Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów
August 7th, 2018
Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób przenoszonych przez komary, takie jak to, czy dany gatunek komara jest konkurencyjnym wektorem dla danego wirusa. Główną zaletą tej metody jest to, że duża ilość komarów może być analizowana jednocześnie, bez użycia zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona umiejętności motorycznych, które można nabyć tylko poprzez praktykę.
Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ kluczowe kroki są trudne do nauczenia; Wymagają doświadczenia w radzeniu sobie z komarami i wirusami, a także umiejętności motorycznych. Na początek rozcieńczyć zapas wirusa. Następnie wymieszaj przeterminowaną ludzką krew z fruktozą, przefiltrowaną surowicą bydlęcą i zapasem wirusa.
Zamrozić 140 mikrolitrów mieszanki mączki z krwi do dalszej analizy za pomocą TCID50. Następnie umieść dwie 50-mikrolitrowe kropelki mieszanki mączki z krwi w plastikowej fiolce i pozwól komarom żerować przez dwie godziny. Po znieczuleniu komarów policz w pełni nabrzmiałe osobniki i przenieś je do nowej fiolki zawierającej wacik nasączony fruktozą.
Następnie utrzymuj komary w temperaturze 27 stopni Celsjusza i wilgotności 80% przez 14 lub 21 dni. Uzupełniaj waciki nasączone fruktozą co 72 godziny 1,5 mililitra fruktozy. Najpierw wysiewaj 20 000 komórek Vero na studzienkę na 96-dołkowej płytce z uzupełnioną pożywką wzrostową.
Aby przygotować urządzenie do wydzielania śliny, połóż kwadratową szklaną płytkę na ławce pod kątem 30 stopni. Następnie przyklej taśmę dwustronną do górnej części szklanej płyty. Następnie rozwałkuj modelinę, aż osiągnie średnicę 0,5 centymetra i przymocuj ją do płyty poziomo w odległości jednego centymetra od taśmy dwustronnej.
Odetnij końcówki wymaganej liczby 10-mikrolitrowych końcówek filtra i napełnij każdą końcówkę 10 mikrolitrami PBS. Następnie umieść końcówki na plastelinie i zabezpiecz je delikatnym naciskiem. Następnie unieruchamiaj komary, usuwając im nogi i skrzydła.
Przymocuj komary do taśmy nad końcówkami filtra. Delikatnie umieść trąbkę każdego komara w końcówce filtra. Po 30 minutach zdejmij końcówki filtra i wyrzuć glinę i taśmę.
Przenieś zebraną ślinę do probówek reakcyjnych zawierających 10 mikrolitrów PBS. Delikatnie wymieszaj ślinę i PBS i przenieś mieszaninę do dołków 96-dołkowej płytki. Inkubuj płytkę przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź komórki pod kątem obecności efektu cytopatycznego. Gdy studzienka jest pozytywna pod względem efektu cytopatycznego, użyj pipety, aby zebrać 140 mikrolitrów supernatantu. Następnie przenieść supernatant do probówki reakcyjnej.
Następnie wymieszać 140 mikrolitrów supernatantu z 560 mikrolitrami buforu AVL i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec dodaj 560 mikrolitrów etanolu i odwróć próbkę do wymieszania. Korzystając z tego protokołu, kilka gatunków komarów zostało przetestowanych pod kątem infekcji wirusem Zika i przenoszenia w różnych warunkach klimatycznych.
W warunkach inkubacji w temperaturze 27 stopni Celsjusza wszystkie gatunki Aedes wykazywały ślinę dodatnią na obecność wirusa Zika. I odwrotnie, żadna z próbek śliny z taksonów Culex nie zawierała dowodów na obecność wirusa. Po opanowaniu tę technikę można wykonać na 50 komarach w ciągu jednej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty z wymuszonym wydzielaniem śliny. Nie zapominaj, że praca z zakażonymi komarami może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania każdego eksperymentu należy zawsze podejmować specjalne środki bezpieczeństwa dotyczące obchodzenia się z komarami w warunkach BSA-3.
Przegląd
Ten artykuł omawia metodę analizy kompetencji wektorowej komarów, szczególnie Aedes albopictus i różne taksony Culex, w przenoszeniu wirusa Zika. Technika wymuszonego ślinowania pozwala na jednoczesną analizę wielu komarów bez użycia zwierząt laboratoryjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia wektorów
- Wirologia
- Choroby przenoszone przez komary
Tło
- Zrozumienie kompetencji wektorowej jest kluczowe dla kontroli wirusów przenoszonych przez komary.
- Wymuszone ślinowanie jest nowatorską metodą oceny potencjału przenoszenia przez komary.
- Poprzednie metody często wymagały zwierząt laboratoryjnych, które ta technika ma na celu wyeliminować.
- Dobre umiejętności motoryczne są niezbędne do tej metody, co wymaga praktyki i doświadczenia.
Cel badania
- Ocenić kompetencję wektorową różnych gatunków komarów w przenoszeniu wirusa Zika.
- Przedstawić metodę, która pozwala na wysokowydajną analizę śliny komarów.
- Dostarczyć wizualnego przewodnika dla badaczy nowych w tej technice.
Stosowane metody
- Przygotowanie mieszanki krwi do karmienia komarów.
- Technika wymuszonego ślinowania do pobierania śliny od komarów.
- Metody kultury komórkowej do oceny obecności wirusa Zika.
- Inkubacja i analiza próbek pod kątem efektów cytopatycznych.
Główne wyniki
- Gatunek Aedes wykazał pozytywne ślinowanie na wirusa Zika w kontrolowanych warunkach.
- Taksony Culex nie wykazywały obecności wirusa Zika w ich ślinie.
- Metoda pozwala na badanie do 50 komarów w jednej godzinie po opanowaniu techniki.
- Demonstracje wizualne znacznie ułatwiają naukę techniki.
Wnioski
- Wymuszone ślinowanie jest skuteczną metodą badania przenoszenia wirusów przez komary.
- Trening i praktyka są niezbędne do pomyślnej implementacji techniki.
- Środki bezpieczeństwa należy przestrzegać podczas postępowania z zakażonymi komarami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
