Name: Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę izolacji i transfekcji pierwotnych neuronów ruchowych myszy przy użyciu magnetofekcji. Technika ta umożliwia modelowanie chorób neurodegeneracyjnych i badanie mechanizmów motoneuronów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować "Association pour le développement de la neurogénétique" za stypendium dr Jacquier oraz AFM-Telethon za wsparcie poprzez plan strategiczny MyoNeurAlp. Chcielibyśmy również podziękować dr Chrisowi Hendersonowi, dr Williamowi Camu, dr Brigitte Pettmann, dr Cedricowi Raoulowi i dr Georgowi Haase, którzy uczestniczyli w opracowywaniu i doskonaleniu techniki oraz szerzyli swoją wiedzę.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zaakceptowane przez komisję etyki instytucji.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml 4% BSA dializowanego w pożywce L-15.
	<ol>
		<li>Rozpuścić sproszkowaną albuminę surowicy bydlęcej w stężeniu 4% (w/v) w 10 ml pożywki L-15.</li>
		<li>Dodać roztwór do kasety dializacyjnej o pojemności 20 ml z wartością odcięcia 20 kDa. Dializować z 500 ml pożywki L-15 przez 3 dni pod mieszaniem w temperaturze 4 °C. Zmieniaj pożywkę L-15 codziennie.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór przez membranę 0,22 μm i podwielokrotność w probówkach o pojemności 15 ml. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: W tym protokole stosuje się następujące odniesienia: niemodyfikowane surowe podłoże L-15 = pożywka L-15, kwaśne podłoże L-15 = pH L-15 i podłoże zasadowe L-15 = wodorowęglan L-15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 200 ml pH L-15.
	<ol>
		<li>Dostosuj pH pożywki L-15: Najpierw napełnij butelkę do mycia kilkoma kawałkami suchego lodu. Wstrzyknąć gaz (CO2) do pożywki L-15, aż kolor zmieni kolor na pomarańczowy (~pH 6,4 i ciśnienie ~40). pH można również regulować za pomocą standardowego pH-metru.</li>
		<li>Przefiltrować pożywkę przez membranę 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 100 ml wodorowęglanu L-15.
	<ol>
		<li>Dodać 2,5 ml 7% wodorowęglanu sodu do 97,5 ml pożywki L-15 i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj suplementy IPCS (Insulina Putrescin Conalbumin Selenite).
	<ol>
		<li>Rozpuścić 2,5 mg insuliny w 0,5 ml 0,1 M HCl. Dodać 4,5 ml podwójnie destylowanej wody.</li>
		<li>Rozpuścić 8 mg putrescyny w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Rozpuścić 100 mg konalbuminy w 10 ml PBS.</li>
		<li>Rozpuścić 1 mg seleninu sodu w 19,3 ml wody, dostosować pH do 7,4 i rozcieńczyć roztwór 10-krotnie.</li>
		<li>Połączyć 1 ml roztworu insuliny, 1 ml roztworu putrescyny, 1 ml konalbuminy i 0,1 ml roztworu seleninu sodu, aby uzyskać 3,1 ml roztworu suplementu IPCS. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór progesteronu o stężeniu 0,02 mM.
	<ol>
		<li>Rozpuść 1 mg progesteronu w 1,6 ml 80% etanolu.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór 100-krotnie w 100% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 100 ml kompletnej pożywki L-15.
	<ol>
		<li>Dodać 1,8 ml roztworu D-glukozy (200 mg/ml) do 92 ml pH L-15, aby uzyskać końcowe stężenie 3,5 mg/ml glukozy.</li>
		<li>Połącz 1 ml 100x penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml), 2 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 3,1 ml mieszanki IPCS i 0,1 ml roztworu progesteronu (2 x 10-5 M).</li>
		<li>Przefiltrować pożywkę na membranie 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 5 ml roztworu gradientu gęstości (końcowe stężenie 5,5%) na eksperyment.
	<ol>
		<li>Dodać 476 μl komercyjnej pożywki o gradionym gradiencie gęstości 60% do 4524 μl L-15 (jeśli to możliwe, bez czerwonego fenolu w celu zwiększenia kontrastu wizualnego na interfazie; stosunek rozcieńczenia 1:10,5).</li>
		<li>Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie lub zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 10 ml pożywki hodowlanej.
	<ol>
		<li>Dodaj 200 μl pożywki uzupełniającej do 9,6 ml pożywki do hodowli komórek neuronalnych.</li>
		<li>Dodaj 200 μl inaktywowanej termicznie surowicy końskiej (która ma tendencję do różnicowania prekursorów komórek glejowych i przeciwdziała proliferacji) do 25 μl glutaminy i 10 μl 2-merkaptoetanolu.</li>
		<li>Przefiltruj media przez filtr 0,22 μm.</li>
		<li>Dodać następujące czynniki neurotroficzne: rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF) w końcowym stężeniu 10 ng/ml oraz neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) i neurotroficzny czynnik pochodzenia glejowego (GDNF) w końcowych stężeniach 1 ng/ml.</li>
		<li>Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 50 ml pożywki preparucyjnej.
	<ol>
		<li>Dodaj 2,25 ml glukozy (200 mg/ml) do 47,05 ml HBSS. Dodać 700 μl 1 M HEPES, o pH 7,4. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 4% roztwór PFA.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 20 g PFA w 500 ml PBS.</li>
		<li>Pod kapturem chemicznym podgrzać roztwór do temperatury 60 °C i dodawać kilka kropli 1 M NaOH, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną i dostosować pH do 7,2. Przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Alternatywnie można użyć innych komercyjnych roztworów PFA i rozcieńczyć je do 4% w PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed użyciem wyczyść narzędzia do preparowania, w tym kleszcze, nożyczki i naczynia silikonowe, 70% etanolem, a po użyciu mydłem i czystą wodą.</li>
</ol>
2. Powłoka naczynia z poliornityny/laminy (Po/L)
UWAGA: Objętości są dostosowane do pokrycia płytki 24-dołkowej.
<ol>
	<li>W razie potrzeby umieść w studzience sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm.</li>
	<li>Pokryj studzienki 500 μl 10 μg/ml roztworu poli-L-ornityny rozpuszczonego w wodzie.</li>
	<li>Pozwól studzienkom osiąść w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń roztwór poli-L-ornityny i susz na powietrzu przez 30 minut.</li>
	<li>Studzienki pokryć na noc w temperaturze 37 °C 500 μl lamininy o stężeniu 3 μg/ml w wodorowęglanie L-15, 
	UWAGA: Studzienki można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 7 dni. W przypadku długich inkubacji dodanie sterylnego PBS między studzienkami może pomóc w uniknięciu parowania pożywki.</li>
</ol>
3. Sekcja
<ol>
	<li>Złożyć w ofierze ciężarną mysz, gdy zarodki są w stadium embrionalnym E12.5. Oczyść brzuch 70% etanolem.</li>
	<li>Usuń macicę, przecinając dwa jajowody i pochwę i umieść ją na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS (bez Ca2 + Mg2 +).</li>
	<li>Zebrać wszystkie zarodki i przenieść je do świeżego, zimnego PBS (bez Ca2 + Mg2 +) na szalce Petriego.</li>
	<li>Umieść jeden zarodek w naczyniu pokrytym silikonem i wypełnionym pożywką separacyjną (z HBSS, 4,5 g/L glukozy i 7 mM HEPES pH 7,4). 
	UWAGA: Sekcja zarodków odbywa się pod mikroskopem przy użyciu czystych, cienkich kleszczy i nożyczek. Alternatywnie do preparacji można użyć zwykłej szalki Petriego bez silikonu.</li>
	<li>Usuń głowę, ogon i wnętrzności, używając kleszczy jako nożyczek.</li>
	<li>Trzymaj zarodek brzuchem przy silikonie za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą drugiej pary kleszczy włóż jedną z końcówek do centralnego kanału rostralnego rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Zamknij kleszcze, aby rozerwać tkankę grzbietową na kilka milimetrów.</li>
	<li>Powtarzaj tę operację w kierunku strony ogonowej, aż cały rdzeń kręgowy zostanie otwarty (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Odłącz rostralną część rdzenia kręgowego (tułów mózgowy) od ciała.</li>
	<li>Obróć zarodek, aby utrzymać otwarty rdzeń kręgowy przy silikonie.</li>
	<li>Ściśnij rostralną część rdzenia kręgowego i pociągnij zarodek za głowę, aby usunąć rdzeń kręgowy. 
	UWAGA: Opony mózgowe i zwoje korzenia grzbietowego (DRG) powinny pozostać przyczepione do zarodka. W przeciwnym razie ostrożnie odciągnij wszelkie pozostałe opony mózgowe i DRG nadal przyczepione do rdzenia kręgowego. Na tym etapie można również pobrać DRG do hodowli wrażliwych neuronów (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Spłaszcz rdzeń kręgowy na silikonie i usuń grzbietową połowę rdzenia, przecinając wzdłuż środka każdej strony za pomocą skalpela. Pokrój środkową część na 10 kawałków za pomocą skalpela i przenieś kawałki do nowej tuby.</li>
</ol>
4. Zawieszenie komórek rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Powtórz tę procedurę preparowania dla 6 do 8 rdzeni kręgowych.</li>
	<li>Pozwól, aby kawałki rdzenia kręgowego zebrały się na dnie rurki i zastąp HBSS 1 ml pożywki Ham-F10.</li>
	<li>Dodać 10 μl trypsyny (2,5% w/v; stężenie końcowe 0,025%). Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, należy przenieść fragmenty do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 800 μl kompletnej pożywki L-15, 100 μl 4% (w/v) BSA i 100 μl DNazy (1 mg/ml w pożywce L-15).</li>
	<li>Przeprowadzić dwukrotne rozcieranie, odsysając 1 ml za pomocą pipety P1000. Pozwól fragmentom osiąść na 2 minuty. Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Do fragmentów dodać 900 μl kompletnej pożywki L-15, 100 μl 4% (w/v) BSA i 100 μl DNazy (1 mg/ml w pożywce L-15).</li>
	<li>Rozcierać 6 razy, odsysając 1 ml za pomocą pipety P1000. Pozwól fragmentom osiąść na 2 minuty. Dodać supernatant do probówki o pojemności 15 ml otrzymanej w kroku 4.5.</li>
	<li>Do fragmentów dodać 900 μl kompletnej pożywki L-15, 100 μl 4% (w/v) BSA i 100 μl DNazy (1 mg/ml w pożywce L-15).</li>
	<li>Rozcierać 10 razy, odsysając 1 ml za pomocą pipety P1000. Pozwól fragmentom osiąść na 2 minuty. Dodać supernatant do probówki o pojemności 15 ml otrzymanej w kroku 4.5. Postępuj z supernatantem.</li>
	<li>Używając pipety P1000, delikatnie umieść poduszkę 2 ml BSA 4% (w/v) na dnie probówki z supernatantem. Wirować przy 470 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 2 ml kompletnej pożywki L-15.</li>
</ol>
5. Wzbogacenie MN przez gęstość gradientu
<ol>
	<li>Podziel zawiesinę komórek na dwie probówki o pojemności 15 ml (każda po 1 ml). Następnie dodaj 2 ml kompletnej pożywki L-15. Jeśli zaczynasz od 6 zarodków, użyj odpowiednika 3 zarodków w probówce w 3 ml pożywki.</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu gradientu gęstości, powoli dodając roztwór na dno każdej probówki, aby uzyskać ostrą granicę fazy.</li>
	<li>Wirować przy 830 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym kroku małe komórki powinny znajdować się na dnie probówki, podczas gdy duże komórki, takie jak MN, powinny znajdować się na granicy faz roztworu gradientu gęstości / medium.</li>
	<li>Zebrać komórki na granicy faz, zasysając 1 lub 2 ml i przenieść je do świeżej probówki o pojemności 15 ml. Dostosuj objętość do 10 ml za pomocą pożywki o pH L-15.</li>
	<li>Dodać 2 ml 4% poduszki BSA na dno probówki i odwirować przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml kompletnej pożywki L-15.</li>
	<li>Powtórz krok 5.5.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Policz liczbę komórek i ich żywotność pod mikroskopem z kontrastem fazowym za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: W przypadku 6 rdzeni kręgowych oczekuje się, że liczba komórek wyniesie około 1 x 105 MN.</li>
</ol>
6. Kultura MN
<ol>
	<li>Rozcieńczyć MN do odpowiedniej gęstości, zwykle od 5 000 do 10 000 komórek w 500 μl pożywki hodowlanej na basenie na płytce 24-dołkowej. 
	UWAGA: Gęstość wysiewu wynosi około 30 000 i 1 500 komórek odpowiednio dla płytek 6- i 96-dołkowych.</li>
	<li>Usuń roztwór lamininy za pomocą P1000.</li>
	<li>Natychmiast przenieść MN rozcieńczone w pożywce hodowlanej na płytki powlekające, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Inkubować kulturę przez 2 dni w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
7. Magnetofekcja MN
UWAGA: W poniższych krokach, użyte ilości są przeznaczone do transfekcji jednego dołka z płytki 24-dołkowej. Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać inny format.
<ol>
	<li>W celu przygotowania DNA należy ponownie zawiesić 1 μg DNA w 50 μl pożywki do hodowli neuronów i wirować przez 5 sekund.</li>
	<li>W celu przygotowania rurki perełkowej należy ponownie zawiesić 1,5 μl kulek w 50 μl pożywki do hodowli neuronów.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu kulek do 50 μl roztworu DNA i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (całkowita objętość = 100 μl).</li>
	<li>Podczas tej inkubacji należy pobrać 100 μl pożywki hodowlanej z dołka, który będzie transfekowany. 
	UWAGA: Umieść płytkę magnetyczną w inkubatorze, aby ogrzać ją do 37 °C.</li>
	<li>Przenieść 100 μl mieszaniny DNA/kulek do studzienki i inkubować płytkę przez 20–30 minut na płytce magnetycznej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 24 godziny przed wykryciem ekspresji cDNA.</li>
</ol>
8. Utrwalanie i barwienie
<ol>
	<li>Umyj kulturę 2 razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Inkubować kulturę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w 4% PFA/PBS.</li>
	<li>Umyj kulturę 2 razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Inkubować kulturę w 500 μl buforu blokującego (PBS, 4% BSA, 2% normalna surowica, 0,3% Triton X-100, 0,1 M glicyny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Normalna surowica powinna pochodzić z tego samego gatunku, co przeciwciało drugorzędowe (np. Normalna surowica kozia).</li>
	<li>Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 250 μl buforu blokującego. 
	UWAGA: Na przykład TUJ1 jest używany przy 1/1000, SMI32 jest używany przy 1/1 000, a Lc3b jest używany przy 1/200.</li>
	<li>Umyj kulturę 3 razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Inkubować kulturę z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem rozcieńczonymi w 250 μl buforu blokującego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj kulturę 3 razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Montaż na szkiełkach szkiełkowych za pomocą medium montażowego.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li>
<li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li>
<li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li>
<li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28700839">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li>
<li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+ALS%3A+from+genes+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li>
<li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287465251_Purified_embryonic_motoneurons">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li>
<li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF%3A+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alsin%2FRac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li>
<li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas%2C+Daxx%2C+and+FasL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li>
<li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wildtype+motoneurons%2C+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li>
<li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li>
<li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li>
<li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%CE%B3+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li>
<li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li>
<li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li>
<li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+spinal+motor+neuron+diversity%3A+a+long+quest+for+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z krytycznych punktów tego protokołu jest to, że zarodki myszy są preparowane w precyzyjnym oknie czasowym podczas rozwoju (E12.5) w celu optymalizacji ilości MN uzyskanych na końcu. Ponadto, aby uzyskać optymalną wydajność, rozwarstwienie należy wykonywać rano lub wczesnym popołudniem. Przed E12,5 (np. przy E11,5) rozwarstwienie jest trudne, zwłaszcza jeśli chodzi o eliminację opon mózgowych. Po E12,5 liczba uzyskiwanych MN znacznie spada. Aby kontrolować etap rozwoju zarodka, dorosłe samice i samce są n...

Choroby nerwowo-mięśniowe obejmują różne klinicznie i genetycznie odrębne patologie, które charakteryzują się zmianami w mięśniach i/lub układzie nerwowym. Dzięki postępowi w technologiach sekwencjonowania, w ciągu ostatniej dekady zidentyfikowano setki genów odpowiedzialnych za te rzadkie zaburzenia (lista dostępna w Centrum Chorób Nerwowo-Mięśniowych, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Różnorodność zidentyfikowanych mutacji wskazuje, że różne mutacje w pojedynczym genie mogą powodować różne fenotypy i choroby1,2,3 oraz że mutacje w różnych genach mogą powodować podobne fenotypy4,5. W tym kontekście podejmowane są wysiłki na rzecz opracowania modeli komórkowych, które mogą stać się potężnymi narzędziami do analizy konsekwencji mutacji i mechanizmów patologicznych.
Rdzeniowe MN mają duże somy zlokalizowane w brzusznych rogach rdzenia kręgowego, tworzą długie aksony do docelowych włókien mięśni szkieletowych i pozwalają na dobrowolne ruchy poprzez uwalnianie acetylocholiny w połączeniach nerwowo-mięśniowych. Ponieważ MN są dotknięte chorobami nerwowo-mięśniowymi, takimi jak stwardnienie zanikowe boczne, choroba Charcota-Marie-Tootha (CMT) i rdzeniowy zanik mięśni, dr Henderson i współpracownicy opracowali pierwszy protokół6, który pozwolił na hodowlę rdzeniowych MN in vitro i odkrycie czynnika neurotroficznego GDNF7 (czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego). Udoskonalenia techniczne od tego czasu pozwoliły na dokładniejsze oczyszczanie rdzeniowych MN i ich podtypów przy użyciu FACS8, ale wzbogacanie przez gradient gęstości pozostaje potężne i szeroko stosowane w laboratoriach obecnie pracujących z pierwotnymi rdzeniowymi MNs9,10,11,12,13,14. Następnie możliwe jest również uzyskanie wyższego stopnia oczyszczenia MN poprzez immunopanning, wykorzystując marker powierzchniowy p75(NTR) 15,16,17.
Rdzeń kręgowy zawiera różne podtypy MN szyjnych, piersiowych i lędźwiowych, a także środkowe i boczne kolumny motoryczne, które różnią się między sobą położeniem w rogu przednim na osi grzbietowo-brzusznej oraz między celami, które unerwiają8,18. Pierwotne kultury MN mogą odzyskać wszystkie te podtypy MN w proporcjach fizjologicznych. Głównym ograniczeniem tej techniki jest niewielka liczba MN uzyskanych pod koniec zabiegu; w rzeczywistości można oczekiwać, że uzyska około 105 MN z sześciu zarodków, co nadaje się do mikroskopii, ale ogranicza do eksperymentów biochemicznych. Aby przeprowadzić eksperymenty z bardziej wystandaryzowanymi podtypami i licznymi MN (>106 komórek), należy rozważyć MN pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych18.
Transfekcja dzikich transgenów lub endogennych genów typu dzikiego do pierwotnych MN jest szybkim i pomocnym narzędziem do rozszyfrowywania ścieżek fizjopatologicznych, zwłaszcza gdy modele myszy są niedostępne. Magnetofekcja jest jedną z technik transfekcji neuronów pierwotnych, podobną do lipofekcji bez związanej z nią neurotoksyczności. Co więcej, transfekcja może być wykonana na dojrzałych neuronach po kilku dniach in vitro, w przeciwieństwie do technik opartych na elektroporacji9. Jednak jedną z wad tej techniki jest to, że kulki wiążą kwasy nukleinowe w kulturze, powodując szum podczas etykietowania DAPI. Infekcja wirusowa jest prawdopodobnie najskuteczniejszą techniką transfekcji MN; Jednak magnetofekcja nie wymaga pewnych procedur bezpieczeństwa potrzebnych do produkcji wirusa i infekcji komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa miska preparcyjna</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe</td> Sylgard <td>NeuVitro, Szkło Knittel</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Kasety Slide a Lyzer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20 000 MWCO ; 30 mL</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca</td><td></td> Sterylne filtry strzykawkowe <td>Millipore</td> SCGVU02RE <td></td></tr> GP <tr><td>Płytka 4-dołkowa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td>ThermoFisher Scientific 167063 Kleszczyki płytkowe z powłoką Delta</tr><tr><td></td><td>FST firmy Dumont</td><td>11252-20</td>#5 <td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td> do kleszczyków <td>FST firmy Dumont</td><td>14060-10</td><td>cienkie nożyczki</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> skalpel FST firmy Dumont <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>10035-20</td> skalpel z <td>zakrzywionym ostrzem</td></tr><tr><td></td><td>FST firmy Dumont</td><td>10316-14</td><td>skalpel z mikronożem</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Greiner</td><td>663102</td><td>&oslash; x h = 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Rurka polipropylenowa 15 ml</td><td></td><td></td> Bibuła filtracyjna Falcon 352096 <td></td></tr><tr><td></td> koło <td>Watman</td><td>1001125</td><td>, szkiełko komorowe o średnicy 125 mm</td></tr><tr><td></td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 komory</td></tr><tr><td>Plazmid pCAGEN</td><td>Addgene</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Uwagi</td></tr><tr><td>Roztwory i podłoża</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejSigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium, bez czerwonego fenolu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Poli-DL-Ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna 2,5%, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca Mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>bez Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>sodu ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórek neuronów</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobasal Plus podłoże</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES bufor 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka o gradiantach gęstości</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>pożywka</td><td>suplementowa ThermoFisher Scientific</td><td>A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>Surowica dla koni inaktywowana termicznie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Immuno fluorescencja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>bez Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Acetylotransferaza choliny (CHAT)</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament H niefosforylowany (SMI32)</td><td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF przy 1/1000</td></tr><tr><td>Wysepka-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Wysepka-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>HB9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Vectashield</td><td>Tubulina Vector Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Beta3 (klon Tuj1)</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF przy 1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#2775</td><td>IF przy 1/200</td></tr></tbody></table>

modelowanie choroby charcota-marie-tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneracja rdzeniowych neuronów ruchowych (MN) jest związana z szerokim spektrum zaburzeń neurologicznych, w tym stwardnieniem zanikowym bocznym, chorobą Charcota-Marie-Tootha i rdzeniowym zanikiem mięśni, które są związane z atrofią mięśni. Pierwotne hodowle rdzeniowych MN były szeroko stosowane w celu wykazania udziału określonych genów w takich chorobach i scharakteryzowania komórkowych konsekwencji ich mutacji. Protokół ten modeluje pierwotną kulturę MN wywodzącą się z przełomowych prac Hendersona i współpracowników sprzed ponad dwudziestu lat. Po pierwsze, szczegółowo opisujemy metodę wycinania przednich rogów rdzenia kręgowego z zarodka myszy i izolowania MN od sąsiednich komórek za pomocą gradientu gęstości. Następnie prezentujemy nowy sposób efektywnej transfekcji MN plazmidami ekspresyjnymi za pomocą magnetofekcji. Na koniec ilustrujemy, jak naprawić i immunobarwić pierwotne MN. Wykorzystując mutacje neurofilamentów, które powodują chorobę Charcota-Marie-Tootha typu 2, protokół ten demonstruje jakościowe podejście do ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania i badania ich udziału we wzroście, utrzymaniu i przeżyciu MN.

Po 24 godzinach hodowli motoneurony (MNs) powinny wykazywać już znaczny wzrost aksonów (przynajmniej 6-krotnie dłuższych niż rozmiar somy). W kolejnych dniach aksony powinny nadal rosnąć i tworzyć rozgałęzienia (Rysunek 2). Wystąpią różne morfologie ze względu na specyfikę podtypów. Na przykład motoneurony kolumny przyśrodkowej, które unerwiają mięśnie osiowe, mają krótsze i bardziej rozgałęzione aksony niż motoneurony bocznej kolumny ruchowej, które unerwiaj...

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w neurobiologii, takie jak polaryzacja neuronów ruchowych, prowadzenie aksonów, transport aksonów i mechanizmy neurodegeneracyjne. Główną zaletą tej techniki jest uzyskanie wysoce wzbogaconej kultury neuronów ruchowych, podczas gdy my bierzemy do ekspresji naszego białka knockdown za pomocą drobnego uczucia. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść jeden zarodek w naczyniu z pożywką separacyjną zakodowaną silikonem.Pod mikroskopem przytrzymaj zarodek brzuchem przy silikonowym kleszku. Za pomocą drugiej pary kleszczy włóż jedną z końcówek do centralnego kanału rdzenia kręgowego roswada. Następnie zamknij kleszcze, aby lekko rozerwać tkankę grzbietową.Powtarzaj tę operację w kierunku strony connella, aż cały rdzeń kręgowy zostanie otwarty. Następnie ustaw zarodek tak, aby otwarty rdzeń kręgowy przylegał do silikonu. Następnie odłącz część rostrad rdzenia kręgowego od ciała.Ściśnij część rostrad rdzenia kręgowego i pociągnij zarodek za głowę, aby usunąć rdzeń kręgowy. Ostrożnie odciągnij wszelkie pozostałe opony mózgowe i DRG nadal przyczepione do rdzenia kręgowego. Spłaszcz rdzeń kręgowy na krzemie i za pomocą skalpela usuń grzbietową połowę rdzenia, przecinając wzdłuż środka każdej strony.Pokrój środkową część na dziesięć kawałków i przenieś je do nowej tuby. Aby przygotować zawiesinę komórek rdzenia kręgowego, należy zebrać kawałki rdzenia kręgowego na dnie rurki. Zastąp HBSS jednym mililitrem pożywki Ham F-10 i dodaj dziesięć mikrolitrów trypsyny.Inkubować probówkę przez dziesięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, przenieś fragmenty do nowej 15-mililitrowej probówki, zawierającej 800 mikrolitrów kompletnej pożywki L-15, 100 mikrolitrów 4% BSA i 100 mikrolitrów DNA i dwukrotnie miareczkować. Pozwól fragmentom osiąść przez dwie minuty przed zebraniem supernatantu w świeżej 15-mililitrowej probówce.Delikatnie dodaj dwa mililitry 4% BSA na dnie probówki sklarowanej nad osadem. Centro łączy go pod kątem 470 x grawitacja przez 5 minut. Po 5 minutach usunąć supernatant i ponownie zawiesić paletę komórek z 2 mililitrami kompletnego podłoża L-15.W celu wzbogacenia neuronów ruchowych podziel zawiesinę komórkową na dwie 15-mililitrowe rurki. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki L-15 PH do każdej probówki. Jeśli zaczynasz od sześciu zarodków, użyj odpowiednika trzech zarodków na probówkę i trzech mililitrów pożywki.Powoli dodawaj 2 mililitry roztworu gradiencji gęstości na dno każdej probówki, aby uzyskać ostry interfejs. Następnie stopij go w temperaturze 830 x grawitacja przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym kroku małe komórki powinny znajdować się na dnie rurki, podczas gdy duże komórki - takie jak motoneuron - powinny znajdować się na granicy rozkładu gradientu gęstości / medium.Asperae 1 do 2 mililitrów komórek na granicy faz i przenieś je do świeżej 15-mililitrowej probówki. Dostosuj objętość do dziesięciu mililitrów za pomocą pożywki L-15 PH. Następnie dodaj dwa mililitry poduszki 4% BSA na dno dwóch probówek.I bezpiecznik centro przy 470 x grawitacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach usunąć supernatant i ponownie zawiesić paletę oraz 3 mililitry kompletnego podłoża L-15. Powtórz wirowanie przy 470 x grawitacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej.Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić paletę komórek i dwa mililitry kompletnej pożywki hodowlanej. Aby wyhodować neurony ruchowe, rozcieńcz je do 5 000-10 000 komórek w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej na basenie na 24-dołkowej płytce. Następnie usunąć roztwór blaszek za pomocą końcówki pipety P-1 000.Neurony ruchowe rozcieńczone w pożywce hodowlanej należy natychmiast przenieść na płytki kodujące, aby uniknąć wysuszenia. Aby przygotować DNA, ponownie zawiesić 1 mikrogram DNA w 50 mikrolitrach pożywki do hodowli neuronów.I wirować przez 5 sekund. Aby przygotować probówkę B, ponownie zawiesić 1,5 mikrolitra kulek w 50 mikrolitrach pożywki do hodowli neuronów. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu kulek do 50 mikrolitrów roztworu DNA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Podczas tej inkubacji należy pobrać 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej ze studzienki, która będzie transfekowana. Następnie przenieś 100 mikrolitrów mieszanki kulek DNA do każdej studzienki. I inkubować 24-dołkową płytkę przez 20-30 minut na płytce magnetycznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pokazana tutaj morfologia neuronu współczesnego ujawniona przez stanie endogennego, niefosforylowanego łańcucha ciężkiego neurofilamentu po czterech dniach hodowli. Na tych obrazach pokaż morfologię neuronu modemu po czterech dniach in vitro i transfekcję genu trans EGFP za pomocą magnetofekcji w drugim dniu. Neurony motto zostały podbarwione przeciwwagowo markerem SMI-32 lub markerem pan-neuro TUJ-1, a strzałki wskazują somę neuronów.Są to ich konfokalne obrazy neuronów ruchowych z efektem magnetycznym, wyrażających dzikie lub zmutowane konstrukty EGFP NEFH i wybarwione dla ich autofagicznego markera LC-3B. Strzałki pokazują zmutowane agregaty białkowe EGFP NEFH, które są również LC-3B dodatnie Po tej procedurze montoholda curcha można analizować za pomocą mikroskopii wideo w celu wizualizacji transportu aksonów i dodania pewnych wskazówek. Po początkowym opracowaniu w celu odpowiedzi na podstawowe pytania w biologii neuronalnej, technika ta okazała się również potężnym narzędziem do badania fizjologicznych mechanizmów patologicznych związanych ze spektrum zaburzeń neuronów ruchowych, takich jak choroba zespołu wstrząsu toksycznego, stwardnienie troficzne boczne Samuela lub rdzeniowy zanik mięśni.

modeling-charcot-marie-tooth-disease-vitro-transfecting-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Hodowlane komórki mięśniowe są niewystarczającym modelem do odtworzenia unerwionego mięśnia in vivo. Funkcjonalną jednostkę motoryczną można odtworzyć in vitro poprzez unerwienie zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych przy użyciu eksplantatów rdzenia kręgowego embrionu szczura. Niniejszy artykuł opisuje sposób tworzenia kokultur eksplantatów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych.

Funkcjonalna jednostka motoryczna w szalce hodowlanej: współhodowla eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

W tym protokole przedstawiamy procedury tworzenia modeli mioblastów dystrofii 1 dyotonii, w tym zoptymalizowane utrzymanie komórek C2C12, transfekcję/transdukcję genów i różnicowanie miocytów.

Modelowanie dystrofii miotonicznej 1 w komórkach mioblastów C2C12

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Ten protokół umożliwia szybką i efektywną konwersję indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej, poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych z indukowalnych wektorów piggyBac.

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Poznaj metodę izolacji i transfekcji pierwotnych neuronów ruchowych myszy przy użyciu magnetofekcji. Technika ta umożliwia modelowanie chorób neurodegeneracyjnych i badanie mechanizmów motoneuronów in vitro.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Przeglądaj więcej filmów