Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i wiarygodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie autofagii, takie jak sposób regulacja tworzenia autofagosomów i jak różne zabiegi komórkowe i warunki wpływają na masową autoforientację. Główną zaletą tej techniki jest to, że mierzy ona endogenną sekwestrację ładunku. W związku z tym metoda ta ma szerokie zastosowanie i jest niezależna od sztucznej nadekspresji czy wprowadzenia sond ładunkowych.

Procedurę zademonstrują Paula Szalai i Morten Luhr, doktoranci z mojego laboratorium. Na początek hoduj przylegające komórki w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozwól komórkom rosnąć, aż dotrą do prawie zlewającej się warstwy komórek.

Następnie umyj komórki trzema mililitrami PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pH 7,4. Usuń PBS i zastąp go trzema mililitrami 0,25% trypsyny EDTA. Inkubować w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się odłączą.

Następnie zawiesić komórki w siedmiu mililitrach pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i przenieść do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Za pomocą końcówki pipety o pojemności od 0,5 do 20 mikrolitrów przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do probówki mikrowirówki zawierającej 10 mikrolitrów błękitu trypanowego. Użyj tej samej końcówki pipety, aby natychmiast napełnić szkiełko komory liczącej i policzyć komórki w automatycznym liczniku komórek.

Następnie użyć pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, aby przygotować odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny komórek. Stosując techniki aseptyki, wysiewać jeden mililitr zawiesiny rozcieńczonych komórek do każdej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek.

Przy pożądanych zabiegach doświadczalnych pozostawia się jeden zestaw studzienek nieoczyszczonych w celu określenia poziomów tła sedymentacyjnego LDH. Trzy do czterech godzin przed zbiorami dodaj do każdej studzienki nasyconą ilość inhibitora po sekwestracji, Bafilomycyny A1. Inkubować w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec okresu leczenia odsysa się w celu zassania medium. Do każdej studzienki dodać 200 mikrolitrów roztworu do oddzielania komórek podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą.

Do każdej studzienki dodać 500 mikrolitrów PBS o temperaturze pokojowej i pH 7,4 zawierającej 2% BSA. Za pomocą pipety zawiesić każdą studzienkę, aż nie będą widoczne grudki komórek. Następnie natychmiast przenieś zawiesinę komórek w każdej studzience do oddzielnej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie.

Odwirować probówki w temperaturze 400 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby osadzić komórki. Użyj ssania, aby dokładnie zassać supernatant, pozostawiając granulki komórek tak suche, jak to możliwe. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu zawierającego 10% sacharozy w ultra czystej wodzie do każdej probówki.

Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad komórek, aby uzyskać zawiesinę prawie pojedynczej komórki. Przenieś tę zawiesinę do czteromilimetrowej kuwety do elektroporacji. Umieść kuwetę w elektroporatorze fali rozpadu wykładniczego i wyładuj pojedynczy impuls elektryczny o napięciu 800 woltów, 25 mikrofaradach i 400 omach.

Użyj nowej końcówki pipety, aby przenieść rozdrobnioną komórkę do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 400 mikrolitrów lodowatego roztworu sacharozy buforowanego fosforanem i krótko wymieszać przez pipetowanie. Powtórzyć ten proces zawieszania, elektrozakłócenia i mieszania dla każdej próbki. Jeśli wykonujesz zabieg po raz pierwszy, upewnij się, że zweryfikowałeś skuteczne i selektywne elektrozakłócenie błony plazmatycznej zgodnie z opisem w tekście.

Aby uzyskać osadzone frakcje LDH, należy usunąć 550 mikrolitrów z każdego rozcieńczonego roztworu zaburzającego tworzenie komórek i przenieść go do własnej dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej 900 mikrolitrów lodowatego buforu do zawieszania z 0,5% BSA i 0,01% Tween 20. Krótko odpipetować do wymieszania. Wirować przy 18 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 45 minut, aby wytworzyć granulki zawierające osadzony LDH.

Za pomocą odsysania dokładnie odessać supernatant, aby pozostawić granulki tak suche, jak to możliwe. Przechowuj osadzone próbki LDH w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do analizy. Aby uzyskać całkowite frakcje LDH, przenieś 150 mikrolitrów z każdego z rozcieńczonych roztworów zaburzających komórki do własnej nowej probówki.

Przechowuj je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do analizy. Rozmrozić zarówno osadzony LDH, jak i wszystkie próbki LDH na lodzie. Po rozmrożeniu dodaj 300 mikrolitrów lodowatego buforu do reprodukcji zawierającego 1,5% Triton X-405 do całkowitych próbek LDH.

Obracaj próbki na wałku w chłodnym pomieszczeniu przez 30 minut. Następnie dodaj 750 mikrolitrów lodowatego buforu do zawieszania zawierającego 1% Triton X-405 do osadzonych próbek LDH. Za pomocą pipety zawiesić granulki, aż roztwór będzie jednorodny.

Odwirować wszystkie próbki w temperaturze 18 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby osadzać nierozpuszczone resztki komórkowe. Po zakończeniu wirowania umieścić próbki na lodzie. Oznaczyć poziomy LDH w supernatantach za pomocą klasycznego testu enzymatycznego, jak opisano w tekście, lub dowolnego z szerokiej gamy dostępnych na rynku zestawów.

W tym badaniu masowa aktywność sekwestracji autofagicznej jest monitorowana w wielu różnych liniach komórkowych ssaków. Jak pokazano tutaj, zarówno podstawowa, jak i indukowana głodem sekwestracja LDH oraz komórki LNCaP są całkowicie zniesione przez inhibitor kinazy pan-PI3, 3MA. Selektywny inhibitor kinazy PI3 klasy trzeciej, SAR-405 i inhibitor pompy wapniowej ER, Thapsigargin.

W komórkach HEK293 sekwestracja LDH w warunkach głodu jest silnie zmniejszona zarówno przez Thapsigarginę, jak i przez inhibitor ULK, MRT 67307. Co więcej, wykazano, że sekwestracja LDH wywołana głodem jest konsekwentnie hamowana przez 3MA w innych obserwowanych liniach komórkowych. Następnie stosuje się różne MEF-y z nokautem genu ATG w celu przetestowania, czy geny związane z autofagią, które są niezbędne do tworzenia autofagosomów, są wymagane do sekwestracji LDH.

Jak widać, sekwestracja LDH wywołana głodem została zniesiona w MEFS z nokautem ATG5. Co więcej, jest również stępiony w nokautujących MEF-ach ATG7 i ATG9A. Na koniec określono efekty wyciszania kluczowych transkryptów genu ATG za pośrednictwem RNAi.

Obserwuje się, że transfekcja za pomocą siRNA ukierunkowanego na ATG9A lub z połączonym celowaniem w ULK1 i ULK2 znacznie zmniejsza sekwestrację LDH w komórkach LNCaP. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować dokładność na wszystkich etapach pipetowania. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak test długotrwałej degradacji białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zaobserwowano zmiany w aktywności sekwestracji, skutkujące porównywalnymi zmianami w aktywności degradacji autofagicznej.

Po ustaleniu tej metody w liniach komórkowych ssaków, użyliśmy jej do wykazania, że masowa autofagia jest niezależna od rodziny białek LC3 i zamiast tego wymaga GABARAP. Podkreśla to znaczenie stosowania niezależnych od LC3 metod monitorowania aktywności autofagii.