Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w każdej dziedzinie badań, w której sygnał fosforylacji jest przedmiotem zainteresowania, takich jak dziedzina raka, w celu oceny zmian w sieciach sygnałowych po oporności terapeutycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że tysiące fosfopeptydów można zidentyfikować w stosunkowo prosty i niedrogi sposób, aby globalnie ocenić fosfoproteom. Aby pobrać tkankę nowotworową, zważ guz i w probówce hodowlanej dodaj dwa mililitry lodowatego buforu do lizy na każde 100 miligramów tkanki.

Następnie użyj homogenizatora ręcznego lub stacjonarnego do homogenizacji lizatu. Aby zredukować i salkoholizować próbkę, podgrzej probówkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić próbkę na lodzie przez 15 minut. Będąc jeszcze na lodzie, poddaj sonikację lizatu trzykrotnie, a następnie podgrzej próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Umieścić probówkę sonikacyjną w wahadłowym wirniku kubełkowym i odwirować lizat w temperaturze 3, 500 g i 15 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie zebrać supernatant i wyrzucić osad. Aby roztrawić lizat, użyj 100 milimolowych trisów, aby rozcieńczyć próbkę 12-krotnie, aby zmniejszyć ilość guanidyny. Na pięć miligramów białka dodać 10 mikrogramów endopeptydazy lizylowej lub lizy-C i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć do sześciu godzin.

Przygotuj jeden miligram na mililitr trypsyny poddanej działaniu TPCK w jednym milimolowym HCL z 20-milimolowym chlorkiem wapnia i trypsyną dodanymi w stosunku jeden do 100 trypsyny do białka. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie dodaj dodatkową porcję trypsyny do probówki i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Dodaj próbkę do 15-mililitrowego filtra odcinającego o mocy 10 kilodaltonów. Odwirować próbkę w wahadłowym wiadrze lub wirniku o stałym kącie nachylenia w temperaturze 3 500 g i temperaturze 15 stopni Celsjusza, aż objętość retentatu będzie mniejsza niż 250 mikrolitrów. Następnie zebrać przepływ i wyrzucić retentat.

Aby zakwasić próbkę, dodaj około 20 mikrolitrów 5% kwasu trifluorooctowego lub TFA na mililitr lizatu. Dobrze wymieszaj probówkę i użyj paska pH do zmierzenia pH. W razie potrzeby dodaj dodatkowe 5% TFA, aby dostosować pH do 2,5.

Następnie podłącz krótszy koniec kolumny C18 do kolektora próżniowego. Po ustawieniu próżni między 17 a 34 kilopaskalami, użyj trzech mililitrów 100% acetonitrylu i szklanej pipety do zwilżenia kolumny. Zrównoważyć kolumnę za pomocą szklanej pipety i nałożyć dwie trzymililitrowe porcje 0,1% TFA.

Następnie załadować zakwaszoną próbkę do kolumny. Użyj trzech trzymililitrowych objętości 0,1 TFA do umycia kolumny. Następnie nałóż dwa mililitry 40%ACN 0,1%TFA do elucji próbki i zbierz dwie dwumililitrowe frakcje do szklanych probówek hodowlanych.

Za pomocą parafilmu przykryj probówki eluentu i użyj igły o rozmiarze 20, aby przebić od trzech do pięciu otworów w pokrywie przed liofilizacją próbek przez noc. Ponownie zawiesić liofilizowany proszek z 0,5 mililitra lodowatego buforu immunoprecypitacyjnego lub buforu wiążącego IP w każdej frakcji. Przenieś 0,5 mililitra objętości do zawiesiny z drugiej frakcji do probówki z pierwszą frakcją i zachowaj końcówkę pipety.

Użyj kolejnych 0,5 mililitra buforu IP, aby przepłukać każdą probówkę liofilizacyjną przed przeniesieniem zawartości do krioprobówki, a następnie powtórz płukanie przy użyciu dwóch mililitrów buforu IP. Po użyciu P200 z odciętą końcówką do przeniesienia 0,5 miligrama na mililitr zawiesiny kulek przeciwciała do probówki do mikrofugi, dodaj 450 mikrolitrów lodowatego bufora wiążącego IP, aby przepłukać 50 mikrolitrów zawiesiny kulek przeciwciała 4G10 i 25 mikrolitrów zawiesiny kulek przeciwciała 27 B10.4 w probówce do mikrofuge. Odwirować probówkę o masie 100 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę.

Po zaessaniu supernatantu dodać taką samą objętość, jak oryginalna zawiesina bufora wiążącego IP, aby ponownie zawiesić kulki. Dodaj wstępnie umyte kulki pY do zawieszonego roztworu próbki w krioprobówkach z nakrętką, a następnie inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze typu end--end przez noc. Po odwirowaniu kulek należy zachować supernatant, który zostanie użyty do wzbogacenia o peptydy pST.

Następnie użyj 300 mikrolitrów bufora wiążącego IP, aby ponownie zawiesić kulki i przenieść je do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Wirować próbki w temperaturze 100 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Następnie za pomocą 500 mikrolitrów bufora wiążącego IP umyj koraliki trzy razy.

Umyj koraliki czterokrotnie 450 mikrolitrami 25-milimolowego wodorowęglanu amonu o pH 7,5. Zanurz końcówkę ładującą żel nieco poniżej powierzchni stopki i całkowicie zassaj supernatant. Dodaj do koralików czterokrotność objętości ściegu 0,1% TFA.

Następnie dobrze je wymieszaj i inkubuj probówkę w termomikserze z prędkością 1 000 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Przenieść zawiesinę do filtra wirowego o średnicy 0,2 mikrometra i odwirować filtr o masie 850 g przez jedną minutę. Po przeniesieniu elucji do niskobiałkowej probówki wirówkowej wiążącej eluent, należy zagęścić eluent próżniowo do sucha w temperaturze 40 stopni Celsjusza z czasem ogrzewania wynoszącym 300 minut przez noc.

Aby przygotować kulki tlenku tytanu zawarte w końcówkach, dodaj 200 mikrolitrów 100%ACN. Następnie odwróć go i przesuń wąski koniec, aby przesunąć płyn w kierunku nakrętki. Za pomocą żyletki odetnij końcówkę i umieść ją na niskobiałkowej tubce wiążącej.

Następnie zdejmij nakrętkę i włóż mikropipetę, aby zanurzyć pozostały ACN przed powtórzeniem prania. Wstępnie kondycjonuj dwutlenek tytanu 500 mikrolitrami 100% ACN dwa razy. Następnie kondycjonuj dwutlenek tytanu 500 mikrolitrami 0,2-molowego buforu fosforanu sodu o pH 7 dwa razy.

Na koniec użyj 300 mikrolitrów buforu równowagi, aby trzykrotnie umyć koraliki. Dodaj 400 mikrolitrów 50%ACN 0,1%TFA do niskobiałkowej probówki wiążącej. Następnie dodaj 84 mikrolitry kwasu mlekowego.

Przenieś zawieszone fosfopeptydy do niskobiałkowej probówki wiążącej i inkubuj je w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora end-over-end przez jedną godzinę. Po granulowaniu kulek użyj 300 mikrolitrów bufora równowagi, aby umyć je dwa razy i odwirować. Za pomocą 300 mikrolitrów buforu płuczącego spłucz kulki dwa razy.

Następnie przenieś je do filtra wirowego o średnicy 0,2 mikrometra. Po odwirowaniu przenieś jednostkę filtrującą do czystej 1,5 mililitrowej niskobiałkowej rurki wiążącej i za pomocą 200 mikrolitrów 0,9% amonu w wodzie wymyj zawartość dwa razy. Po sprawdzeniu pH należy zagęścić eluent próżniowo do sucha przez noc, aby odparować amoniak.

Aby odsolić peptydy do analizy stwardnienia rozsianego, rozpuść fosfopeptydy w 15 mikrolitrach 0,1% TFA. Oczyść próbkę za pomocą końcówki C18 o zdolności wiązania pięciu mikrogramów i postępuj zgodnie z protokołem producenta. Na koniec, po całkowitym wysuszeniu objętości elucji przez stężenie próżniowe, ponownie zawiesić wysuszone fosfopeptydy w 12,5 mikrolitrach roztworu spektrometrii mas.

Ten barwiony Coomassie żel wstępnie strawionego lizatu potwierdza obecność białek, podczas gdy barwienie po strawieniu lizatu potwierdza całkowite trawienie. Aby zapewnić pełne trawienie, żadne prążki nie powinny pojawiać się powyżej 15 kilodaltonów, z wyjątkiem pasm 30 kilodaltonów i 23,3 kilodaltonów odpowiednio dla lys-C i trypsyny. Dodatek lys-C zmniejsza również liczbę pominiętych rozszczepienia.

Immunoprecypitacja pY skutecznie oddziela peptydy pY od pST wynosiły średnio 85% fosfopeptydów zidentyfikowanych w preparacie pY, a ponad 99% fosfopeptydów zidentyfikowanych w preparacie pST to pST. Dwutlenek tytanu służy do wzbogacania w fosfopeptydy w obu preparatach. Oczekiwany odsetek peptydów w preparacie gotowym do stwardnienia rozsianego, które są fosforylowane, wynosi od 30 do 50%, a większość wykrytych fosfopeptydów ma pojedynczą lub podwójną grupę fosforylową.

Po wykonaniu spektrometrii mas surowe pliki MS są ładowane do oprogramowania analitycznego MS. Jak pokazano tutaj, ustawienie punktu odcięcia prawdopodobieństwa lokalizacji większego niż 0,75 odfiltrowuje około 5% peptydów pY oraz odpowiednio 15% i 34% peptydów pS i pT. Po zastosowaniu tych filtrów, oczekiwana liczba identyfikacji fosfopeptydów na końcu analizy MS wynosi około 300 peptydów pY na pięć miligramów białka wyjściowego i około 7,500 peptydów pS i 640 peptydów pT na 2,5 miligrama wyjściowej ilości peptydu z odpowiednich preparatów wzbogacających.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu sześciu dni, jeśli kroki pY i pST są wykonywane równolegle. Jednak w przypadku więcej niż ośmiu próbek należy wykonać te czynności po kolei, aby zmniejszyć błąd techniczny w ciągu dodatkowych czterech dni. Próbując wykonać te procedury, należy pamiętać o skupieniu się na szczegółach.

Każdy etap jest ważny i może mieć wpływ na jakość końcowych preparatów, w tym niezbędne kontrole jakości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować i trawić białka, a następnie wzbogacać fosfopeptyd w celu analizy za pomocą spektrometrii mas w celu zbadania globalnych zmian w fosfoproteomie.