Name: Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek endokrynnych trzustki myszy z różnych etapów rozwoju, połączoną z jednokomórkowym sekwencjonowaniem RNA. Technika ta umożliwia szczegółową analizę rozwoju linii komórkowych i heterogeniczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Narodowemu Centrum Nauk o Białkach w Pekinie (Uniwersytet Pekiński) oraz Centrum Peking-Tsinghua za platformę obliczeniową Life Science. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (2015CB942800), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31521004, 31471358 i 31522036) oraz finansowanie z Centrum Nauk Przyrodniczych Peking-Tsinghua dla C.-R.X.

<ol><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
<li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">On the origin of the beta cell.</a> Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+Advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
<li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li>
<li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li>
<li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data%3A+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+in+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li>
<li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v025i01">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li>
<li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadley%2C+W+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer Science & Business Media. (2009).</li>
<li>Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016).</li>
<li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole zademonstrowaliśmy skuteczną i łatwą w użyciu metodę badania profili ekspresji pojedynczych komórek β trzustki. Metoda ta może być stosowana do izolowania komórek endokrynnych z trzustki embrionalnej, noworodkowej i pourodzeniowej oraz do wykonywania analiz transkryptomicznych pojedynczych komórek.
Najważniejszym krokiem jest izolacja pojedynczych komórek β w dobrym stanie. W pełni perfundowane trzustki lepiej reagują na późniejsze trawienie. Niewystarczająca perfuzja, która zw...

Trzustka jest ważnym organem metabolicznym u ssaków. Trzustka składa się z przedziałów hormonalnych i zewnątrzwydzielniczych. Komórki endokrynne trzustki, w tym komórki β produkujące insulinę i komórki α produkujące glukagon, skupiają się razem w wysepkach Langerhansa i koordynują ogólnoustrojową homeostazę glukozy. Dysfunkcja komórek endokrynnych prowadzi do cukrzycy, która stała się poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie.
Komórki endokrynne trzustki pochodzą od progenitorów Ngn3+ podczas embriogenezy1. Później, w okresie okołoporodowym, komórki endokrynne namnażają się, tworząc niedojrzałe wysepki. Te niedojrzałe komórki nadal się rozwijają i stopniowo stają się dojrzałymi wyspami trzustkowymi, które stają się bogato unaczynione, aby regulować homeostazę poziomu glukozy we krwi u dorosłych2.
Chociaż zidentyfikowano grupę czynników transkrypcyjnych, które regulują różnicowanie komórek β, dokładny szlak dojrzewania β komórek jest nadal niejasny. Co więcej, proces dojrzewania komórek β obejmuje również regulację ekspansji liczby komórek3,4 oraz generowanie niejednorodności komórkowej5,6. Mechanizmy regulacyjne tych procesów nie zostały jednak dobrze zbadane.
Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki to potężne podejście, które może profilować subpopulacje komórek i śledzić szlaki rozwoju linii komórkowych7. Korzystając z tej technologii, kluczowe zdarzenia, które zachodzą podczas rozwoju wysp trzustkowych, można rozszyfrować na poziomie pojedynczej komórki8. Wśród protokołów sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, Smart-seq2 umożliwia generowanie pełnowymiarowego cDNA z lepszą czułością i dokładnością oraz stosowanie standardowych odczynników przy niższych kosztach9. Smart-seq2 potrzebuje około dwóch dni na zbudowanie biblioteki cDNA do sekwencjonowania10.
Tutaj proponujemy metodę izolacji komórek β znakowanych fluorescencyjnie od trzustki płodu do dorosłego myszy transgenicznych Ins1-RFP11, przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), oraz przeprowadzanie analiz transkryptomicznych na poziomie pojedynczej komórki, przy użyciu technologii Smart-seq2 (Rysunek 1). Protokół ten można rozszerzyć o analizę transkryptomów wszystkich typów komórek endokrynnych trzustki w stanie normalnym, patologicznym i starzenia.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Igła 1/2" Długość</td><td>Mikroskop</td> stereoskopowy BD <td>305106</td><td></td></tr> Stereofoniczny <tr><td>mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td> Stemi DV4 <td></td> Wirówka Zeiss Stereo Lumar V12 <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr> Polistyrenowa <tr><td></td><td></td><td>rurka</td> okrągłodenna z nasadką sitową BD-Falcon 352235 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka do PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa mata uszczelniająca</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do PCR cienkodołkowa ekstragene</td><td></td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td> Pipeta kapilarna <td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor RNazy</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny II odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Bufor pierwszej nici (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Czyste koraliki XP koraliki</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA TruePrep V2 dla Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>Zawiera 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V3 dla Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td><td>Zawiera 16 N6XX i 24 N8XX</td></tr><tr><td>Zestaw do analizy fragmentów NGS o wysokiej czułości</td><td>Zaawansowane technologie analityczne</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS bez Ca2+ i Mg2+</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> izolacyjny <td>1 i razy; HBSS zawierający 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glukozy, pH 7,4</td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> FACS <td>1 i razy; HBSS zawierający 15 mM HEPES, 5,6 mM glukozy, 1% FBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN starter</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>startery</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Starter</td><td></td><td></td> do przodu <td>5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Starter</td><td></td><td></td> odwrotny <td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Starter</td><td></td><td></td> do przodu <td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Podkład</td><td></td><td></td> odwrócony <td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Komórki endokrynne trzustki, które są skupione w wyspach trzustkowych, regulują stabilność stężenia glukozy we krwi i metabolizm energetyczny. Odrębne typy komórek w wyspach trzustkowych, w tym komórki β wydzielające insulinę, różnią się od powszechnych komórek progenitorowych układu hormonalnego w stadium embrionalnym. Niedojrzałe komórki endokrynne rozwijają się w wyniku proliferacji komórek i dojrzewają w długim okresie rozwoju pourodzeniowego. Mechanizmy leżące u podstaw tych procesów nie są jednak jasno określone. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest obiecującym podejściem do charakteryzowania odrębnych populacji komórek i śledzenia szlaków różnicowania linii komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę sekwencjonowania jednokomórkowego RNA izolowanych komórek β trzustki z trzustki embrionalnej, noworodkowej i poporodowej.

Trzustki wypreparowano z myszy w okresie embrionalnym, neonatalnym i postnatalnym (Rysunek 2A oraz 2B). W przypadku myszy starszych niż 18. dzień postnatalny efekt trawienia zależy od stopnia perfuzji; zatem iniekcja jest najważniejszym etapem izolacji wysepek (Rysunek 2C-2E oraz Tabela 6). Na tym etapie wstrzyknięto taką ilość kolagenazy, aby w pełni wypełnić tr...

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Metoda ta może przynieść odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wysp trzustkowych dotyczące różnicowania linii wysp trzustkowych, dojrzewania i regeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pobieranie pojedynczych komórek wysp trzustkowych w celu wygenerowania wysokiej jakości danych sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Zastosowanie tej techniki rozciąga się w kierunku terapii cukrzycy i innych chorób endokrynologicznych trzustki poprzez analizę transkryptomiczną pojedynczych komórek endokrynnych trzustki w stanach patologicznych.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wprowadzenie igły do wąskiego przewodu żółciowego trzustki w celu perfuzji może być trudne. Na dzień embrionalny 17,5 zarodków. Po otwarciu jamy brzusznej za pomocą pęsety łokciowej przenieś tkankę trzewną do sześciocentymetrowego naczynia z czarnym dnem zawierającego zimny PBS.Użyj kleszczy, aby odłączyć trzustkę od tkanki trzewnej. I umieść tkankę trzustki w 20-mililitrowej fiolce zawierającej pięć mililitrów zimnego roztworu kolagenazy. W przypadku myszy po urodzeniu od zera do 15 myszy, dokładnie wypreparuj wszystkie płaty trzustki przed umieszczeniem tkanki w kolagenazie.W przypadku myszy po urodzeniu od 18 do 60 najpierw usuń mieczykowaty i wyprowadź jelito po prawej stronie jamy brzusznej. Popchnij lewy i prawy przyśrodkowy płat wątroby w każdą stronę, aby odsłonić woreczek żółciowy i wspólny przewód żółciowy. I zaciśnij dwunastnicę za pomocą pary małych zacisków naczyniowych w górnej i dolnej pozycji, aby oskrzydlić miejsce, w którym przewód żółciowy wchodzi do dwunastnicy.Następnie załaduj strzykawkę o pojemności 5 mililitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 30 z zimnym roztworem kolagenazy. I użyj mikroskopu, aby wprowadzić końcówkę igły do pęcherzyka żółciowego. Ostrożnie i płynnie manipuluj igłą przez wspólny przewód żółciowy.I wciśnij tłok, aby przetoczyć trzustkę od jednego do pięciu mililitrów roztworu kolagenazy w zależności od wielkości myszy. Gdy cały roztwór zostanie ukrwiony, użyj kleszczyków, aby natychmiast przenieść trzustkę do 20-mililitrowej fiolki zawierającej pięć mililitrów świeżego zimnego roztworu kolagenazy. Po zebraniu całej tkanki trzustki umieść fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty, a następnie od trzech do pięciu minut delikatnego wstrząsania.Następnie przefiltruj strawiony produkt przez nylonowe sitko o średnicy 0,25 milimetra do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. I użyj 20-mililitrowej strzykawki zawierającej lodowaty PBS, aby dokładnie umyć sitko. W dniu po urodzeniu od 18 do 60 trzustki odwirować przefiltrowaną próbkę i ponownie zawiesić tkankę w 30 mililitrach zimnego PBS.Następnie zdekantować zawiesinę tkanek do sześciocentymetrowego naczynia z czarnym dnem i za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i mikroskopu preparacyjnego wybrać wysepki do przeniesienia do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej niewielką objętość zimnego PBS. W 17,5 dniu zarodkowym po urodzeniu trzustki należy odwirować przefiltrowaną tkankę trzustki i ponownie zawiesić osad w roztworze trypsyny-EDTA na czterominutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji delikatnie spróbuj ocenić osad przez jedną minutę za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie dodaj 0,5-krotność objętości zimnej płodowej surowicy bydlęcej z delikatnym wirowaniem, aby zatrzymać trawienie.Następnie zebrać trawienie przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu FACS w 5-mililitrowej probówce FACS do sortowania za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku pobierania i lizy pojedynczych komórek, świeżo przygotowany bufor do lizy komórek należy podzielić na osiem probówek do PCR z paskami i przenieść pojedynczą komórkę do każdej z nich. Wirować próbki, aby zlizować komórki w celu uwolnienia RNA, a następnie wirować przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i natychmiast przechowywać na lodzie.W celu odwrotnej transkrypcji inkubuj lizaty przez trzy minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie jedną minutę na lodzie. Krótko odwirować próbki przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodać 5,7 mikrolitra mieszanki odwrotnej transkrypcji do każdej próbki, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mikrolitrów dla każdej próbki. Po delikatnym wirowaniu i odwirowaniu załaduj próbki do termocyklera i uruchom program odwrotnej transkrypcji.W przypadku wstępnej amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR dodaj 15 mikrolitrów mieszanki PCR do każdej próbki zawierającej reakcje pierwszej nici, a następnie delikatnie wiruj i odwiruj. Następnie załaduj próbki do termocyklera i uruchom program PCR. W przypadku oczyszczania PCR dodaj 25 mikrolitrów zawieszonych kulek oczyszczających DNA do każdej próbki i dobrze wymieszaj przez wirowanie.Następnie szybko odwiruj próbki w temperaturze pokojowej, aby zebrać płyn, unikając osiadania kulek. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umieścić próbki na odpowiednim stojaku magnetycznym, ostrożnie usuwając i wyrzucając supernatant, gdy roztwór jest klarowny. Umyj koraliki dwoma 30-sekundowymi płukaniami w 200 mikrolitrach świeżo przygotowanego 80% etanolu na pranie.I wyrzuć pozostały etanol po drugim praniu. Gdy kulki wyschną na powietrzu, dodaj 11 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby wymyć cel DNA z kulek, a następnie nastąpić wirowanie. Następnie szybko odwiruj próbki, umieść próbki z powrotem na stanowisku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny i przenieś 10 mikrolitrów każdej próbki do nowej probówki PCR.Pomyślnie amplifikowany cDNA powinien mieć pełną długość powyżej 500 par zasad i być wzbogacony od 1,5 do dwóch kilogramów par zasad. Co więcej, zwykle obserwuje się wzbogacenie cDNA w 500 do 600 par zasad w komórkach insuliny jeden RFP plus , które mogą reprezentować transkrypty insuliny. Jednak fragmenty cDNA w pobliżu 100 par zasad są dimerami starterów, które są zwykle spowodowane nadmiarem starterów i które należy usunąć, powtarzając etap oczyszczania DNA.Fragmenty cDNA między 100 a 500 parami zasad zwykle reprezentują zdegradowany cDNA, który jest spowodowany złym statusem komórki lub problemami z regionem, takimi jak zanieczyszczenie RNazą i należy go wykluczyć. Po oczyszczeniu bibliotek cDNA do sekwencjonowania, cDNA w zakresie od 250 do 450 par zasad można uzyskać poprzez dodanie kulek oczyszczających DNA do pierwszej i drugiej rundy oczyszczania. Po oczyszczeniu kulek DNA wynik jakości sekwencjonowania powinien być większy niż 30 podczas oceny jakości sekwencjonowania.Aby uzyskać wysokiej jakości komórki do dalszych analiz, wyklucza się komórki z mniej niż 0,5 miliona zmapowanych odczytów lub z mniej niż 4 000 wykrytych genów, co ułatwia charakterystykę różnych grup komórek i identyfikację genów, które ulegają niejednorodnej ekspresji w różnych grupach po analizie głównych składowych i hierarchicznym grupowaniu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej perfuzji trzustki przed trawieniem kolagenazy, aby uniknąć nadmiernego trawienia wysp trzustkowych i utrzymać środowisko wolne od RNaz podczas zabiegów jednokomórkowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie wysp trzustkowych i hodowla, aby ułatwić wizualizację struktury wysp trzustkowych oraz zbadać odpowiedzi komórkowe i stymulację lekami.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad trzustką do zbadania mechanizmów rozwoju i regeneracji linii wysp trzustkowych, a także progresji cukrzycy u ssaków.

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.

Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

W tej publikacji opisujemy szybką i wygodną procedurę izolacji i hodowli pierwotnych komórek groniastych trzustki z mysiej trzustki. Metoda ta stanowi cenne podejście do badania fizjologii świeżych, pierwotnych, normalnych/nieprzekształconych zewnątrzwydzielniczych komórek trzustki.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek groniastych trzustki myszy

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Tutaj opisujemy metodę izolacji komórek w mikrośrodowisku trzustki z tkanek embrionalnych, noworodkowych i dorosłych myszy, koncentrując się na izolacji komórek mezenchymalnych. Metoda ta umożliwia profilowanie ekspresji genów komórkowych i wydzielania białek w celu wyjaśnienia sygnałów zewnętrznych, które regulują rozwój, funkcję i nowotworzenie trzustki.

Izolowanie i analiza komórek mezenchymy trzustki za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje, jak generować ludzkie wycinki trzustki od zmarłych dawców narządów w celu badania funkcji komórek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. To innowacyjne podejście umożliwia badanie normalnych i strukturalnie uszkodzonych wysp trzustkowych oraz skomplikowanych interakcji między przedziałami endokrynnymi i zewnątrzwydzielniczymi.

Generowanie wycinków ludzkiej tkanki trzustki w celu badania fizjologii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej trzustki

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę izolacji komórek endokrynnych trzustki myszy z różnych etapów rozwoju, połączoną z jednokomórkowym sekwencjonowaniem RNA. Technika ta umożliwia szczegółową analizę rozwoju linii komórkowych i heterogeniczności.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Przeglądaj więcej filmów