Name: Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę nadekspresji opartą na krzyżowaniu drożdży do badania toksyczności białek związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi. Technika umożliwia szybkie przesiewanie dużych bibliotek genowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni za wnikliwe dyskusje z członkami laboratorium Ju i laboratorium Zhong oraz za wsparcie finansowe ze strony Uniwersytetu Stanowego Wright.

UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przeznaczony do badania przesiewowego plazmidów bibliotecznych zawartych w dziesięciu 96-dołkowych płytkach, ale może być odpowiednio skalowany w górę lub w dół. Protokół należy powtórzyć, aby zakończyć cały przegląd biblioteki. Zazwyczaj badanie przesiewowe na 10 płytkach genów bibliotecznych za każdym razem może być wygodnie obsługiwane przez 1 osobę.
1. Przygotowanie do 96-dołkowej transformacji drożdży
UWAGA: Ten krok jest wykonywany zgodnie z wcześniejszym opisem7,10.
<ol>
	<li>Podwielokrotność 5 μl (około 50–100 ng) plazmidowego DNA z uporządkowanej biblioteki plazmidów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki okrągłodennej. 
	UWAGA: Przykładem takiej biblioteki może być biblioteka nadekspresji genów drożdży10.</li>
	<li>Zaszczepić 150 ml pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD) drożdży w kolbie o pojemności 500 ml z kolonią (o średnicy 2–3 mm) haploidalnego szczepu drożdży W303α. Inkubować je przez noc w temperaturze 30 °C, wytrząsając (200 obr./min).</li>
	<li>Następnego ranka zmierz OD600 w nocnej kulturze i rozcieńcz kulturę drożdży do OD600 = 0,1 cala (do) 2 l YPD. Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (200 obr./min) przez ~5 godzin, aż kultura osiągnie OD600 = 0,4–0,6.</li>
</ol>
2. Przemiana drożdży
<ol>
	<li>Zbierz kulturę drożdży, napełniając 8 sterylnych butelek wirówkowych o pojemności 250 ml i odwirowując je w temperaturze pokojowej przy 3 000 x g przez 10 minut. Odlej sklarowany sklarant, nie naruszając osadu. 
	UWAGA: Wszystkie etapy wirowania należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć drożdże sterylnie destylowanymH2O. W tym celu dodaj 100 ml sterylnegoH2Odo każdej butelki wirówki i zwiruj ją, aby ponownie zawiesić osad komórkowy. Połącz umyte komórki w 2 butelkach i odwiruj je przy 3 000 x g przez 5 minut. Odlej sklarowany osad.</li>
	<li>Umyj komórki w każdej butelce w 100 ml 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) i odwiruj je przy 3,000 x g przez 5 minut. Odlej supernatant.</li>
	<li>Podczas wirowania zagotować 5 ml DNA plemników łososia (10 mg/ml) w temperaturze 100 °C za pomocą podgrzewacza blokowego przez 3 minuty, a następnie schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Zawiesić osad komórek w 25 ml 0,1 M LiOAc/1XTE w każdej butelce, połączyć zawieszone komórki i przenieść je do kolby o pojemności 150 ml. Dodać 5 ml wstępnie schłodzonego DNA plemników łososia i inkubować w temperaturze 30 °C, wytrząsając (225 obr./min) przez 30 minut.</li>
	<li>Wlać mieszaninę komórek do sterylnego jednorazowego zbiornika na odczynniki i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 35 μl mieszaniny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki okrągłodennej zawierającej bibliotekę plazmidowego DNA. Wirować 96-dołkowe płytki za pomocą wirownika płytkowego przez 1 minutę przy 1,000 obr./min. Inkubować płytki przez 30 minut w temperaturze 30 °C bez wytrząsania. 
	UWAGA: Nie układaj płyt w stosy, aby ciepło mogło przepływać bardziej efektywnie. Odkryliśmy, że wirowanie 96-dołkowych płytek z prędkością 1,000 obr./min nie powoduje wylewania się cieczy ze studzienek, ale przed wykonaniem tego kroku należy przetestować bezpieczną prędkość wirowania.</li>
	<li>W kolbie przygotować 200 ml buforu transformacyjnego zawierającego końcowe stężenie 40% PEG3350, 10% DMSO i 0,1M LiOAc. Przygotować bufor transformacyjny bezpośrednio przed użyciem i dokładnie go wymieszać, wstrząsając.</li>
	<li>Wyjąć 96-dołkowe płytki z inkubatora o temperaturze 30 °C i mieszać je przez 30 s z prędkością 1 000 obr./min za pomocą wirownika płytkowego. Dodać 125 μl buforu transformacyjnego do każdego dołka, a następnie wirować płytki przez 1 minutę z prędkością 1 000 obr./min.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 30 minut, a następnie zaszokować drożdże termicznie, umieszczając płytki w inkubatorze o temperaturze 42 °C na 15 minut 
	UWAGA: Nie układaj talerzy w stosy.</li>
	<li>Wirować płytki przez 5 minut przy 3 000 x g. Usunąć bufor transformacyjny ze studzienek, odwracając płytki nad pojemnikiem na odpady i mocno zrzucając bufor z płyt. Szybko osusz odwrócone talerze na czystym ręczniku papierowym, aby usunąć płyn z wierzchu talerzy.</li>
	<li>Przepłukać komórki, dodając do płytek 200 μl minimalnej pożywki odpowiadającej wybieralnemu markerowi na plazmidzie w bibliotece. 
	UWAGA: Użyliśmy syntetycznego podłoża Ura.</li>
	<li>Odwirować płytki przez 5 minut przy 3 000 x g i usunąć supernatant nad pojemnikiem na odpady, jak w kroku 2.10.</li>
	<li>Dodać 160 μl minimalnej pożywki Ura zawierającej 2% glukozy. Wirować płytki przez 1 minutę przy 1 000 obr./min i inkubować je w temperaturze 30 °C przez 48 godzin bez wstrząsania. Po 48 godzinach należy zauważyć, że na dnie każdej studzienki widoczne są osady przekształconych drożdży.</li>
	<li>Używając dozownika płynu, dodać 100 μl pożywki Ura zawierającej glukozę do każdego dołka z nowego zestawu 96-dołkowych płytek.</li>
	<li>Wirować płytki zawierające przekształcone drożdże (od kroku 2.13) z prędkością 1000 obr./min przez 30 s. Używając sterylnego plastikowego replikatora 96-pinowego, umieścić szpilki w studzienkach zawierających przekształcone drożdże, a następnie zaszczepić je w odpowiednich dołkach nowych płytek wypełnionych pożywką. Inkubować nowe płytki w temperaturze 30 °C przez 24 h. 
	UWAGA: W przypadku pracy z 10 płytkami pożywkę można również dozować ręcznie za pomocą pipet wielokanałowych.</li>
	<li>Po 24 godzinach na dnie każdej studzienki powinna być widoczna osadka drożdży zawierająca pomyślnie przekształcone drożdże. Aby zachować te szczepy drożdży jako zapasy glicerolu, dodaj 50 μl 50% glicerolu do każdej studzienki, wiruj płytki przez 30 s przy 1,000 obr./min, uszczelnij płytki taśmą uszczelniającą i zamroź je w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Powyższe kroki należy wykonać tylko raz. Przyszłe badania przesiewowe różnych modeli drożdży w tym samym zbiorniku jednorazowego odczynnika w bibliotece mogą rozpocząć się od zapasów glicerolu i przejść natychmiast od poniższych kroków.</li>
</ol>
3. Kojarzenie między komórkami zawierającymi geny biblioteczne i drożdże zapytania
<ol>
	<li>Aby ożywić szczepy biblioteczne z zapasu glicerolu, wyjmij 96-dołkowe płytki z zamrażarki o temperaturze -80 °C, usuń taśmę uszczelniającą i pozwól drożdżom rozmrozić się w temperaturze pokojowej przez około 30 minut.</li>
	<li>Po rozmrożeniu drożdży należy użyć sterylnego plastikowego 96-pinowego replikatora, aby zaszczepić zapasy glicerolu do 160 μl świeżej pożywki Ura zawierającej 2% glukozy na 96-dołkowych płytkach i inkubować je w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Natychmiast po użyciu szczepów bibliotecznych należy uszczelnić płytki taśmą uszczelniającą i umieścić je z powrotem w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Tego samego dnia szczepy biblioteczne (W303α) są rozmrażane, zaszczepia się szczep drożdży zapytania (tutaj FUS w W303a) do 50 ml YPD i hoduje go przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
	<li>Następnego ranka wlej szczep drożdży do sterylnego jednorazowego zbiornika na odczynnik i podwielokrotnie 160 μl szczepu zapytania do każdego dołka na 96-dołkowej płytce za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Za pomocą dozownika płynu dozować 160 μl pożywki YPD do każdego dołka z dziesięcioma 96-dołkowymi płytkami. Użyj tych płytek później do kojarzenia szczepu drożdży zapytania z drożdżami z biblioteki.</li>
	<li>Krótko zawiruj 96-dołkową płytkę zawierającą szczep zapytania, a następnie użyj sterylnego 96-pinowego replikatora, aby przenieść szczep zapytania na płytki YPD.</li>
	<li>Krótko przekręć płytki szczepu bibliotecznego i dla każdej płytki szczepu bibliotecznego użyj nowego sterylnego 96-pinowego replikatora, aby przenieść szczepy biblioteczne na płytki YPD, które zostały zaszczepione szczepem zapytania. 
	UWAGA: Komórki w glicerolu tracą żywotność po wielu cyklach rozmrażania i zamrażania. Powrót szczepów bibliotecznych do długoterminowego przechowywania (zamrażarka w temperaturze -80 °C) tak szybko, jak to możliwe, pozwoli utrzymać bibliotekę w dobrej jakości i będzie gotowa do wykorzystania w przyszłości. Prawidłowo konserwowany wywar glicerolowy można zamrażać i rozmrażać co najmniej 10 razy. Zdecydowanie zalecamy również zachowanie kopii roboczej i kopii zapasowych zapasu glicerolu. Jeśli zapas roboczy nie działa, natychmiast utwórz nową kopię roboczą z kopii zapasowej.</li>
	<li>Inkubować płytki YPD w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Należy zauważyć, że po 24 godzinach na dnie każdej studzienki będzie widoczna osadka drożdży.</li>
	<li>Wypełnij 96-dołkowe płytki minimalną pożywką zawierającą 2% rafinozy, odpowiadającą wybieralnym markerom na plazmidzie w szczepie zapytania, a także na plazmidzie z biblioteki (np. tutaj Ura-His-).</li>
	<li>Użyj sterylnego 96-pinowego replikatora, aby przenieść drożdże z kultur kojarzeniowych YPD do pożywki selektywnej. Inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 30 °C przez 48 godzin; Tylko komórki drożdży, które połączyły się i utworzyły komórki diploidalne, a zatem zawierają zarówno plazmid zapytania, jak i plazmid biblioteczny, będą mogły rosnąć w tym podłożu. Po 2 dniach obserwuj, czy na dnie studzienek widoczna jest osadka.</li>
</ol>
4. Test wykrywania
<ol>
	<li>Po 48 godzinach wzrostu w pożywkach selektywnych zawierających rafinozę, drożdże należy umieścić na płytkach agarowych.
	<ol>
		<li>Przygotuj 2 zestawy płytek Ura-His- zawierających 2% agaru za pomocą przezroczystych płytek polistyrenowych, jedna zawierająca 2% galaktozy, a druga zawierająca 2% glukozy.</li>
		<li>Wirować 96-dołkowe płytki przez 1 minutę przy 1,000 obr./min, a następnie nakrawać drożdże na płytki Ura-His- dropout zawierające 2% galaktozy i 2% agaru (indukowane są FUS i geny biblioteczne) oraz na płytki Ura-His-dropout zawierające 2% glukozy i 2% agaru (FUS i geny biblioteczne stłumione) za pomocą robotycznej maszyny do plamienia, za pomocą której kultura w każdym dołku jest nakrapiana na płytki agarowe w poczwórnym odstępie (tj. Kultura w 1 studzience jest nakrapiana na 4 miejsca na płytce agarowej).</li>
		<li>Po plamieniu pozostaw płytki agarowe do wyschnięcia, a następnie umieść je do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 30 °C. Fotografować płytki agarowe co 24 godziny, aby zarejestrować szybszy/większy wzrost drożdży, w którym toksyczność dla szczepu zapytania jest ratowana, lub aby zarejestrować wolniejszy/mniejszy wzrost, w którym toksyczność dla szczepu zapytania jest zaostrzona. Inkubować płytki przez 4 dni. 
		UWAGA: Kulturę w każdym studzience można dostrzec na płytkach agarowych 1 do 1, jak pokazano w poprzedniej metodzie opartej na transformacji10. Jednak wykrywanie od 1 do 4 w tym przypadku (które można wygodnie skonfigurować za pomocą zrobotyzowanej maszyny do wykrywania) znacznie zwiększa niezawodność testu, zmniejszając liczbę wyników fałszywie dodatnich. Pozytywne trafienia są brane pod uwagę tylko wtedy, gdy wszystkie 4 kolonie z tej samej studni wykazują podobny fenotyp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
<li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14657499">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+links+between+Abeta+toxicity%2C+endocytic+trafficking%2C+and+Alzheimer%27s+disease+risk+factors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052(2011).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).</li>
<li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li>
<li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies%3A+the+first+15+years+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li>
<li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania badania przesiewowego nadekspresji plazmidu u drożdży za pomocą krycia w celu wprowadzenia biblioteki plazmidów do modelu drożdży. Stosując to podejście, wiele drożdżowych modeli toksyczności białek choroby neurodegeneracyjnej może być przesiewanych przy użyciu tej samej kolekcji drożdży przekształconych za pomocą biblioteki plazmidów. Pracochłonny proces transformacji wystarczy przeprowadzić tylko raz, po czym stosuje się wysoce wydajne kojarzenie drożdży w celu wprowadzenia ...

Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae były szeroko stosowane w podstawowych badaniach naukowych1 do zrozumienia procesów komórkowych bezpośrednio związanych z chorobami ludzkimi. Co więcej, został wykorzystany jako organizm modelowy do badania białek związanych z chorobami ludzkimi, takich jak te związane z najczęstszymi chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Alzheimera, chorobą Parkinsona, chorobą Huntingtona i stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS)2. Zaletą modelu drożdży jest łatwość, z jaką można przeprowadzić badanie przesiewowe całego genomu w celu zidentyfikowania szlaków komórkowych związanych z toksycznością białek związanych z chorobą, dając w ten sposób wgląd w mechanizm ich toksyczności. Jedno z takich badań przesiewowych nazywa się przesiewaniem biblioteki nadekspresji, w którym każdy z 5500 genów drożdży w bibliotece tablicowej jest przekształcany w model drożdży w celu określenia, które geny mogą modyfikować toksyczność w przypadku nadekspresji. Ta metoda przesiewowa została z powodzeniem zastosowana w modelach drożdży wielu białek związanych z chorobą neurodegeneracyjną, w tym huntingtyny w chorobie Huntingtona3, α-synukleina w chorobie Parkinsona4,5, Aβ dla choroby Alzheimera6, oraz FUS i TDP-43 dla ALS7,8,9. Podczas gdy zazwyczaj odbywa się to w sposób wysokoprzepustowy10, najbardziej pracochłonnym etapem badania przesiewowego jest indywidualne przekształcenie 5 500 genów drożdży z biblioteki tablicowej. Ten etap musi być wykonywany za każdym razem, gdy badanie przesiewowe jest powtarzane i za każdym razem, gdy konieczne jest zbadanie nowo ustalonego modelu drożdży. Ważne jest, aby znaleźć bardziej efektywny sposób wykonania tego zadania.
Komórki drożdży mogą stabilnie istnieć zarówno w formie haploidalnej, jak i diploidalnej. Istnieją dwa przeciwstawne typy kojarzenia komórek haploidalnych, typ kojarzenia a i α. Komórki haploidalne każdego typu kojarzenia wytwarzają i wydzielają swój własny specyficzny feromon godowy, na który reagują tylko komórki przeciwnego typu kojarzenia. Pozwala to na kojarzenie między komórkami A i α w celu wytworzenia stabilnych komórek diploidalnych, a / α. Ten proces jest spontaniczny i bardzo wydajny11. Możemy wykorzystać ten unikalny cykl życiowy S. cerevisiae, aby wprowadzić bibliotekę plazmidów. Mówiąc dokładniej, każdy gen w uporządkowanej bibliotece plazmidowej zostanie przekształcony w komórki haploidalne jednego typu kojarzenia, tj. α komórkę. Te komórki zawierające geny biblioteczne będą następnie przechowywane w zapasie glicerolu w 96-dołkowym formacie. Dla każdego modelu drożdży, który musi zostać poddany badaniom przesiewowym, komórki drożdży zawierające geny biblioteczne można rozmrozić z zapasu glicerolu, a badanie przesiewowe można przeprowadzić poprzez kojarzenie z modelem drożdży będącym przedmiotem zainteresowania w odwrotnym typie krycia, tj. Krycie typu A. Pomysł wykorzystania krycia do połączenia dwóch genów w drożdżach nie jest nowy. Został on z powodzeniem zastosowany w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych dwóch hybryd drożdży, w których konstrukt przynęty (tj. fuzje domen wiążących Gal4-DNA) w jednym typie krycia jest łączony poprzez krzyżowanie z konstruktem ofiary z biblioteki tablicowej12. Jednak strategia ta nigdy nie została zastosowana w badaniach przesiewowych w bibliotece nadekspresji, które zawsze wykorzystywały tradycyjne metody transformacji.
Nasze laboratorium wcześniej stworzyło model drożdżowy białka FUS7. Poprzez badania przesiewowe biblioteki nadekspresji przy użyciu metody transformacji odkryliśmy pięć genów drożdży (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1 i VHR1), które ratują toksyczność FUS w przypadku nadekspresji. Wyniki te zostały niezależnie potwierdzone w podobnym badaniu przeprowadzonym przez inną grupę8. Później wykazano, że hUPF1, ludzki homolog ECM32, hamuje toksyczność w pierwotnych komórkach nerwowych13 oraz w zwierzęcym modelu ALS14. Używając tych pięciu genów jako dowodu zasady, wykazaliśmy, że wszystkie pięć genów w podobny sposób ratuje toksyczność FUS, gdy są wprowadzane do modelu drożdży FUS przez krzyżowanie. Ponieważ komórki drożdży zawierające geny biblioteczne mogą być przechowywane na stałe w zapasie glicerolu i ożywiane w razie potrzeby, ta metoda oparta na kojarzeniu usunie czasochłonny etap transformacji za każdym razem, gdy biblioteka musi być badana. Ponieważ kojarzenie jest bardzo wydajne bez transformacji plazmidu, strategia ta znacznie zmniejsza również koszty związane z oczyszczaniem i transformacją dużej biblioteki plazmidów. Z powodzeniem zastosujemy tę metodę do bibliotecznego badania przesiewowego przeciwko drożdżowemu modelowi FUS.
Procedura badania przesiewowego opartego na kojarzeniu jest krótko opisana na rysunku 1. Początkowo uporządkowana biblioteka plazmidów jest przekształcana w haploidalny szczep drożdży typu kojarzenia α przy użyciu protokołu transformacji drożdży o wysokiej przepustowości, w którym każda studzienka 96-dołkowej płytki zawiera drożdże przekształcone za pomocą określonego plazmidu bibliotecznego. Ta kolekcja przekształconych drożdży jest zapisywana jako zapas glicerolu, który można rozmrozić i ożywić do późniejszego wykorzystania. Interesujący nas model drożdży, w tym przypadku toksyczność FUS, musi zostać wygenerowany w haploidalnym szczepie drożdży o przeciwstawnym typie krycia (typ krycia a). W sposób wysokoprzepustowy przy użyciu sterylnych 96-pinowych replikatorów, szczep FUS i szczepy drożdży zawierające bibliotekę plazmidów są przenoszone na 96-dołkowe płytki zawierające bogate pożywki i pozostawiane do łączenia. Po kryciu niewielka objętość z każdego dołka kultury kojarzeniowej jest przenoszona na 96-dołkowe płytki zawierające syntetyczne pożywki, w których mogą rosnąć tylko diploidalne drożdże zawierające zarówno geny FUS, jak i geny biblioteczne. Zrobotyzowana maszyna do plamienia jest następnie używana do przenoszenia kultury drożdży z każdej studzienki na płytki agarowe, gdzie indukowana jest ekspresja FUS i genów bibliotecznych. Dodatkowo nakrapiana jest kultura drożdży w celu kontrolowania płytek agarowych, na których FUS i geny biblioteczne nie ulegają ekspresji. Po wzroście na płytkach agarowych zostaną zidentyfikowane geny, które ratują lub nasilają toksyczność FUS.

<table><tbody><tr><td>DNA plemników łososia (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD bulion</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulowany agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>Produkty badawcze d-(+)-rafinozy</td><td> Międzynarodowy (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczny Ura- pożywka do odpadania</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Suplement aminokwasowy z drożdży -Histydyna/-Uracyl</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów i siarczanu amonu</td><td>Produkty Badawcze Międzynarodowe (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Sulftlenek dimetylu (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu, bezwodny</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96-pinowy replikator&nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 płytka do badań dołkowych, okrągłe dno z pokrywką</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>bez obróbki, sterylna</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Pipeta wielokanałowa Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>objętości 30-300ul</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Cyfrowe suche wanny/grzejniki blokowe Isotemp</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Wirówka</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Dozownik wielomodowy</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&nbsp; &nbsp;</td><td>Instrumenty</td><td></td><td></td> śpiewacze</tr></tbody></table>

badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Pączkujące drożdże były szeroko stosowane jako model do badania białek związanych z chorobami ludzkimi. Genetyczne badania przesiewowe całego genomu są potężnym narzędziem powszechnie stosowanym w badaniach drożdży. Ekspresja wielu białek związanych z chorobą neurodegeneracyjną w drożdżach powoduje cytotoksyczność i tworzenie agregatów, podsumowując wyniki obserwowane u pacjentów z tymi zaburzeniami. W tym miejscu opisujemy metodę badania przesiewowego drożdżowego modelu białka FUS związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym pod kątem modyfikatorów jego toksyczności. Zamiast wykorzystywać transformację, ta nowa platforma przesiewowa opiera się na kojarzeniu drożdży w celu wprowadzenia uporządkowanej biblioteki plazmidów do modelu drożdży. Metoda krycia ma dwie wyraźne zalety: po pierwsze, jest bardzo wydajna; Po drugie, wstępnie przekształcona biblioteka plazmidów może być przechowywana przez długi czas jako zapas glicerolu i szybko stosowana do innych badań przesiewowych bez pracochłonnego etapu przekształcania się w model drożdży za każdym razem. Pokazujemy, w jaki sposób ta metoda może być z powodzeniem stosowana do badań przesiewowych w kierunku genów, które modyfikują toksyczność FUS.

Białko FUS związane z ALS, będące białkiem wiążącym RNA/DNA, było wcześniej badane w haploidalnych drożdżach7,8. Przesiewanie genetyczne z wykorzystaniem metody opartej na transformacji pozwoliło odkryć kilka genów drożdżowych, które tłumią toksyczność FUS. Później wykazano, że ludzki homolog jednego z genów drożdżowych skutecznie tłumi toksyczność w pierwotnych komórkach neuronalnych oraz w szczurzym modelu ALS1...

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak czynniki genetyczne i szlaki regulujące toksyczność białek związanych z chorobą. Główną zaletą tej techniki jest to, że wysoce wydajny proces kojarzenia drożdży jest wykorzystywany do badań przesiewowych modeli drożdży pod kątem dużego zbioru genów bibliotecznych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat toksyczności białek chorób neurodegeneracyjnych, może być również zastosowana do badania innych procesów komórkowych u drożdży, takich jak tolerancja na inne warunki stresowe.Rozpocznij tę procedurę od porcjowania pięciu mikrolitrów na studzienkę plazmidowego DNA z uporządkowanej biblioteki plazmidów na okrągłe płytki 96-dołkowe. Utrzymuj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zaszczepić 150 mililitrów dekstrozy peptonu drożdżowego lub pożywki YPD w kolbie o pojemności 500 mililitrów kolonią haploidalnego szczepu drożdży W303 Alpha.Inkubuj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min przez noc. Następnego ranka, po zmierzeniu OD600 w nocnej hodowli, rozcieńczyć kulturę do OD600 0,1 w dwóch litrach YPD. Inkubować w t

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Poznaj metodę nadekspresji opartą na krzyżowaniu drożdży do badania toksyczności białek związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi. Technika umożliwia szybkie przesiewanie dużych bibliotek genowych.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Przeglądaj więcej filmów