Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Metoda ta może przynieść odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wysp trzustkowych dotyczące różnicowania linii wysp trzustkowych, dojrzewania i regeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pobieranie pojedynczych komórek wysp trzustkowych w celu wygenerowania wysokiej jakości danych sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Zastosowanie tej techniki rozciąga się w kierunku terapii cukrzycy i innych chorób endokrynologicznych trzustki poprzez analizę transkryptomiczną pojedynczych komórek endokrynnych trzustki w stanach patologicznych.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wprowadzenie igły do wąskiego przewodu żółciowego trzustki w celu perfuzji może być trudne. Na dzień embrionalny 17,5 zarodków. Po otwarciu jamy brzusznej za pomocą pęsety łokciowej przenieś tkankę trzewną do sześciocentymetrowego naczynia z czarnym dnem zawierającego zimny PBS.

Użyj kleszczy, aby odłączyć trzustkę od tkanki trzewnej. I umieść tkankę trzustki w 20-mililitrowej fiolce zawierającej pięć mililitrów zimnego roztworu kolagenazy. W przypadku myszy po urodzeniu od zera do 15 myszy, dokładnie wypreparuj wszystkie płaty trzustki przed umieszczeniem tkanki w kolagenazie.

W przypadku myszy po urodzeniu od 18 do 60 najpierw usuń mieczykowaty i wyprowadź jelito po prawej stronie jamy brzusznej. Popchnij lewy i prawy przyśrodkowy płat wątroby w każdą stronę, aby odsłonić woreczek żółciowy i wspólny przewód żółciowy. I zaciśnij dwunastnicę za pomocą pary małych zacisków naczyniowych w górnej i dolnej pozycji, aby oskrzydlić miejsce, w którym przewód żółciowy wchodzi do dwunastnicy.

Następnie załaduj strzykawkę o pojemności 5 mililitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 30 z zimnym roztworem kolagenazy. I użyj mikroskopu, aby wprowadzić końcówkę igły do pęcherzyka żółciowego. Ostrożnie i płynnie manipuluj igłą przez wspólny przewód żółciowy.

I wciśnij tłok, aby przetoczyć trzustkę od jednego do pięciu mililitrów roztworu kolagenazy w zależności od wielkości myszy. Gdy cały roztwór zostanie ukrwiony, użyj kleszczyków, aby natychmiast przenieść trzustkę do 20-mililitrowej fiolki zawierającej pięć mililitrów świeżego zimnego roztworu kolagenazy. Po zebraniu całej tkanki trzustki umieść fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty, a następnie od trzech do pięciu minut delikatnego wstrząsania.

Następnie przefiltruj strawiony produkt przez nylonowe sitko o średnicy 0,25 milimetra do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. I użyj 20-mililitrowej strzykawki zawierającej lodowaty PBS, aby dokładnie umyć sitko. W dniu po urodzeniu od 18 do 60 trzustki odwirować przefiltrowaną próbkę i ponownie zawiesić tkankę w 30 mililitrach zimnego PBS.

Następnie zdekantować zawiesinę tkanek do sześciocentymetrowego naczynia z czarnym dnem i za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i mikroskopu preparacyjnego wybrać wysepki do przeniesienia do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej niewielką objętość zimnego PBS. W 17,5 dniu zarodkowym po urodzeniu trzustki należy odwirować przefiltrowaną tkankę trzustki i ponownie zawiesić osad w roztworze trypsyny-EDTA na czterominutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji delikatnie spróbuj ocenić osad przez jedną minutę za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie dodaj 0,5-krotność objętości zimnej płodowej surowicy bydlęcej z delikatnym wirowaniem, aby zatrzymać trawienie.

Następnie zebrać trawienie przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu FACS w 5-mililitrowej probówce FACS do sortowania za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku pobierania i lizy pojedynczych komórek, świeżo przygotowany bufor do lizy komórek należy podzielić na osiem probówek do PCR z paskami i przenieść pojedynczą komórkę do każdej z nich. Wirować próbki, aby zlizować komórki w celu uwolnienia RNA, a następnie wirować przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i natychmiast przechowywać na lodzie.

W celu odwrotnej transkrypcji inkubuj lizaty przez trzy minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie jedną minutę na lodzie. Krótko odwirować próbki przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodać 5,7 mikrolitra mieszanki odwrotnej transkrypcji do każdej próbki, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mikrolitrów dla każdej próbki. Po delikatnym wirowaniu i odwirowaniu załaduj próbki do termocyklera i uruchom program odwrotnej transkrypcji.

W przypadku wstępnej amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR dodaj 15 mikrolitrów mieszanki PCR do każdej próbki zawierającej reakcje pierwszej nici, a następnie delikatnie wiruj i odwiruj. Następnie załaduj próbki do termocyklera i uruchom program PCR. W przypadku oczyszczania PCR dodaj 25 mikrolitrów zawieszonych kulek oczyszczających DNA do każdej próbki i dobrze wymieszaj przez wirowanie.

Następnie szybko odwiruj próbki w temperaturze pokojowej, aby zebrać płyn, unikając osiadania kulek. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umieścić próbki na odpowiednim stojaku magnetycznym, ostrożnie usuwając i wyrzucając supernatant, gdy roztwór jest klarowny. Umyj koraliki dwoma 30-sekundowymi płukaniami w 200 mikrolitrach świeżo przygotowanego 80% etanolu na pranie.

I wyrzuć pozostały etanol po drugim praniu. Gdy kulki wyschną na powietrzu, dodaj 11 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby wymyć cel DNA z kulek, a następnie nastąpić wirowanie. Następnie szybko odwiruj próbki, umieść próbki z powrotem na stanowisku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny i przenieś 10 mikrolitrów każdej próbki do nowej probówki PCR.

Pomyślnie amplifikowany cDNA powinien mieć pełną długość powyżej 500 par zasad i być wzbogacony od 1,5 do dwóch kilogramów par zasad. Co więcej, zwykle obserwuje się wzbogacenie cDNA w 500 do 600 par zasad w komórkach insuliny jeden RFP plus , które mogą reprezentować transkrypty insuliny. Jednak fragmenty cDNA w pobliżu 100 par zasad są dimerami starterów, które są zwykle spowodowane nadmiarem starterów i które należy usunąć, powtarzając etap oczyszczania DNA.

Fragmenty cDNA między 100 a 500 parami zasad zwykle reprezentują zdegradowany cDNA, który jest spowodowany złym statusem komórki lub problemami z regionem, takimi jak zanieczyszczenie RNazą i należy go wykluczyć. Po oczyszczeniu bibliotek cDNA do sekwencjonowania, cDNA w zakresie od 250 do 450 par zasad można uzyskać poprzez dodanie kulek oczyszczających DNA do pierwszej i drugiej rundy oczyszczania. Po oczyszczeniu kulek DNA wynik jakości sekwencjonowania powinien być większy niż 30 podczas oceny jakości sekwencjonowania.

Aby uzyskać wysokiej jakości komórki do dalszych analiz, wyklucza się komórki z mniej niż 0,5 miliona zmapowanych odczytów lub z mniej niż 4 000 wykrytych genów, co ułatwia charakterystykę różnych grup komórek i identyfikację genów, które ulegają niejednorodnej ekspresji w różnych grupach po analizie głównych składowych i hierarchicznym grupowaniu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej perfuzji trzustki przed trawieniem kolagenazy, aby uniknąć nadmiernego trawienia wysp trzustkowych i utrzymać środowisko wolne od RNaz podczas zabiegów jednokomórkowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie wysp trzustkowych i hodowla, aby ułatwić wizualizację struktury wysp trzustkowych oraz zbadać odpowiedzi komórkowe i stymulację lekami.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad trzustką do zbadania mechanizmów rozwoju i regeneracji linii wysp trzustkowych, a także progresji cukrzycy u ssaków.