Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów
7 sierpnia 2018
Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób przenoszonych przez komary, takie jak to, czy dany gatunek komara jest konkurencyjnym wektorem dla danego wirusa. Główną zaletą tej metody jest to, że duża ilość komarów może być analizowana jednocześnie, bez użycia zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona umiejętności motorycznych, które można nabyć tylko poprzez praktykę.
Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ kluczowe kroki są trudne do nauczenia; Wymagają doświadczenia w radzeniu sobie z komarami i wirusami, a także umiejętności motorycznych. Na początek rozcieńczyć zapas wirusa. Następnie wymieszaj przeterminowaną ludzką krew z fruktozą, przefiltrowaną surowicą bydlęcą i zapasem wirusa.
Zamrozić 140 mikrolitrów mieszanki mączki z krwi do dalszej analizy za pomocą TCID50. Następnie umieść dwie 50-mikrolitrowe kropelki mieszanki mączki z krwi w plastikowej fiolce i pozwól komarom żerować przez dwie godziny. Po znieczuleniu komarów policz w pełni nabrzmiałe osobniki i przenieś je do nowej fiolki zawierającej wacik nasączony fruktozą.
Następnie utrzymuj komary w temperaturze 27 stopni Celsjusza i wilgotności 80% przez 14 lub 21 dni. Uzupełniaj waciki nasączone fruktozą co 72 godziny 1,5 mililitra fruktozy. Najpierw wysiewaj 20 000 komórek Vero na studzienkę na 96-dołkowej płytce z uzupełnioną pożywką wzrostową.
Aby przygotować urządzenie do wydzielania śliny, połóż kwadratową szklaną płytkę na ławce pod kątem 30 stopni. Następnie przyklej taśmę dwustronną do górnej części szklanej płyty. Następnie rozwałkuj modelinę, aż osiągnie średnicę 0,5 centymetra i przymocuj ją do płyty poziomo w odległości jednego centymetra od taśmy dwustronnej.
Odetnij końcówki wymaganej liczby 10-mikrolitrowych końcówek filtra i napełnij każdą końcówkę 10 mikrolitrami PBS. Następnie umieść końcówki na plastelinie i zabezpiecz je delikatnym naciskiem. Następnie unieruchamiaj komary, usuwając im nogi i skrzydła.
Przymocuj komary do taśmy nad końcówkami filtra. Delikatnie umieść trąbkę każdego komara w końcówce filtra. Po 30 minutach zdejmij końcówki filtra i wyrzuć glinę i taśmę.
Przenieś zebraną ślinę do probówek reakcyjnych zawierających 10 mikrolitrów PBS. Delikatnie wymieszaj ślinę i PBS i przenieś mieszaninę do dołków 96-dołkowej płytki. Inkubuj płytkę przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź komórki pod kątem obecności efektu cytopatycznego. Gdy studzienka jest pozytywna pod względem efektu cytopatycznego, użyj pipety, aby zebrać 140 mikrolitrów supernatantu. Następnie przenieść supernatant do probówki reakcyjnej.
Następnie wymieszać 140 mikrolitrów supernatantu z 560 mikrolitrami buforu AVL i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec dodaj 560 mikrolitrów etanolu i odwróć próbkę do wymieszania. Korzystając z tego protokołu, kilka gatunków komarów zostało przetestowanych pod kątem infekcji wirusem Zika i przenoszenia w różnych warunkach klimatycznych.
W warunkach inkubacji w temperaturze 27 stopni Celsjusza wszystkie gatunki Aedes wykazywały ślinę dodatnią na obecność wirusa Zika. I odwrotnie, żadna z próbek śliny z taksonów Culex nie zawierała dowodów na obecność wirusa. Po opanowaniu tę technikę można wykonać na 50 komarach w ciągu jednej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty z wymuszonym wydzielaniem śliny. Nie zapominaj, że praca z zakażonymi komarami może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania każdego eksperymentu należy zawsze podejmować specjalne środki bezpieczeństwa dotyczące obchodzenia się z komarami w warunkach BSA-3.
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono metodę analizy kompetencji wektorowej komarów, a konkretnie gatunków Aedes albopictus oraz różnych taksonów Culex, w odniesieniu do transmisji wirusa Zika. Technika wymuszonego ślinienia pozwala na jednoczesną analizę wielu komarów bez konieczności wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia wektorów
- Wirusologia
- Choroby przenoszone przez komary
Wstęp
- Zrozumienie kompetencji wektorowej jest kluczowe dla kontroli wirusów przenoszonych przez komary.
- Wymuszone ślinienie jest nową metodą oceny potencjału transmisyjnego komarów.
- Poprzednie metody często wymagały wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, co ta technika ma na celu wyeliminować.
- W tej metodzie niezbędne są precyzyjne umiejętności manualne, co wymaga praktyki i doświadczenia.
Cel badania
- Ocena kompetencji wektorowych różnych gatunków komarów w odniesieniu do wirusa Zika.
- Zaprezentowanie metody umożliwiającej wysokoprzepustową analizę śliny komarów.
- Przedstawienie przewodnika wizualnego dla badaczy rozpoczynających pracę z tą techniką.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mieszaniny posiłku krwiowego do karmienia komarów.
- Technika wymuszonego ślinotoku w celu pobrania śliny z komarów.
- Metody hodowli komórkowych do oceny obecności wirusa Zika.
- Inkubacja i analiza próbek pod kątem efektów cytopatycznych.
Główne wyniki
- Gatunki z rodzaju Aedes wykazały obecność wirusa Zika w ślinie w warunkach kontrolowanych.
- Taksony z rodzaju Culex nie wykazały obecności wirusa Zika w ślinie.
- Po opanowaniu metody możliwe jest przebadanie do 50 komarów w ciągu jednej godziny.
- Demonstracje wizualne znacznie ułatwiają naukę techniki.
Wnioski
- Wymuszone ślinienie jest skuteczną metodą badania transmisji wirusów przenoszonych przez komary.
- Szkolenie i praktyka są niezbędne do pomyślnego wdrożenia tej techniki.
- Podczas pracy z zakażonymi komarami należy przestrzegać środków bezpieczeństwa.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Testy wymuszonego ślinotoku umożliwiają wysokoprzepustową ocenę kompetencji wektorowych komarów bez użycia modeli zwierzęcych, co wspiera wczesną walidację celów w procesie poszukiwania leków przeciwwirusowych. Metoda ta pozwala na ilościowe wykrywanie wirusów zdolnych do replikacji u poszczególnych owadów, dostarczając informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad profilaktycznymi lub terapeutycznymi kandydatami przeciwko arbowirusom. Jej skalowalność i powtarzalność zwiększają wiarygodność prognostyczną w fazie przedklinicznej redukcji ryzyka przy opracowywaniu interwencji blokujących transmisję.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez pomiar potencjału transmisji wirusa w poszczególnych wektorach chorobowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka związanego z celami poprzez bezpośrednią ocenę kompetencji wektora w kontrolowanych warunkach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera segregację projektów w portfolio poprzez identyfikację gatunków wektorów niekompetentnych, co zmniejsza liczbę fałszywie dodatnich wyników w programach badawczych nad arbowirusami.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewania przeciw wirusowego poprzez potwierdzenie podatności wirusa w modelach wektorowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pobieranie śliny i wykrywanie wirusa, zapewniając powtarzalne wyniki ilościowe w dużych kohortach komarów.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy do wysokoprzepustowej oceny związków blokujących transmisję lub szczepionek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez badanie kompetencji wektora w temperaturach istotnych epidemiologicznie (18–27°C).
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki spójnym odczytom obecności wirusa w ślinie.
- Minimalizacja ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące dalszego rozwoju poprzez ustalenie zależnych od temperatury progów transmisji dla głównych kandydatów.
Integracja potoków i procesów roboczych
Metoda wymuszonej saliwacji wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od walidacji celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po ocenę przedkliniczną, w szczególności w przypadku interwencji skierowanych przeciwko arbowirusom.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie obecności wirusa w ślinie komarów jako funkcjonalny odczyt potencjału transmisji.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dzięki standaryzowanemu pobieraniu śliny i detekcji wirusa w komórkach Vero z zastosowaniem metody równoważnej TCID50.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (miano wirusa w ślinie), umożliwiając porównania między gatunkami, szczepami i warunkami środowiskowymi.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez dane o transmisji z rozwarstwieniem temperaturowym, które odzwierciedla okna transmisji istotne w warunkach terenowych.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Służy jako wielokrotna metoda przesiewania wielu arbowirusów (np. ZIKV, DENV, CHIKV) u różnych gatunków wektorów bez konieczności ponownej optymalizacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Większa pewność predykcyjna w walidacji celów, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w biologii transmisji.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność w zespołach entomologicznych i wirusologicznych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach programów przeciwwirusowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na empirycznych danych dotyczących kompetencji wektora.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z komarami, wirusologią oraz technikami mikrochirurgicznymi w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego BSL-3.
- Zależność od specjalistycznej aparatury, w tym urządzeń do stymulacji ślinotoku, inkubatorów z precyzyjną kontrolą wilgotności oraz mikroskopii do oceny efektu cytopatycznego.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania posiłków krwi, harmonogramów inkubacji oraz odstępów czasowych między pobraniami śliny.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują specyficzne dla gatunku rozmiary aparatów gębowych, zachowanie podczas żerowania oraz morfologię gruczołów ślinowych w różnych modelach wektorów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność przeprowadzenia rozległych szkoleń w celu osiągnięcia biegłości oraz zależność metody od odzyskania żywego wirusa ze śliny.
