Name: Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Poznaj metodę wymuszonego wydzielania śliny do analizy kompetencji wektorowych komarów Aedes albopictus i Culex w transmisji wirusa Zika. Technika umożliwia testowanie do 50 osobników na godzinę bez użycia zwierząt laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Elli Weinert, Michelle Helms i Marlis Badusche za doskonałą pomoc techniczną, Jessice Börstler za analizy komarów Culex, Norbertowi Beckerowi i Björnowi Pluskota za dostarczenie jaj Aedes albopictus oraz Olli Vapalahti za dostarczenie zapasu wirusa. ML był wspierany przez Stowarzyszenie Leibniza; grant nr SAW-2014-SGN-3.

1. Przygotuj samice komarów
<ol>
	<li>Zbieraj komary z dużej klatki za pomocą aspiratora (około 400 komarów na dużą klatkę).</li>
	<li>Znieczulać komary dwutlenkiem węgla (CO2 ) przez 7 s.</li>
	<li>Sortować 20 samic w plastikowej fiolce (Ø 50 mm × 100 mm). 
	Uwaga: Jeśli komary się obudzą, użyj kolejnych 3 s CO2 .</li>
	<li>Zagłodzić komary przez noc.</li>
</ol>
2. Sztuczny posiłek z krwi
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w warunkach BSL-3.
<ol>
	<li>Przygotuj zakaźny posiłek z krwi.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć materiał wirusa do stężenia 1 x 108 jednostek tworzących płytkę miażdżycową (PFU)/ml. 
		Uwaga: Stężenie zapasu zostało określone metodą dawki 50 infekcji kulturą tkankową (TCID50) i obliczone za pomocą algorytmu Spearman & Kärber10,11.</li>
		<li>Zmieszaj przeterminowaną krew ludzką (zachowanie krwi) z banku krwi (nie nadaje się już dla ludzi, ale jest przydatna dla komarów) z fruktozą (8% roztwór), przefiltrowaną surowicą bydlęcą (FBS) i roztworem roboczym zapasu wirusa (przeterminowana krew ludzka: fruktoza: FBS: roztwór roboczy = 5:3:1:1). 
		Uwaga: Wybraliśmy ludzką krew, ponieważ jest to znany naturalny ssak żywiciel ZIKV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrozić 140 μl mieszanki mączek z krwi do dalszej analizy za pomocą TCID50.</li>
	<li>Wykonaj sztuczne karmienie przy użyciu różnych metod karmienia, w zależności od gatunku:
	<ol>
		<li>Aedes aegypti: Używaj systemu karmienia membranowego przez 30 minut (1 ml na karmnik).</li>
		<li>Culex spp.: Krew zakaźną należy podawać przez noc za pomocą wacika i nie podgrzewać krwi (300 μl na fiolkę).</li>
		<li>Aedes albopictus: Umieść dwie kropelki (po 50 μl każda) mieszanki mączki z krwi do plastikowej fiolki i pozwól komarom żerować przez 2 godziny. Nie rozgrzewaj krwi. 
		Uwaga: Komary będą żerować w ciągu pierwszych 15 minut. Wydłużony czas inkubacji jest konieczny ze względów bezpieczeństwa. Kropelki krwi są odprowadzane po 2 godzinach, dzięki czemu zmniejsza się ryzyko zanieczyszczenia podczas sortowania karmionych komarów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulić komary CO2 przez 7 s. 
	UWAGA: Jeśli komary się obudzą, użyj kolejnych 3 s CO2 .</li>
	<li>Posortuj i policz w pełni nabrzmiałe komary do nowej fiolki.</li>
	<li>Dodać wacik nasączony fruktozą (8% roztwór) między fiolkę a zatyczkę.</li>
	<li>Utrzymuj komary w wyznaczonej temperaturze 18 °C lub 27 °C przy wilgotności 80% przez 14 lub 21 dni.</li>
	<li>Nakarm komary wacikami nasączonymi fruktozą. Uzupełniać co 72 godziny 1,5 ml fruktozy (8% roztwór) na fiolkę (do 20 komarów, w zależności od dawki karmienia, patrz krok 2.5).</li>
</ol>
3. Test wymuszonego wydzielania śliny w dniu 14 lub 21
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w warunkach BSL-3.
<ol>
	<li>Wysiew 2 x 104 komórek Vero / na studzienkę w 96-dołkowej płytce z 200 μl pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM) uzupełniona 3% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 mg / ml streptomycyny, 5 μg / ml amfoterycyny B, 2 mM L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% pirogronianu sodu).</li>
	<li>Przygotuj urządzenie do ślinienia:
	<ol>
		<li>Umieść kwadratową szklaną płytkę (20 × 20 cm) na ławce pod kątem 30°. 
		Uwaga: Jest to konieczne ze względu na zbyt niskie ciśnienie w laboratorium bezpieczeństwa. Jeśli płyta jest pozioma lub pionowa, płyn będzie wyciekał.</li>
		<li>Umieść dwustronną taśmę klejącą na szklanej płycie.</li>
		<li>Ułóż plastelinę, aż osiągnie średnicę 0,5 cm i przymocuj ją poziomo w odległości 1 cm od dwustronnej taśmy klejącej.</li>
		<li>Odetnij pierwsze 0,3 cm końcówki końcówki filtra o pojemności 10 μl. 
		UWAGA: Zaleca się przygotowanie go przed rozpoczęciem eksperymentu poza laboratorium bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Napełnij końcówki filtra 10 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Umieść końcówki filtra na plastelinie końcówką w kierunku taśmy klejącej.</li>
		<li>Zabezpiecz końcówki filtra delikatnym naciskiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komary:
	<ol>
		<li>Znieczulić komary CO2 .</li>
		<li>Usuń nogi i skrzydła, aby unieruchomić komary.</li>
		<li>Przymocuj żywe ciała komarów do taśmy klejącej nad końcówką filtra.</li>
		<li>Delikatnie umieść sondę w końcówce filtra.</li>
		<li>Uruchom test wydzielania śliny przez 30 minut.</li>
		<li>Zdejmij końcówki filtra i wyrzuć glinę i taśmę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie śliny
UWAGA: Kroki 4.1–4.6.2 są wykonywane w warunkach BSL-3.
<ol>
	<li>Usunąć zawartość do probówek reakcyjnych zawierających 10 μl PBS.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i przenieść zawartość do dołków przygotowanej płytki 96-dołkowej, używając jednego dołka na próbkę.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 7 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Użyj lornetki, aby sprawdzić komórki pod kątem obecności efektu cytopatycznego (CPE).</li>
	<li>Jeśli studzienka jest dodatnia na obecność CPE, zebrać supernatant przez pipetowanie 140 μl do probówki reakcyjnej w celu ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Oczyść RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.
	<ol>
		<li>Zmieszać 140 μl supernatantu z 560 μl buforu AVL (bufor do lizy wirusów) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 560 μl etanolu (96%) i zagniecić próbkę. 
		UWAGA: Po tym etapie próbki są inaktywowane i można je wypisać z laboratorium BSL-3.</li>
		<li>Odpipetować 630 μl próbki na kolumnę i odwirować z 6 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Odrzucić filtrat, odpipetować pozostałe 630 μl na kolumnę i powtórzyć wirowanie.</li>
		<li>Przepłukać RNA, związany z membraną kolumny, dodając 500 μl buforu płuczącego 1 do kolumny i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej. Dodać 500 μl buforu myjącego 2 i wirować przy 12 500 x g przez 3 min.</li>
		<li>Wyrzucić probówkę zbiorczą i umieścić kolumnę w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 50 μl buforu elucyjnego i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przy 6 000 x g przez 1 minutę, a następnie wyrzucić kolumnę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizować próbki pod kątem RNA ZIKV za pomocą RT-qPCR.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie ciał komarów
UWAGA: Kroki 5.1–5.5 są wykonywane w warunkach BSL-3.
<ol>
	<li>Usuń ciała komara i umieść je w probówce reakcyjnej. 
	UWAGA: W tym momencie możliwe jest wstrzymanie eksperymentu i przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki homogenizacyjnej (DMEM bez żadnych dodatków) do probówki reakcyjnej.</li>
	<li>Homogenizować ciało za pomocą ręcznego miksera silnikowego i używać nowego słupka do każdej próbki.</li>
	<li>Dodać 200 μl homogenatu do płytki 96-dołkowej w celu oczyszczenia. 
	UWAGA: W tym momencie możliwe jest wstrzymanie eksperymentu i przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Inaktywować płytkę przez inkubację przez 60 minut w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Oczyść RNA przez automatyczne oczyszczanie kwasów nukleinowych. 
	UWAGA: W tym momencie możliwe jest wstrzymanie eksperymentu i przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Analiza
<ol>
	<li>Określ ilościowo kopie wirusowego RNA za pomocą RT-qPCR. 
	UWAGA: Kopie RNA zostały uśrednione dla wszystkich ciał komarów ZIKV-dodatnich i bez uwzględniania komarów ZIKV-ujemnych.</li>
	<li>Obliczyć IR, zdefiniowaną jako liczba ciał komarów z dodatnim wynikiem ZIKV na liczbę karmionych samic.</li>
	<li>Obliczyć TR, zdefiniowaną jako liczba komarów z dodatnim wynikiem śliny na liczbę ciał komarów dodatnich w skali ZIKV. Nie można było obliczyć szybkości transmisji dla kombinacji gatunków i temperatur bez ciał dodatnich w skali ZIKV.</li>
</ol>

<ol><li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li>
<li>World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region">http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region</a> (2016).</li>
<li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933(2017).</li>
<li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li>
<li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+selected+African+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29+species+for+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li>
<li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li>
<li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+salivation+and+virus+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li>
<li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li>
<li>Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Eurovsurveillance%22%5BJournal%5D)">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li>
<li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124653306500038">Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual</a>. , (1996).</li>
<li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0442.1985.tb01965.x">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480(2010).</li>
<li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li>
<li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites & Vectors. 8, 463(2015).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeger-Lucarelli%2C+J+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22">PLOS Neglected Tropical Diseases</a>. Turell, M. J. 10 (10), (2016).</li>
<li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes%3A+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniej wykazano, że wyniki uzyskane przy wymuszonym wydzielaniu śliny są zgodne z klasycznymi eksperymentami z ponownym karmieniem6. Jednak zarówno w eksperymentach z ponownym karmieniem, jak i w przedstawionej przez nas metodzie wymuszonego wydzielania śliny, niemożliwe jest bezpośrednie udowodnienie aktywności śliny lub monitorowanie uwalniania śliny. Aby udowodnić aktywność śliny, próbki można przetestować pod kątem innych składników obecnych w ślinie (np. białek, węglowodanów itp.). Co więcej, dodatkowe qPCR pozwoliłyby na wykrycie kopii wirusowego RNA. Wymaga to jednak rozszczepienia próbek śliny do różnych analiz, co może ograniczyć czułość w teście hodowli komórkowej w przypadku bardzo niskiej liczby cząstek. To z kolei może prowadzić do niedoszacowania wyznaczonych szybkości transmisji.
Aby uzyskać powtarzalne wyniki, konieczne jest upewnienie się, że wszystkie komary pozostaną przy życiu do końca eksperymentu. Jest to kontrolowane poprzez wizualne monitorowanie aktywności ruchów ciała komarów. Ponadto podstawowe zastosowanie testu śliny w odniesieniu do danego gatunku komarów musi zostać przetestowane poprzez karmienie wirusami kontrolnymi, o których wiadomo, że są przenoszone przez ten konkretny gatunek komarów. I na odwrót, każdy wirus wprowadzony do eksperymentu musi zostać przetestowany na podatnym komarze.
Testy wymuszonego wydzielania śliny mają wiele zalet. Duża liczba komarów może być badana jednocześnie na jednej podstawie próbki w kontrolowanych, znormalizowanych warunkach, bez naruszania przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt9.
Metoda jest stosowana przez kilka laboratoriów. Jednak dokładne konfiguracje mogą się różnić, co może prowadzić do różnic w wynikach między laboratoriami. Jednym z krytycznych elementów jest kapilara do zbierania śliny, która może być wykonana ze szkła14 lub plastiku15. Aby spełnić wysokie przepisy bezpieczeństwa dotyczące środków owadobójczych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3, zamiast szklanych kapilar użyliśmy plastikowych końcówek filtrujących, zmniejszając w ten sposób ryzyko obrażeń. Ponadto końcówki filtrujące mają tę zaletę, że zebraną ciecz można łatwo przenieść za pomocą pipety.
Przedstawiona tutaj konfiguracja testu wymuszonego wydzielania śliny opiera się na współpracy dwóch badaczy i podziale obowiązków. Demobilizacja komara jest wykonywana przez jedną osobę, podczas gdy druga jednocześnie przygotowuje zestaw do wymuszonego wydzielania śliny. To znacznie skraca czas obsługi i minimalizuje ryzyko zmiany próbki, ponieważ zmiana między miejscem pracy demobilizacji a płytką ślinową nie jest konieczna. Co więcej, umożliwia umieszczenie komarów na urządzeniu do wymuszonego ślinienia natychmiast po demobilizacji. Ten dość krótki czas radzenia sobie z komarami jest niezbędny do udanego wymuszonego wydzielania śliny. Wreszcie, komary mogą być bezpośrednio monitorowane pod kątem ruchliwości przez cały czas trwania eksperymentu.
Przedstawiony tutaj test wydzielania śliny służy do uzyskania wglądu w potencjał wektorowy gatunków komarów. Jednak, aby odpowiedzieć na kilka innych konkretnych pytań (np. liczba ukąszeń komarów, które są potrzebne do zakażenia kręgowców), nadal mogą być wymagane eksperymenty na zwierzętach.

W 2015 roku wirus Zika (ZIKV), wirus przenoszony przez komary (mobowirus) należący do rodziny Flaviviridae, pojawił się w Kolumbii i Brazylii i szybko rozprzestrzenił się po obu Amerykach i Karaibach, powodując epidemię z dużą liczbą powiązanych przypadków klinicznych mikrocefalii i zespołu Guillaina-Barrégo1. Komary z gatunku Aedes aegypti i Aedes albopictus są uważane za główne i wtórne wektory ZIKV2, ale inne gatunki z rodzaju Aedes również udowodniły, że mają eksperymentalną kompetencję wektorową3. W przeciwieństwie do gatunków Aedes, większość przebadanych do tej pory gatunków Culex nie jest w stanie przenosić wirusa4. Jedynie dane dotyczące Culex quinquefasciatus dostarczyły niejednoznacznych wyników3. Obecnie brakuje informacji na temat zdolności komarów do przenoszenia ZIKV w umiarkowanych warunkach temperaturowych (<20 °C). Informacje te są jednak istotne dla oceny ryzyka możliwego rozprzestrzeniania się wirusa w regionach o klimacie umiarkowanym, takich jak Europa Środkowa.
Kompetentny wektor dla ZIKV jest w stanie nabyć, utrzymać, amplifikować i w końcu przenieść wirusa. W związku z tym badanie ciał komarów lub części ciał, w tym nóg, jelita środkowego, głowy lub gruczołów ślinowych, na obecność ZIKV nie jest wystarczające do określenia kompetencji wektora. Obowiązkowe jest wykonanie testu na obecność zakaźnych cząstek wirusa w uwolnionej ślinie. Aby ocenić kompetencję wektora, należy określić zarówno wskaźnik infekcji (IR, liczba ciał komarów ZIKV-dodatnich na liczbę nabrzmiałych komarów), jak i współczynnik transmisji (TR, liczba komarów z dodatnim wynikiem ZIKV w ślinie na liczbę ciał komara dodatnich w stosunku do ZIKV). IR komarów można łatwo analizować, po prostu homogenizując komary, a następnie przeprowadzając reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR) ukierunkowaną na ZIKV. Co więcej, infekcję można dodatkowo scharakteryzować, określając liczbę kopii wirusa na komara. Natomiast analiza szybkości transmisji opiera się na wykrywaniu żywych cząsteczek wirusa w ślinie poszczególnych komarów. Można to osiągnąć poprzez karmienie zakażonych komarów podatnymi zwierzętami gospodarzami, a następnie analizę wiremii w host5. Metoda ta opiera się jednak na odpowiednich organizmach modelowych i jest kosztowna oraz ograniczona przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Aby uniknąć wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych do analizy szybkości transmisji i obniżyć koszty, opisano systemy sztucznego ponownego karmienia za pomocą kropelek krwi6. Jednak badania na indywidualną skalę w połączeniu z dużą liczbą osobników są trudne i czasochłonne. Pierwszy opis testu ślinienia w skali indywidualnej został opublikowany w 1966 roku7, a w ostatnich latach eksperymenty z wymuszonym wydzielaniem śliny stały się metodą z wyboru do oceny kompetencji komarów jako wektora3,8.
Na podstawie naszego badania kompetencji wektorowych komarów z Europy Środkowej, opublikowanego niedawno9, opisujemy wymuszone wydzielanie śliny, jak donoszą Anderson et al. 8 z pewnymi modyfikacjami. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustowe, standaryzowane eksperymenty w warunkach wysokiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3) i obejmuje identyfikację aktywnego wirusa za pomocą testów opartych na hodowlach komórkowych. Opisane tutaj eksperymenty obejmują 856 komarów. Zostali oni zakażeni ZIKV za pomocą sztucznej mączki z krwi, a następnie przeanalizowani pod kątem obecności zakaźnych cząstek wirusa w ślinie. Komary wprowadzone do eksperymentów obejmowały dwie od dawna znane populacje laboratoryjne Ae. aegypti i Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), a także poławiane w terenie Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) i dwie populacje Ae. albopictus. Z wyjątkiem jednej z dwóch populacji Ae. albopictus, która została zebrana we Włoszech, wszystkie komary zostały zebrane w Niemczech.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Klatka do hodowli owadów</td><td>Sklep</td><td></td><td></td>BugDorm</tr><tr><td>Rurki do uprawy Drosophila</td><td>Carl</td><td>Roth PK11.2</td><td>Plastikowa fiolka na komary</td></tr><tr><td>Zatyczka do rurek do hodowli Drosophila</td><td>Carl</td><td>Roth PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Komora klimatyczna do testów stabilności</td><td>Spoiwo</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Bankowanie krwi</td><td></td><td></td><td>krwi ludzkiej, przeterminowana, nienadająca się do użytku medycznego</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator światła flash</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr>dwustronna<td>taśma</td><td></td><td></td> klejąca <td>bez konkretnego dostawcy</td></tr><tr><td>Gammex Rękawice bezpudrowe z AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>ze względów bezpieczeństwa niezbędnych podczas pracy z ukłuciami w laboratorium BSL3</td></tr><tr><td>RealStar Wirus Zika RT-PCR-Kit</td><td>diagnostyka altona</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher 4462359 naukowe</td><td></td><td>izolacja RNA ciał komarów</td></tr><tr><td>Qiamp wirusowy RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Izolacja filtra supernatantu</td></tr><tr><td> Napiwki (20 i mikro; L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Wytnij pierwsze 3 mm końcówki</td></tr><tr><td>Ręczny mikser silnikowy</td><td>Carl Roth</td><td>Wyprzedane</td><td></td></tr><tr><td>Mikro tłuczki do ręcznego miksera silnikowego</td><td>Carl Roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamina Penicylina/Streptomycyna</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fruktoza</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr> P0832100 <tr><td>Podajnik</td><td>Hemotek PS6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Oprogramowanie</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modelina</td><td></td><td></td><td>brak konkretnego dostawcy</td></tr><tr><td>System oczyszczania King Fisher Flex</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aedes albopictus</td><td></td><td></td>jaja <td>zostały zebrane we Freiburgu, Niemcy</td></tr><tr><td>Lornetka</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Lampa lornetkowa</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Kompetencja wektorowa jest definiowana jako zdolność gatunku komara do przenoszenia wirusa przenoszonego przez komary (mobowirusa) na żywiciela kręgowców. Żywe cząsteczki wirusa są przenoszone podczas posiłku z krwi przez ślinę zakażonego komara. Testy wymuszonego wydzielania śliny pozwalają określić potencjał wektora na podstawie pojedynczych komarów, unikając stosowania eksperymentów na zwierzętach. Metoda jest odpowiednia do analizy dużej liczby komarów w jednym eksperymencie w krótkim czasie. Wymuszone testy wydzielania śliny wykorzystano do analizy 856 pojedynczych komarów uwięzionych w Niemczech, w tym dwóch różnych biotypów Culex pipiens pipiens, Culex torrentium oraz Aedes albopictus, które zostały eksperymentalnie zakażone wirusem Zika (ZIKV) i inkubowane w temperaturze 18 °C lub 27 °C przez dwa i trzy tygodnie. Wyniki wskazują na brak kompetencji wektorowych różnych taksonów Culex dla ZIKV. Natomiast Aedes albopictus był podatny na ZIKV, ale tylko w temperaturze 27 °C, z szybkością transmisji podobną do kolonii laboratoryjnej Aedes aegypti badanej równolegle.

Aedes aegypti jest znany jako kompetentny wektor ZIKV, przynajmniej w tropikalnych warunkach klimatycznych12. Dlatego wykorzystaliśmy Ae. aegypti jako kontrolę pozytywną do opracowania testu oraz do analizy IR i TR w temperaturze inkubacji 27 °C i wilgotności 80%. IR oraz TR zdefiniowano zgodnie z wcześniejszym opisem autorstwa Fortuny et al.13. Zainfekowane Ae. aegypti wykazały IR na poziomie 50% i 72% oraz TR na poziomie 42% i 31% odpowiednio w 14. i 21. dniu po infekcji (dpi) (Rycina 1A i 1B). Następnie przetestowano europejskie komary pod kątem infekcji i transmisji ZIKV w tropikalnych, jak i umiarkowanych warunkach klimatycznych.
Przy temperaturze inkubacji 27 °C we wszystkich gatunkach komarów stwierdzono zakażenie ZIKV w 14. oraz 21. dniu po infekcji (dpi), z wyjątkiem osobników Cx. p. pipiens oraz Cx. torrentium, które były dodatnie tylko w 14. dpi. Wszystkie gatunki Aedes wykazały wyższe wskaźniki zakaźności (IRs, od 50% do 72%) oraz wyższe stężenia RNA wirusa (od 106 do 109 kopii RNA/osobnik komara) w porównaniu do różnych taksonów Culex, w których IRs wynosiły od 0% do 32%, a miano wirusa od 103 do 104 kopii RNA/osobnik komara. Wszystkie gatunki Aedes wykazały obecność ZIKV w ślinie (TR 13–42%), podczas gdy w żadnej z próbek śliny pobranych od taksonów Culex nie stwierdzono ZIKV (Rycina 1A oraz 1B). Co ciekawe, wskaźniki transmisji w 21. dpi były podobne u Ae. aegypti i Ae. albopictus z Niemiec (30%), ale były znacznie niższe u Ae. albopictus z Włoch (13%).
Inkubacja zainfekowanych komarów w umiarkowanej temperaturze 18 °C wykazała ogólnie niższą wiremię u gatunków Aedes (104–106 kopii RNA/komara), jak i u różnych taksonów Culex (102–104 kopii RNA/komara). Jednakże, przy temperaturze inkubacji 18 °C nie zaobserwowano transmisji ZIKV u żadnego z badanych gatunków komarów.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający zależność temperatury od wskaźnika transmisji dla różnych gatunków komarów; porównanie danych przy 18°C i 27°C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wskaźniki transmisji u komarów eksperymentalnie zakażonych ZIKV. Wyniki badań kompetencji wektorowych ZIKV u różnych gatunków komarów. Sześć różnych taksonów komarów zakażono ZIKV i inkubowano w temperaturze 27 °C lub 18 °C przez 14 (A) lub 21 (B) dni. TR definiuje się jako liczbę komarów ze śliną dodatnią pod kątem ZIKV w stosunku do liczby ciał komarów dodatnich pod kątem ZIKV. Całkowita liczba badanych komarów wyniosła 856, przy minimum 30 osobnikach dla każdego punktu czasowego/temperatury/taksonu komarów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób przenoszonych przez komary, takie jak to, czy dany gatunek komara jest konkurencyjnym wektorem dla danego wirusa. Główną zaletą tej metody jest to, że duża ilość komarów może być analizowana jednocześnie, bez użycia zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona umiejętności motorycznych, które można nabyć tylko poprzez praktykę.Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ kluczowe kroki są trudne do nauczenia; Wymagają doświadczenia w radzeniu sobie z komarami i wirusami, a także umiejętności motorycznych. Na początek rozcieńczyć zapas wirusa. Następnie wymieszaj przeterminowaną ludzką krew z fruktozą, przefiltrowaną surowicą bydlęcą i zapasem wirusa.Zamrozić 140 mikrolitrów mieszanki mączki z krwi do dalszej analizy za pomocą TCID50. Następnie umieść dwie 50-mikrolitrowe kropelki mieszanki mączki z krwi w plastikowej fiolce i pozwól komarom żerować przez dwie godziny. Po znieczuleniu komarów policz w pełni nabrzmiałe osobniki i przenieś je do nowej fiolki zawierającej wacik nasączony fruktozą.Następnie utrzymuj komary w temperaturze 27 stopni Celsjusza i wilgotności 80% przez 14 lub 21 dni. Uzupełniaj waciki nasączone fruktozą co 72 godziny 1,5 mililitra fruktozy. Najpierw wysiewaj 20 000 komórek Vero na studzienkę na 96-dołkowej płytce z uzupełnioną pożywką wzrostową.Aby przygotować urządzenie do wydzielania śliny, połóż kwadratową szklaną płytkę na ławce pod kątem 30 stopni. Następnie przyklej taśmę dwustronną do górnej części szklanej płyty. Następnie rozwałkuj modelinę, aż osiągnie średnicę 0,5 centymetra i przymocuj ją do płyty poziomo w odległości jednego centymetra od taśmy dwustronnej.Odetnij końcówki wymaganej liczby 10-mikrolitrowych końcówek filtra i napełnij każdą końcówkę 10 mikrolitrami PBS. Następnie umieść końcówki na plastelinie i zabezpiecz je delikatnym naciskiem. Następnie unieruchamiaj komary, usuwając im nogi i skrzydła.Przymocuj komary do taśmy nad końcówkami filtra. Delikatnie umieść trąbkę każdego komara w końcówce filtra. Po 30 minutach zdejmij końcówki filtra i wyrzuć glinę i taśmę.Przenieś zebraną ślinę do probówek reakcyjnych zawierających 10 mikrolitrów PBS. Delikatnie wymieszaj ślinę i PBS i przenieś mieszaninę do dołków 96-dołkowej płytki. Inkubuj płytkę przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź komórki pod kątem obecności efektu cytopatycznego. Gdy studzienka jest pozytywna pod względem efektu cytopatycznego, użyj pipety, aby zebrać 140 mikrolitrów supernatantu. Następnie przenieść supernatant do probówki reakcyjnej.Następnie wymieszać 140 mikrolitrów supernatantu z 560 mikrolitrami buforu AVL i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec dodaj 560 mikrolitrów etanolu i odwróć próbkę do wymieszania. Korzystając z tego protokołu, kilka gatunków komarów zostało przetestowanych pod kątem infekcji wirusem Zika i przenoszenia w różnych warunkach klimatycznych.W warunkach inkubacji w temperaturze 27 stopni Celsjusza wszystkie gatunki Aedes wykazywały ślinę dodatnią na obecność wirusa Zika. I odwrotnie, żadna z próbek śliny z taksonów Culex nie zawierała dowodów na obecność wirusa. Po opanowaniu tę technikę można wykonać na 50 komarach w ciągu jednej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty z wymuszonym wydzielaniem śliny. Nie zapominaj, że praca z zakażonymi komarami może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania każdego eksperymentu należy zawsze podejmować specjalne środki bezpieczeństwa dotyczące obchodzenia się z komarami w warunkach BSA-3.

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Ten artykuł przedstawia protokół do badania wpływu poszczególnych bakterii jelitowych komarów, w tym izolację i identyfikację mikrobów hodowlanych w jelicie środkowym komarów, antybiotykowe zubożenie bakterii jelitowych komarów i ponowne wprowadzenie jednego konkretnego gatunku bakterii.

Bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami

Obecny protokół opisuje metodę zbierania wystarczającej ilości śliny od owadów wysysających za pomocą sztucznego podłoża. Jest to wygodna metoda zbierania śliny owadów i badania funkcji śliny pod kątem zachowań żywieniowych owadów i przenoszenia wirusa przenoszonego przez wektory.

Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus

Dorosły gruczoł ślinowy komara (SG) jest niezbędny do przenoszenia wszystkich patogenów przenoszonych przez komary na ich ludzkich gospodarzy, w tym wirusów i pasożytów. Film ten pokazuje skuteczną izolację SG od stadium larwalnego (L4) komarów Anopheles gambiae i przygotowanie SG L4 do dalszej analizy.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

Ten protokół pokazuje, jak używać gospodarza roślinnego do wykrywania białek ślinowych skoczka i wirusów roślinnych uwalnianych przez wektory skoczków.

Wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Poznaj metodę wymuszonego wydzielania śliny do analizy kompetencji wektorowych komarów Aedes albopictus i Culex w transmisji wirusa Zika. Technika umożliwia testowanie do 50 osobników na godzinę bez użycia zwierząt laboratoryjnych.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Przeglądaj więcej filmów