Przewodnik CRISPR Klonowanie RNA dla systemów ssaków

Metoda ta pozwala na łatwe tworzenie plazmidów prowadzących do ekspresji RNA do eksperymentów wspomaganych przez CRISPR. Główną zaletą tej techniki jest to, że klonowanie można przeprowadzić w jednym kroku, a sparowane przewodnikowe RNA można utworzyć przy użyciu plazmidów ekspresyjnych RNA z jednym przewodnikiem. Aby rozpocząć ten protokół, rozcieńczyć liofilizowane startery w buforze 1X TE do końcowego stężenia 100 mikromolowych.

Porcjować równą ilość starterów do przodu i do tyłu do probówek z nakrętką paskową do PCR. Wirować do mieszania. Następnie odwiruj mieszaniny oligonukleotydów prowadzących RNA pod kątem 100 razy G przez 15 sekund.

Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez pięć minut przed założeniem ligacji. Dodaj od jednego do pięciu mikrogramów wybranego wektora ekspresji przewodnika PSB700 do BSNB1, używając 0,5 mikrolitra BSNB1 na jeden mikrogram wektora. Dodaj wodę destylowaną, aż całkowita objętość wyniesie 40 mikrolitrów i prowadź trawienie przez godzinę w temperaturze 55 stopni Celsjusza.

Uruchom produkty wytrawiające na 1,5% niskotopliwym żelu agarozowym. Wytnij strawione pasmo szkieletu wektora, które odpowiada fragmentowi o wielkości około 9 kilozasad. Przenieś ten plasterek żelu do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.

Korzystając z dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania żelu, wyekstrahuj DNA z żelu agarozowego zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie rozcieńczyć DNA w 10-15 mikrolitrach buforu TE, aby uzyskać skoncentrowaną elucję. Gdy będziesz gotowy do wykonania podwiązania, dodaj 15 mikrolitrów wody destylowanej do fiolki.

Dodać 1 mikrolitr wcześniej wyżarzonych oligonukleotydów przewodnika RNA, jeden mikrolitr trawionego przez BSNB1 przewodnikowego wektora ekspresyjnego PSB700 i 2 mikrolitry buforu reakcyjnego ligazy DNA 10XT4. Następnie wymieszaj ten roztwór, wirując. Dodaj jeden mikrolitr ligazy DNA i ponownie wiruj.

Wirować roztwór 100 razy G przez 15 sekund. Inkubuj reakcje w temperaturze pokojowej przez noc, upewniając się, że zawiera reakcję kontroli ujemnej bez wstawienia, która zawiera sam wektor strawiony przez BSNB1 bez wyżarzonej wstawki oligoty RNA przewodnika. Na początek wyjmij E.coli z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmrażaj ją na lodzie przez 5 do 10 minut.

Dodaj 0,5 mikrolitra przygotowanej mieszaniny reakcyjnej do ośmiu mikrolitrów kompetentnej E. coli. Trzymaj mieszaninę na lodzie przez 30 minut. Szpikuj mieszaninę ciepłem w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund.

Następnie pozwól mieszaninie odpocząć na lodzie przez dwie minuty. Za pomocą wytrząsarki obrotowej odzyskaj kulturę w 250 mikrolitrach pożywki SOC, stosując warunki podane tutaj dla NEB DH5a lub NEB Stables. Następnie umieść 80 mikrolitrów kultury na odpowiedniej płytce bulionowej lizogennej opornej na antybiotyki.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w przypadku NEB DH5a lub w temperaturze 30 stopni Celsjusza w przypadku stajni NEB. Aby rozpocząć, użyj specjalnego protokołu PCR Phusion GC, aby utworzyć potrzebny fragment, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uruchom ten produkt PCR na 1% żelu agarozowym i sprawdź, czy jedno prążki są widoczne na około 490 parach zasad.

Za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu pokrój i wyekstrahuj ten produkt PCR. Następnie podwielokrotnić przygotowaną mieszankę wzorcową 1X do probówek PCR. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać jeden mikrolitr produktu PCR w stężeniu 40 femtomoli na mikrolitr.

W jednym mikrolitrze wektora PSB700 dodaj stężenie 40 femtomoli na mikrolitr. Uwzględnij kontrolę bez wkładki, używając jednego mikrolitra wody zamiast przewodnikowych oligonukleotydów RNA. Trawić wektor i ligować wstawki w jednej reakcji przy użyciu protokołu Golden Gate opisanego w protokole tekstowym.

Po początkowej reakcji złotej bramki dodaj dodatkowe 0,5 mikrolitra enzymu BSNB1 do każdej reakcji. Kontynuuj reakcję w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę. Po zakończeniu reakcji złotej bramki przejdź do wcześniej opisanego procesu transformacji E.coli.

W tym badaniu z powodzeniem stworzono wektory ekspresyjne RNA z pojedynczym przewodnikiem przy użyciu dwóch metod. W pierwszej metodzie szkielet wektora jest wstępnie trawiony i ligowany w serii krótkich oligonukleotydów. Druga metoda wykorzystywała klonowanie Golden Gate do jednoczesnego trawienia i ligacji w jednej reakcji.

Sparowane wektory ekspresji przewodnikowego RNA, z których każdy jest napędzany przez własny niezależny promotor, są z powodzeniem tworzone przez klonowanie niestandardowego fragmentu PCR. Udane klonowanie dla którejkolwiek z tych metod spowoduje pojawienie się znacznie większej liczby kolonii do transformacji z odpowiednim DNA z insercją w porównaniu z płytką kontrolną bez wkładki. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby w kroku klonowania nie uwzględnić żadnych kontrolek wstawiania.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak inżynieria epigenomu, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak wpływ sygnatur chromatyny na ekspresję genów.