Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak czynniki genetyczne i szlaki regulujące toksyczność białek związanych z chorobą. Główną zaletą tej techniki jest to, że wysoce wydajny proces kojarzenia drożdży jest wykorzystywany do badań przesiewowych modeli drożdży pod kątem dużego zbioru genów bibliotecznych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat toksyczności białek chorób neurodegeneracyjnych, może być również zastosowana do badania innych procesów komórkowych u drożdży, takich jak tolerancja na inne warunki stresowe.

Rozpocznij tę procedurę od porcjowania pięciu mikrolitrów na studzienkę plazmidowego DNA z uporządkowanej biblioteki plazmidów na okrągłe płytki 96-dołkowe. Utrzymuj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zaszczepić 150 mililitrów dekstrozy peptonu drożdżowego lub pożywki YPD w kolbie o pojemności 500 mililitrów kolonią haploidalnego szczepu drożdży W303 Alpha.

Inkubuj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min przez noc. Następnego ranka, po zmierzeniu OD600 w nocnej hodowli, rozcieńczyć kulturę do OD600 0,1 w dwóch litrach YPD. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez około pięć godzin, aż kultura osiągnie OD600 od 0,4 do 0,6.

Aby zebrać kulturę drożdży, napełnij osiem sterylnych butelek wirówek o pojemności 250 mililitrów i wiruj przy 3000 xG przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant bez naruszania osadu. Umyj drożdże zgodnie z opisem w protokole tekstowym i skonsoliduj komórki w dwóch probówkach wirówkowych.

Zawiesić każdą komórkę w 25 mililitrach 0,1-molowego roztworu octanu litu. Połącz zawieszone komórki, dodaj pięć mililitrów DNA plemników łososia i przenieś je do kolby o pojemności 150 mililitrów. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min przez 30 minut.

Po 30 minutach wlej mieszaninę komórek do sterylnego jednorazowego zbiornika na odczynniki. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 35 mikrolitrów mieszaniny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie, zawierającej przygotowaną wcześniej bibliotekę plazmidowego DNA. Wirować 96-dołkowe płytki z prędkością 1000 obr./min przez jedną minutę.

Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez wstrząsania przez 30 minut. Nie układaj talerzy w stosy, aby ciepło mogło przepływać bardziej efektywnie. Wyjmij 96-dołkowe płytki z inkubatora o temperaturze 30 stopni Celsjusza i mieszaj je z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund.

Dodaj 125 mikrolitrów buforu transformacyjnego do każdej studzienki, a następnie wiruj płytki z prędkością 1000 obr./min przez jedną minutę. Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie poddaj drożdże szokowi termicznemu, umieszczając płytki w inkubatorze o temperaturze 42 stopni Celsjusza na 15 minut.

Odwirować płytki o stężeniu 3000 xG przez pięć minut. Usunąć bufor transformacyjny ze studzienek, odwracając płytki nad pojemnikiem na odpady i mocno zrzucając bufor z płyt. Szybko osusz odwrócone talerze czystym ręcznikiem papierowym, aby usunąć płyn z talerzy.

Przepłukać komórki, dodając do każdej studzienki 200 mikrolitrów minimalnej pożywki odpowiadającej wybieralnemu markerowi na plazmidzie bibliotecznym. Stosuje się tutaj syntetyczne medium ura minus. Odwirować płytki o stężeniu 3000 xG przez pięć minut.

Usunąć supernatant nad pojemnikiem na odpady, jak pokazano wcześniej. Dodać 160 mikrolitrów minimalnej pożywki ura minus, zawierającej 2% glukozy do każdej studzienki i wirować płytki z prędkością 1000 obr./min przez jedną minutę. Inkubować płytki bez wstrząsania w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Po 48 godzinach na dnie każdej studzienki powinna być widoczna osadka przekształconych drożdży. Za pomocą dozownika płynu dodaj 100 mikrolitrów pożywki ura minus glukozy do każdej studzienki nowego zestawu 96-dołkowych płytek. Wirować płytki zawierające przekształcone drożdże z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund.

Używając sterylnego plastikowego replikatora 96-pinowego, umieść szpilki w studzienkach zawierających przekształcone drożdże, a następnie zaszczepij je w odpowiednich dołkach nowych płytek wypełnionych pożywką. Inkubuj nowe płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po 24 godzinach na dnie każdej studzienki, która zawiera pomyślnie przekształcone drożdże, powinna być widoczna osadka drożdży.

Aby zachować te szczepy drożdży jako zapasy glicerolu, dodaj 50 mikrolitrów 50% glicerolu do każdej studzienki, wiruj płytki z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund, uszczelnij płytki folią aluminiową i zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby ożywić szczepy biblioteczne z zapasu glicerolu, wyjmij 96-dołkowe płytki z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, usuń folię aluminiową i pozwól drożdżom rozmrozić się w temperaturze pokojowej przez około 30 minut. Po rozmrożeniu drożdży użyj sterylnego plastikowego replikatora 96-pinowego, aby zaszczepić zapasy glicerolu do 160 mikrolitrów świeżej pożywki ura minus zawierającej 2% glukozy na 96-dołkowych płytkach i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Natychmiast po użyciu szczepów bibliotecznych zamknij płytki i włóż je do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W tym samym dniu, w którym szczepy biblioteczne są rozmrażane, zaszczepij szczep drożdży w 50 mililitrach YPD i rozwijaj się w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez noc. Następnego ranka wlej szczep drożdży do sterylnego jednorazowego zbiornika na odczynnik i podnieś 160 mikrolitrów szczepu zapytania do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce.

Za pomocą dozownika płynu dozuj 160 mikrolitrów na dołek pożywki YPD do 96-dołkowych płytek. Krótko zawiruj 96-dołkowe płytki zawierające szczep zapytania i płytki odkształcające biblioteki, a następnie użyj sterylnego 96-pinowego replikatora, aby przenieść szczepy biblioteczne na płytki YPD, które zostały zaszczepione szczepem zapytania. Inkubować płytki YPD w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Po 24 godzinach na dnie każdej studzienki będzie widoczna osadka drożdży. Wypełnij 96-dołkowe płytki minimalną ilością pożywki zawierającej 2% rafinozy odpowiadającej wybieralnym markerom na plazmidzie w szczepie zapytania, a także na plazmidzie z biblioteki. Użyj sterylnego 96-pinowego replikatora, aby przenieść drożdże z kultur kojarzeniowych YPD do pożywki selektywnej.

Inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Tylko komórki drożdży, które połączyły się i utworzyły komórki diploidalne, a zatem zawierają zarówno plazmid zapytania, jak i plazmid biblioteczny, będą mogły rosnąć w tym pożywce. Po 48 godzinach wzrostu w pożywce selektywnej zawierającej rafinozę należy zaobserwować, że na dnie studzienek zawierających komórki diploidalne widoczne jest osadki.

Wirować 96-dołkowe płytki z prędkością 1000 obr./min przez jedną minutę. Użyj zrobotyzowanej maszyny do spottingu, aby dostrzec drożdże na płytkach agarowych w czterokrotnym zwoju do ura-his-droupout na płytkach zawierających 2% galaktozy i 2% agaru oraz na płytkach ura-his-droupout zawierających 2% glukozy i 2% agaru. Po plamieniu pozostaw płytki agarowe do wyschnięcia, a następnie umieść je do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na cztery dni.

Co 24 godziny fotografuj płytki agarowe, aby zarejestrować wzrost drożdży. Toksyczność białka FUS związanego z ALS po raz pierwszy zbadano u drożdży diploidalnych. Jak wskazuje płytka agarowa zawierająca galaktozę, która indukuje FUS, toksyczność FUS jest spójna zarówno w drożdżach diplodowych, jak i haploidalnych.

Pięć genów wcześniej zidentyfikowanych jako supresory toksyczności FUS z metody opartej na transformacji przetestowano metodą kojarzenia. Tor pierwszy to kontrolny szczep drożdży przekształcony za pomocą dwóch pustych wektorów. Drugi tor to diploidalny szczep drożdży FUS z pustym wektorem, w którym ekspresja FUS jest bardzo toksyczna.

Pasy od trzeciego do siódmego wykazują diploidalne drożdże z ekspresją FUS, a także gen supresji. Wszystkie pięć genów ratuje toksyczność FUS w drożdżach diploidalnych, co wskazuje, że metoda krycia była skuteczna. Ta metoda oparta na kojarzeniu została następnie zastosowana do badania przesiewowego biblioteki nadekspresji 940 genów.

Pokazane jest zdjęcie jednej reprezentatywnej płyty. Jak wskazano na płytce galaktozy, gdzie dochodzi do ekspresji FUS i genów bibliotecznych, FUS był toksyczny dla komórki drożdży diplod. Gen biblioteczny, oznaczony zielonym kwadratem, uratował toksyczność FUS.

Podczas gdy gen biblioteczny, oznaczony czerwonym kwadratem, zwiększa toksyczność. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 120 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać o wcześniejszym sprawdzeniu, czy fenotyp używany do badań przesiewowych nie jest zależny od typu kojarzenia haploidalnego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować czynniki genetyczne w przypadku nadekspresji, które ratują toksyczność białek związanych z chorobą w drożdżach. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się chorobami neurodegeneracyjnymi do zbadania mechanizmów cytotoksyczności białek związanych z chorobą w modelu drożdży. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak test beta galaktozydazy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy ratunek jest specyficzny.