układów topologicznych podjednostek w obrębie kompleksów wieloskładnikowych. W porównaniu z innymi istniejącymi metodami biologii strukturalnej, stwardnienie rozsiane ma kilka zalet. Natywne stwardnienie rozsiane jest szybką i bardzo czułą techniką i może być stosowane do badania heterogenicznych próbek białek. W połączeniu z eksperymentami z zakłóceniami w roztworze można monitorować szlaki dysocjacji zespołów białek. Wraz ze strukturami krystalicznymi lub modelami homologii, informacje oferowane przez strukturalne stwardnienie rozsiane stanowią narzędzie do badania interakcji białko-ligand i dostarczają niemal natywnych modeli i ścieżek składania11.
W tym miejscu opisujemy niezbędne procedury eksperymentalne do analizy stechiometrii i składu oddziaływań białko-ligand, z jednym lub więcej ligandami, przy użyciu integracyjnego MS. Obejmuje to przygotowanie próbek MS, pozyskiwanie danych, analizę danych oraz integrację danych MS za pomocą narzędzi obliczeniowych. W tym celu jako nasz system modelowy użyliśmy heterooligomerycznego kompleksu białkowego HerA-NurA do resekcji DNA, związanego z trzema ligandami (DNA, ATP i ADP). Protokół pokazuje wykorzystanie obecnie dostępnego oprogramowania wspomagającego analizę i prezentację danych.
Uzyskanie wysokiej jakości widm jest ważne dla analizy wiązania ligandów, dlatego kluczowe znaczenie mają staranne etapy przygotowania próbki, w tym oczyszczanie białka, miareczkowanie ligandów i wymiana. Jednym z ograniczeń natywnego stwardnienia rozsianego nESI podczas badania wiązania ligandów jest niespecyficzne wiązanie. Niespecyficzne wiązanie zachodzi podczas desolwatacji kropel w całym procesie elektrorozpylania. Zwiększa to stężenie ligandów, a tym samym zmienia stosunek białka do liganda29. Wiązanie nukleotydów powoduje stosunkowo niewielką różnicę masy między apo a białkiem związanym z nukleotydem, co nie zmienia wydajności jonizacji50,51.
Do naszej pracy wykorzystaliśmy system Synapt G2-Si MS, ale protokoły mają zastosowanie do różnych badań innych kompleksów białko-ligand przy użyciu innych dostępnych na rynku spektrometrów masowych nano-elektrorozpylania. Integracyjne strukturalne państwa członkowskie odgrywają coraz ważniejszą rolę w rozwiązywaniu problemów biologicznych o większej złożoności. Opisany tutaj przepływ pracy i techniki są dobrze przystosowane do zrozumienia konsekwencji strukturalnych i mechanizmów budowania kompleksu białkowego i tworzenia białka-liganda, które są trudne do zbadania przy użyciu konwencjonalnych technik strukturalnych.

Natywna analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek i ich kompleksów jest przeprowadzana za pomocą jonizacji elektrorozpylania i nano-elektrorozpylania (nESI), które zachowują fałdowanie białek i interakcje niekowalencyjne podczas procesu jonizacji1,2. W natywnym MS struktura białek i ich kompleksów jest zachowywana w stanie zbliżonym do natywnego w fazie gazowej 3,4. Natywny MS wykrywa wiele naładowanych jonów białkowych, które są rozdzielane zgodnie ze stosunkiem masy do ładunku (m/z), co pozwala na obliczenie masy białka lub kompleksu białko-ligand. Informacje te umożliwiają określenie stechiometrii nienaruszonego białka, składu podjednostek, wiązania ligandów i sieci interakcji3,4,5,6. Natywne stwardnienie rozsiane ma kilka zalet w porównaniu z innymi technikami, takimi jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego5. Po pierwsze, natywne MS jest szybką i bardzo czułą techniką, wymagającą tylko kilku mikrolitrów (2-3 μl) próbki o stosunkowo niskich końcowych stężeniach kompleksu w zakresie od wysokiego nM do niskiego μM6. Po drugie, natywne stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do badania heterogenicznych próbek białek, co umożliwia jednoczesną analizę wielu białek i stanów oligomerycznych. Po trzecie, natywne stwardnienie rozsiane nie wymaga modyfikacji próbek białek przed analizą poprzez sieciowanie chemiczne lub znakowanie białek. Te zalety sprawiły, że strukturalny MS stał się potężnym narzędziem do badań strukturalnych kompleksów białkowych.
Natywne MS można połączyć z ruchliwością jonów (IM), techniką, która mierzy czas potrzebny jonowi białka na przejście przez pole elektryczne, umożliwiając określenie przekroju kolizyjnego (CCS). CCS dostarcza informacji strukturalnych o niskiej rozdzielczości, co umożliwia uzyskanie informacji o topologii i niejednorodności konformacyjnej białek. Ponadto umożliwia badanie modeli strukturalnych białek generowanych za pomocą podejść obliczeniowych.
Stabilność fazy gazowej białka można badać za pomocą rozwijania wywołanego zderzeniem (CIU) mierzonego za pomocą IM-MS. Podczas procesu CIU jony białkowe są przyspieszane i aktywowane poprzez zwiększone przyspieszanie zderzeń z obojętnym gazem buforowym w spektrometrze masowym7,8,9. Ten proces aktywacji kolizyjnej powoduje częściowe rozwinięcie się białka, co przekłada się na wzrost CCS. Ta zmiana w CCS i energii potrzebnej do rozwinięcia białka może być mierzona za pomocą IM-MS. Korzystając z tego podejścia, można zmierzyć wpływ wiązania ligandów na stabilność białka10. Podkompleksy można generować w roztworze przy użyciu metod rozbijania w roztworze, takich jak dodawanie rozpuszczalników organicznych w celu monitorowania natywnych topologii kompleksów białkowych. Rozerwanie kompleksów białkowych jest głównie spowodowane rozerwaniem oddziaływań wewnątrzkowalencyjnych. Podkompleksy utrzymują topologie podobne do natywnych, a po wykryciu stwardnienia rozsianego ujawniają informacje o łączności między podjednostkami.
Integracyjne podejścia w biologii strukturalnej łączą różne metody badania struktury i dynamiki białek i ich kompleksów3,4,5,6. Natywne MS i IM-MS zostały wykorzystane do odkrycia szczegółów molekularnych trudnych systemów biologicznych. Pojawiło się kilka przykładów zastosowań, w tym badanie szlaków składania białek11,12,13,14, badanie sieci interakcji białko-białko15,16,17, białka błonowe6,18,19,20,21, oraz interakcje białko-ligand, takie jak kwasy nukleinowe22,23,24.
Jednak natywny MS ma również swoje ograniczenia. Natywne pomiary MS są często wykonywane w lotnych, takich jak wodny octan amonu, w których niektóre białka nie zachowują swojego złożonego stanu natywnego3,25. Niemniej jednak ostatnie prace wykazały, że to ograniczenie można przezwyciężyć poprzez optymalizację średnicy końcówki igły do natryskiwania (końcówki 0,5 mm) w taki sposób, aby białka i jony złożone z białek mogły być tworzone bezpośrednio z nielotnych o wysokiej sile jonowej, które lepiej naśladują środowisko fizjologiczne26. Dodatkowo, natywny MS wykorzystuje elektrospray do jonizacji i przenoszenia zespołów niekowalencyjnych z roztworu do fazy gazowej; W związku z tym względna obfitość wykrytych kompleksów może nie w pełni odzwierciedlać tę w solution5,27. Co więcej, w porównaniu do roztworu, oddziaływania hydrofobowe w fazie gazowej stają się słabsze, a oddziaływania elektrostatyczne stają się silniejsze, a tym samym faworyzowane3,28.
W tym artykule przedstawiamy protokoły, analizę danych i interpretację do identyfikacji białek i wiązania ligandów za pomocą natywnych MS, IM-MS, CIU, zakłóceń w roztworze i modelowania. Kompleks naprawy DNA, HerA-NurA, jest używany jako system modelowy. Dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) są jedną z najbardziej cytotoksycznych i szkodliwych form uszkodzenia DNA, powodującą niestabilność genetyczną i ostateczny rozwój raka u ludzi. Rekombinacja homologiczna jest mechanizmem naprawczym, który eliminuje DSB, proces, który jest koordynowany przez zależny od ATP kompleks helikaza-nukleaza, HerA-NurA22.
Połączenie natywnych MS i IM-MS z funkcjonalnymi testami i modelowaniem pozwoliło na zbadanie: i) roli NurA w składaniu, konformacji i stabilności kompleksu, ii) interakcji między dsDNA a kompleksem i jej wpływu na ogólną stabilność kompleksu, oraz iii) stechiometrii i wpływu wiązania ATP na złożenie22. Podsumowując, prace te doprowadziły do lepszego zrozumienia molekularnych podstaw kompleksu HerA-NurA poprzez powiązanie zmian konformacyjnych i stabilności kompleksu białkowego z wiązaniem nukleotydów. Protokół ten jest ogólny dla każdego kompleksu białkowego, który oddziałuje z jednym lub kilkoma typami ligandów.

<table><tbody><tr><td>Sól tetralitowa adenozyny 5&prime;-(3-tiotrifosforanu) Merck</td><td>Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5&prime;-difosforan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór octanu amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do chromatografii mikro biospinowej</td><td>Koncentrator Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe</td><td>Aparat Harvard</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Białka to ważna klasa biologicznych makromolekuł, które odgrywają wiele kluczowych ról w funkcjach komórkowych, w tym ekspresji genów, katalizowaniu reakcji metabolicznych, naprawie i replikacji DNA. Dlatego szczegółowe zrozumienie tych procesów dostarcza krytycznych informacji na temat funkcjonowania komórek. Integracyjne strukturalne metody MS dostarczają strukturalnych i dynamicznych informacji na temat składania kompleksów białkowych, złożonych połączeń, stechiometrii podjednostek, oligomeryzacji białek i wiązania ligandów. Niedawne postępy w dziedzinie integracyjnego strukturalnego stwardnienia rozsianego pozwoliły na scharakteryzowanie trudnych systemów biologicznych, w tym dużych białek wiążących DNA i białek błonowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób integrować różnorodne dane MS, takie jak natywne MS i spektrometria mas ruchliwości jonów (IM-MS) z symulacjami dynamiki molekularnej w celu uzyskania wglądu w kompleks białkowy naprawy DNA helikazy i nukleazy. Uzyskane w ten sposób podejście stanowi podstawę do szczegółowych badań nad wiązaniem ligandów z innymi kompleksami białkowymi zaangażowanymi w ważne procesy biologiczne.

Wyniki natywnej spektrometrii mas (native MS) ujawniły stan oligomeryczny, skład oraz topologię kompleksu HerA-NurA (Rysunek 1). Ponieważ oddziaływania niewiążące są zachowane w fazie gazowej, natywna MS w eksperymentach miareczkowania ATP-γ-S i ADP pozwoliła określić wiązanie poszczególnych nukleotydów z HerA-NurA (Rysunek 2) oraz wykazała, że zwiększenie stężenia ATP-γ-S zwiększa względną intensywność heksamerycznego HerA (Rysunek 3). Informacje strukturalne dotyczące oddziaływań między podjednostkami uzyskano poprzez dysocjację w roztworze, po której przeprowadzono natywną MS; wyniki te były zgodne z masami teoretycznymi (Rysunek 4 i Tabela 1).
Eksperymentalne wartości CCS białek i ich kompleksów uzyskano w drodze eksperymentów IM-MS (Rycina 5). Wartości te stanowią uśrednione rotacyjnie obliczenia przekroju czynnego w fazie gazowej dla kształtu cząsteczki i opisują stan wymiarowy białka. Wartości CCS są porównywane z pomiarami teoretycznymi z krystalografii rentgenowskiej, a ich zgodność świadczy o zachowaniu natywnego kształtu w fazie gazowej. (Tabela 1)Potwierdza to zasadność wykorzystania wartości CCS do budowania niskorozdzielczych modeli kompleksu białkowego48.
Eksperymentalne wartości CCS można obliczyć dla każdego stanu ładunkowego jonu. Konformer białka o strukturze zbliżonej do natywnej może generować jony o różnych stanach ładunkowych o podobnych wartościach CCS. Jednak jony o wyższym stanie ładunkowym wykazują zwiększone odpychanie kulombowskie, co może prowadzić do rozfałdowania białka w fazie gazowej i uzyskania większych wartości CCS w porównaniu z teoretycznymi wartościami CCS. Dlatego zazwyczaj wykorzystuje się wartości CCS dla jonów o najniższym stanie ładunkowym49. W przypadku kompleksu HerA-NurA eksperymenty z dysocjacją w roztworze białek HerA oraz HerA-NurA z DNA i bez DNA pozwoliły na zaproponowanie ścieżki składania kompleksu, rozpoczynającej się od monomerów, które następnie tworzą cały kompleks heksamerycznego HerA (HerA6)-dimerycznego NurA (NurA2) z DNA (Rycina 6).
Różnice w wykresach rozwijania CIU pomiędzy formą apo (wolną od liganda) a formą związaną z ligandem definiują zmianę stabilności kompleksu po związaniu liganda. Wyższa wartość CV50 lub KECOM oznacza bardziej stabilną jon w fazie gazowej. Analiza CIU i KECOM wykazała, że HerA-NurA związany z DNA jest bardziej stabilny niż kompleks wolny od DNA (Rysunek 7Aii). Z analizy CIU-MS w odpowiednich stanach wiązania ATP wynika, że stan z czterema związanymi ATP-γ-S zmniejszył stabilność kompleksu w fazie gazowej, a najstabilniejszy był stan z sześcioma związanymi ATP-γ-S, w którym wszystkie miejsca były zajęte (Rysunek 7Bii). Natywna MS może ujawnić dyskretne stany wiązania nukleotydów HerA; nie potrafi jednak rozróżnić, które podjednostki HerA wiążą ATP i gdzie to wiązanie ma miejsce. Informacje te można uzyskać z symulacji MD w jawnych rozpuszczalnikach dla heksamerycznego HerA oraz kompleksu HerA-NurA, postępując zgodnie z podsumowanym schematem postępowania (Rysunek 8).
<img alt="Schemat spektrometrii mas tworzenia kompleksu DNA-białko ze spektrami m/z; wykres słupkowy intensywności względnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Badanie stanu oligomerycznego, składu i topologii kompleksu niekowalencyjnego HerA-NurA. (A) Widma mas HerA, HerA-NurA oraz HerA-NurA w obecności DNA (dwuniciowe DNA 25 bp o masie 15,4 kDa). Podkompleks HerA występuje zarówno jako heksamer, jak i heptamer. Dimer NurA wiąże się z heksamerem HerA, wymuszając konwersję oligomeryczną. DNA wiąże się z utworzonym kompleksem HerA-NurA (Wyniki zaadaptowane z Z. Ahdash) i wsp., 201722). (B) Względne intensywności zidentyfikowanych gatunków obliczono przy użyciu programu UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza spektrometrią masową; kompleks HerA-NurA; wpływ ATP, ADP; diagram widma; badanie białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Natywna spektrometria mas z jonizacją elektrosprayową (ESI-MS) ujawnia mechanizm wiązania nukleotydów z kompleksem HerA-NurA. Widma masowe (A) HerA-NurA oraz (B) HerA-NurA-DNA przy zwiększających się stężeniach (i) ATP-γ-S i (ii) ADP. Zmierzone masy zestawiono z masami teoretycznymi, a następnie określono liczbę związanych cząsteczek ATP-γ-S lub ADP. Zmierzone masy oraz liczba związanych nukleotydów są przedstawione na widmach. Eksperymenty z miareczkowaniem ATP-γ-S i ADP pozwoliły określić parowe wiązanie nukleotydów z samym kompleksem HerA-NurA oraz w kompleksie z DNA, co wskazuje na cykliczny mechanizm reakcji (wyniki zaadaptowane z Z. Ahdash) i in., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres analizy spektrometrycznej; wiązanie ATP, intensywność w funkcji m/z, względne poziomy oddziaływań białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Pomiar wpływu rosnących stężeń ATP-γ-S na stan oligomeryczny HerA. (A) Widma masowe HerA przy rosnących stężeniach ATP-γ-S. (B) Wykres przedstawiający względne intensywności różnych gatunków z natywnej MS obliczone przy użyciu oprogramowania do dekonwolucji UniDec32Wraz ze wzrostem stężenia ATP-γ-S wzrasta również względna intensywność heksamerowego HerA. Liczba związanych cząsteczek ATP-γ-S została naniesiona na widma (wyniki zaadaptowane z Z. Ahdash). i wsp., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza spektrometrią mas; kompleksy HerA, NurA z dsDNA w roztworach acetonitrylu i metanolu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4Widma mas i produkty dysocjacji podkompleksów (A) HerA oraz (B) HerA-NurA (i) osobno i w obecności (ii) DNA po rozbiciu w roztworze. Eksperymenty z rozbiciem w roztworze przeprowadzono przy użyciu 10–40% acetonitrylu, metanolu (MeOH) lub dimetylosulfotlenku (DMSO), co doprowadziło do powstania różnych podkompleksów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza kompleksu białko-DNA; wykres CCS spektrometrii mas; widma subkompleksów i kompleksów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Rozkłady czasów przylotu w spektrometrii mobilności jonowej przedstawione na osi CCS dla kompleksów oraz powstałych podkompleksów. Ikony dla każdego podkompleksu odpowiadają tym naniesionym na widma w Rysunek 4Wartości mas eksperymentalnych i obliczonych oraz wartości CCS dla podkompleksów wymieniono w Tabela 1 wszystkie z nich wykazały zgodność między wartościami eksperymentalnymi a obliczonymi (po uwzględnieniu typowej niepewności rozdzielczości w spektrometrii mas z mobilnością jonów w fali wędrującej wynoszącej ±5-8%)37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat oddziaływania HerA-NurA z dsDNA wraz z procesem tworzenia multimerów, ilustrujący kompleksy białkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6Ścieżka składania kompleksu HerA-NurA wygenerowana na podstawie natywnej spektrometrii mas (native MS) i spektrometrii mas z mobilnością jonową (IM-MS) po rozbiciu w roztworze. Kolorowe okręgi wskazują warunki, w których obserwowano poszczególne podkompleksy: natywne (zielony, przed rozbiciem), metanol (żółty), DMSO (fioletowy) lub acetonitryl (czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza spektrometrią mas kompleksów HerA6-NurA2 z ATP/dsDNA, przedstawiająca wykresy CCS w funkcji napięcia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7Badanie efektu stabilizującego (A) DNA na kompleks HerA-NurA oraz (B) wiązania ATP do kompleksu HerA-NurA-DNA. (i) Wykresy CIU-MS w fazie gazowej oraz (ii) obliczenia energii kolizyjnej w środku masy (KEcom) wykazują, że obecność dsDNA stabilizuje kompleks HerA-NurA i że stan z sześcioma związanymi cząsteczkami ATP-γ-S jest najbardziej stabilny. Przedstawiono stabilizację dla różnych stanów ładunkowych. Wykresy zostały wygenerowane przy użyciu programu PULSAR. 33Wyniki z (A) zaadaptowane z Z. Ahdash i inni, 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat montażu kompleksu białkowego i symulacji dynamiki molekularnej przedstawiający RMSF oraz analizę różnicową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rysunek 8Schemat procedur modelowania dla różnicowych symulacji dynamiki molekularnej. (A) Generowanie badanego kompleksu poprzez budowę topologii z istniejących podjednostek i odbudowę brakujących reszt. (B) Schemat przeprowadzania symulacji dynamiki molekularnej kompleksu białkowego z ligandem i bez liganda. Symulacje dynamiki molekularnej są przeprowadzane dla samego białka, które służy jako referencja i jest odejmowane od symulacji białka z ligandem. Następnie obliczana jest różnicowa średniokwadratowa fluktuacja (RMSF) między symulacjami w celu określenia wpływu wiązania liganda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kompleks / podkompleks</td>
			<td>Masa teoretyczna (kDa)</td>
			<td>Masa eksperymentalna (kDa)</td>
			<td>Teoretyczna powierzchnia kontaktu (Å2)</td>
			<td>Eksperymentalne CCS (Å2) [ładunek]</td>
			<td>Stan HN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6-NurA2</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42+] 
			14599 [43+] 
			14608 [44+] 
			14637 [45+]</td>
			<td>10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6-NurA2-dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39+] 
			14728 [40+] 
			14781 [41+] 
			14837 [42+]</td>
			<td>10% ACN, 10% MeOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NurA1</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10+] 
			2746 [11+] 
			2878 [12+]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NurA2</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16+] 
			4614 [17+] 
			4537 [18+] 
			4666 [19+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA1</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14+] 
			3792 [15+] 
			3950 [16+]</td>
			<td>10-40% ACN, 40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA2</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20+] 
			5747 [21+] 
			5842 [22+] 
			5996 [23+]</td>
			<td>40% metanolu, 10-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA3</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25+] 
			7616 [26+] 
			7717 [27+] 
			7867 [28+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% CAN, 40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26+] 
			7990 [27+] 
			8107 [28+]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA4</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30+] 
			9287 [31] 
			9493 [32+] 
			9961 [33+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA4 +DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31+] 
			9756 [32+] 
			9830 [33+]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA5</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36+] 
			10958 [37+] 
			11161 [38+]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38+] 
			12386 [39+] 
			12498 [40+] 
			12590 [41+] 
			12676 [42+] 
			13019 [43+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6 +DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40+] 
			13081 [41+] 
			13184 [42+] 
			13273 [43+] 
			13463 [44+] 
			13576 [45+]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA7</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42+] 
			14219 [43+] 
			14261 [44+] 
			14285 [45+] 
			14335 [46+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA7 +DNA</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41+] 
			14510 [42+] 
			14558 [43+] 
			14598 [44+] 
			14630 [45+] 
			14641 [46+]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Eksperymentalne i obliczone masy oraz wartości CCS HerA-NurA i jego podkompleksów uzyskanych w badaniach rozpadu w roztworze.

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Obecnie spektrometria mas odgrywa ważną rolę w biologii strukturalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ważnych makrocząsteczek biologicznych w ich stanie naturalnym, zwłaszcza białek i kompleksów białkowych. Natywna spektrometria mas ma szerokie zastosowanie w różnych zespołach biomolekularnych, w tym w układach wielobiałkowych i kwasów nukleinowych.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i bardzo czuła. Może być używany do badania heterogenicznych próbek białek, umożliwia jednoczesną analizę wielu białek w stanie oligomerycznym. Procedurę zademonstruje Andy Lau, doktorant w mojej grupie.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wewnętrzne naczynia włosowate do nanoelektronrozpylania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować próbkę wolną od ligandów jako kontrolę dla każdego przebiegu, ponieważ bufor wymienia się każdą z nich na octan amonu. Następnie wybierz tryby czułości, akwizycji jonów dodatnich i mobilności TOF.Następnie włącz pułapkę, API i gazy IMS. Do separacji IM użyj pokazanych tutaj punktów początkowych azotu i argonu i dostosuj w razie potrzeby. Ustaw odpowiedni zakres akwizycji m/z.W przypadku nieznanego białka początkowe kroki optymalizacji powinny wykorzystywać szeroki zakres. Włóż pokrytą złotem kapilę do uchwytu kapilary. Następnie załaduj od dwóch do trzech mikrolitrów interesującego nas roztworu kompleksu białkowego do kapilary.Delikatnie dokręć kapilarnę i umieść ją na stopniu źródła elektrorozpylania. Przesuń stolik w odpowiednie miejsce, aby rozpocząć pobieranie danych. Zastosuj niskie ciśnienie gazu nano-flow, aż na końcu kapilary utworzy się kropla.Przesuń kapilarę w stosunku do stożka i monitoruj prąd jonowy, aby uzyskać stabilny prąd jonowy. Zastosuj napięcie kapilarne w zakresie od 0,9 do 1,6 kilowolta. Następnie ustaw stożek pobierania próbek, przesunięcie źródła, temperaturę źródła i przepływ gazu w stożku zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby uzyskać dobrze rozdzielcze widmo masowe i zmaksymalizowaną transmisję jonów, dostosuj parametry MS i monitoruj wynikającą z tego zmianę widm. Ustaw energię zderzenia pułapki na początkowy punkt początkowy między 10 a 50 woltów. Jeśli przesunięcia napięcia są niewystarczające, dostosuj energie zderzenia pułapki.Ustaw pułapkę za pomocą jej napięcia na początkowy punkt początkowy między 20 a 45 woltów. Popraw desolwatację, optymalizując to napięcie. Następnie zoptymalizuj prędkość fali i wysokość fali, jak opisano w tekście, aby uzyskać najlepszą separację mobilności.W badaniach z udziałem HerA i NurA należy przyjąć prędkość fali 40 metrów na sekundę i wysokość fali od 550 do 650 woltów. W celu analizy wiązania DNA należy wymieszać białko i DNA w stosunku molowym, który pozwala na tworzenie kompleksu białkowego DNA. Dodaj rosnące ilości któregokolwiek z poniższych, 5'O-3-tio-trifosforanu, soli tetralitu lub ADP.Za pomocą odpowiedniego oprogramowania zmierz masy generowanych gatunków i zidentyfikuj wiązania ligandów, takie jak wiązanie ATP i ADP oraz stany oligomeryczne. Następnie należy wykorzystać intensywności jonów obserwowane w surowych widmach ESI MS, aby określić ilościowo odpowiadającą im względną liczebność gatunków. Po zoptymalizowaniu warunków przyrządu w celu zapewnienia stabilnej transmisji, należy jak najniżej zmniejszyć energię zderzenia i stożek próbkowania, zachowując przy tym dobrą jakość widm.Użyj wcześniej określonej zoptymalizowanej prędkości fali i wysokości fali, aby uzyskać IM MS. Zmierz czas dryfu jonów przy trzech różnych prędkościach fal przy zachowaniu tej samej wysokości fali. Aby określić jon białkowy, CCS zmierzył cztery kalibry białek, dwa z masą powyżej badanego białka i dwa z masą poniżej, używając tych samych warunków oprzyrządowania. Najpierw przygotuj próbki białek i zbuforuj je wymień na octan amonu, jak opisano w protokole tekstowym.Dodawaj rozpuszczalnik w 10% odstępach, aż do osiągnięcia pożądanej ilości. Inkubować na lodzie przez godzinę. Następnie należy uzyskać widmo IM-MS dla każdej próbki.Korzystając z oprogramowania SUMMIT, przypisz podkompleksy białkowe i wygeneruj sieci interakcji białkowych. Alternatywnie można ręcznie wygenerować listę teoretycznych mas dla oczekiwanych gatunków. Aby rozpocząć badanie stabilności kompleksu białkowego, zapisz dane IM-MS, jednocześnie zwiększając napięcie przyspieszenia pułapki z 10 woltów do 200 woltów, które będzie stopniowo rozwijać się do białka i fazy gazowej.Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania i generuj dwuwymiarowe wykresy rozwijające, układając znormalizowane rozkłady intensywności CCS przy każdym przyspieszającym napięciu dla każdego stanu ładowania. Wyniki natywnego stwardnienia rozsianego ujawniają stan oligomeryczny, skład i topologię kompleksu HerA i NurA. Ponieważ oddziaływania niekowalencyjne są zachowane w fazie gazowej, natywne MS eksperymentów miareczkowania gamma S i ADP są wykorzystywane do określenia wiązania nukleotydów parami w HerA i NurA.Widma masowe stanów oligomerycznych HerA ujawniają, że zwiększenie stężenia gamma S ATP zwiększa względną intensywność heksamerycznego HerA. Eksperymentalne wartości CCS dla białek i ich kompleksów są następnie uzyskiwane z eksperymentów IM-MS. Uważa się, że wartości te są dobrze zgodne z teoretycznymi pomiarami krystalografii rentgenowskiej, która weryfikuje wykorzystanie wartości CCS do budowania modeli składania białek o niskiej rozdzielczości.Analiza CIU i KEcom ujawnia, że HerA-NurA związana z DNA jest bardziej stabilna niż kompleks wolny od DNA. Analiza CIU MS i odpowiednich stanów wiązania ATP pokazuje, że cztery stany związane gamma S ATP zmniejszają stabilność zespoloną w fazie gazowej. Jednak stan związany z sześcioma gamma ATP S, w którym wszystkie miejsca są zajęte, jest postrzegany jako najbardziej stabilny.Dokładne pomiary masy cząsteczkowej nienaruszonego kompleksu dostarczają cennych informacji na temat charakterystyki biomolekularnej. Możemy uzyskać informacje na temat złożonych szlaków składania, oligomeryzacji białek i wiązania ligandów. Połączenie wszystkich tych informacji pozwala na generowanie szczegółowych modeli funkcjonalnych zespołów biologicznych.

analyzing-protein-architectures-protein-ligand-complexes-integrative

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Spektrometria mas sprzężona z mobilnością jonów to rozwijająca się technologia fazy gazowej, która rozdziela jony na podstawie ich przekroju czynnego zderzeń oraz masy. Metoda ta dostarcza trójwymiarowych informacji o ogólnej topologii i kształcie kompleksów białkowych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podstawową procedurę konfiguracji i optymalizacji instrumentu, kalibracji czasów dryfu oraz interpretacji danych.

Spektrometria mas z mobilnością jonów w polu falowym T: podstawowe procedury eksperymentalne w analizie kompleksów białkowych

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Poznaj natywną spektrometrię mas do analizy kompleksów białkowych i interakcji z ligandami. Ta metoda pozwala badać makromolekularne zespoły w ich natywnym stanie z wysoką czułością.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów