Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy
September 30th, 2018
Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.
Metoda ta może przynieść odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wysp trzustkowych dotyczące różnicowania linii wysp trzustkowych, dojrzewania i regeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pobieranie pojedynczych komórek wysp trzustkowych w celu wygenerowania wysokiej jakości danych sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Zastosowanie tej techniki rozciąga się w kierunku terapii cukrzycy i innych chorób endokrynologicznych trzustki poprzez analizę transkryptomiczną pojedynczych komórek endokrynnych trzustki w stanach patologicznych.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wprowadzenie igły do wąskiego przewodu żółciowego trzustki w celu perfuzji może być trudne. Na dzień embrionalny 17,5 zarodków. Po otwarciu jamy brzusznej za pomocą pęsety łokciowej przenieś tkankę trzewną do sześciocentymetrowego naczynia z czarnym dnem zawierającego zimny PBS.
Użyj kleszczy, aby odłączyć trzustkę od tkanki trzewnej. I umieść tkankę trzustki w 20-mililitrowej fiolce zawierającej pięć mililitrów zimnego roztworu kolagenazy. W przypadku myszy po urodzeniu od zera do 15 myszy, dokładnie wypreparuj wszystkie płaty trzustki przed umieszczeniem tkanki w kolagenazie.
W przypadku myszy po urodzeniu od 18 do 60 najpierw usuń mieczykowaty i wyprowadź jelito po prawej stronie jamy brzusznej. Popchnij lewy i prawy przyśrodkowy płat wątroby w każdą stronę, aby odsłonić woreczek żółciowy i wspólny przewód żółciowy. I zaciśnij dwunastnicę za pomocą pary małych zacisków naczyniowych w górnej i dolnej pozycji, aby oskrzydlić miejsce, w którym przewód żółciowy wchodzi do dwunastnicy.
Następnie załaduj strzykawkę o pojemności 5 mililitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 30 z zimnym roztworem kolagenazy. I użyj mikroskopu, aby wprowadzić końcówkę igły do pęcherzyka żółciowego. Ostrożnie i płynnie manipuluj igłą przez wspólny przewód żółciowy.
I wciśnij tłok, aby przetoczyć trzustkę od jednego do pięciu mililitrów roztworu kolagenazy w zależności od wielkości myszy. Gdy cały roztwór zostanie ukrwiony, użyj kleszczyków, aby natychmiast przenieść trzustkę do 20-mililitrowej fiolki zawierającej pięć mililitrów świeżego zimnego roztworu kolagenazy. Po zebraniu całej tkanki trzustki umieść fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty, a następnie od trzech do pięciu minut delikatnego wstrząsania.
Następnie przefiltruj strawiony produkt przez nylonowe sitko o średnicy 0,25 milimetra do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. I użyj 20-mililitrowej strzykawki zawierającej lodowaty PBS, aby dokładnie umyć sitko. W dniu po urodzeniu od 18 do 60 trzustki odwirować przefiltrowaną próbkę i ponownie zawiesić tkankę w 30 mililitrach zimnego PBS.
Następnie zdekantować zawiesinę tkanek do sześciocentymetrowego naczynia z czarnym dnem i za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i mikroskopu preparacyjnego wybrać wysepki do przeniesienia do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej niewielką objętość zimnego PBS. W 17,5 dniu zarodkowym po urodzeniu trzustki należy odwirować przefiltrowaną tkankę trzustki i ponownie zawiesić osad w roztworze trypsyny-EDTA na czterominutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji delikatnie spróbuj ocenić osad przez jedną minutę za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie dodaj 0,5-krotność objętości zimnej płodowej surowicy bydlęcej z delikatnym wirowaniem, aby zatrzymać trawienie.
Następnie zebrać trawienie przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu FACS w 5-mililitrowej probówce FACS do sortowania za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku pobierania i lizy pojedynczych komórek, świeżo przygotowany bufor do lizy komórek należy podzielić na osiem probówek do PCR z paskami i przenieść pojedynczą komórkę do każdej z nich. Wirować próbki, aby zlizować komórki w celu uwolnienia RNA, a następnie wirować przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i natychmiast przechowywać na lodzie.
W celu odwrotnej transkrypcji inkubuj lizaty przez trzy minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie jedną minutę na lodzie. Krótko odwirować próbki przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodać 5,7 mikrolitra mieszanki odwrotnej transkrypcji do każdej próbki, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mikrolitrów dla każdej próbki. Po delikatnym wirowaniu i odwirowaniu załaduj próbki do termocyklera i uruchom program odwrotnej transkrypcji.
W przypadku wstępnej amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR dodaj 15 mikrolitrów mieszanki PCR do każdej próbki zawierającej reakcje pierwszej nici, a następnie delikatnie wiruj i odwiruj. Następnie załaduj próbki do termocyklera i uruchom program PCR. W przypadku oczyszczania PCR dodaj 25 mikrolitrów zawieszonych kulek oczyszczających DNA do każdej próbki i dobrze wymieszaj przez wirowanie.
Następnie szybko odwiruj próbki w temperaturze pokojowej, aby zebrać płyn, unikając osiadania kulek. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umieścić próbki na odpowiednim stojaku magnetycznym, ostrożnie usuwając i wyrzucając supernatant, gdy roztwór jest klarowny. Umyj koraliki dwoma 30-sekundowymi płukaniami w 200 mikrolitrach świeżo przygotowanego 80% etanolu na pranie.
I wyrzuć pozostały etanol po drugim praniu. Gdy kulki wyschną na powietrzu, dodaj 11 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby wymyć cel DNA z kulek, a następnie nastąpić wirowanie. Następnie szybko odwiruj próbki, umieść próbki z powrotem na stanowisku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny i przenieś 10 mikrolitrów każdej próbki do nowej probówki PCR.
Pomyślnie amplifikowany cDNA powinien mieć pełną długość powyżej 500 par zasad i być wzbogacony od 1,5 do dwóch kilogramów par zasad. Co więcej, zwykle obserwuje się wzbogacenie cDNA w 500 do 600 par zasad w komórkach insuliny jeden RFP plus , które mogą reprezentować transkrypty insuliny. Jednak fragmenty cDNA w pobliżu 100 par zasad są dimerami starterów, które są zwykle spowodowane nadmiarem starterów i które należy usunąć, powtarzając etap oczyszczania DNA.
Fragmenty cDNA między 100 a 500 parami zasad zwykle reprezentują zdegradowany cDNA, który jest spowodowany złym statusem komórki lub problemami z regionem, takimi jak zanieczyszczenie RNazą i należy go wykluczyć. Po oczyszczeniu bibliotek cDNA do sekwencjonowania, cDNA w zakresie od 250 do 450 par zasad można uzyskać poprzez dodanie kulek oczyszczających DNA do pierwszej i drugiej rundy oczyszczania. Po oczyszczeniu kulek DNA wynik jakości sekwencjonowania powinien być większy niż 30 podczas oceny jakości sekwencjonowania.
Aby uzyskać wysokiej jakości komórki do dalszych analiz, wyklucza się komórki z mniej niż 0,5 miliona zmapowanych odczytów lub z mniej niż 4 000 wykrytych genów, co ułatwia charakterystykę różnych grup komórek i identyfikację genów, które ulegają niejednorodnej ekspresji w różnych grupach po analizie głównych składowych i hierarchicznym grupowaniu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej perfuzji trzustki przed trawieniem kolagenazy, aby uniknąć nadmiernego trawienia wysp trzustkowych i utrzymać środowisko wolne od RNaz podczas zabiegów jednokomórkowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie wysp trzustkowych i hodowla, aby ułatwić wizualizację struktury wysp trzustkowych oraz zbadać odpowiedzi komórkowe i stymulację lekami.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad trzustką do zbadania mechanizmów rozwoju i regeneracji linii wysp trzustkowych, a także progresji cukrzycy u ssaków.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę izolowania komórek endokrynalnych z różnych etapów rozwoju trzustki, poprzedzonych sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek. Ta technika umożliwia szczegółową analizę rozwoju linii komórek endokrynalnych trzustki i heterogenności komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Endokrynologia
Tło
- Zrozumienie różnicowania linii wysp trzustkowych jest kluczowe dla badań nad cukrzycą.
- Sekwencjonowane RNA pojedynczych komórek dostarcza wysokiej jakości danych transkryptomowych.
- Metoda pozwala na badanie dojrzewania i regeneracji komórek.
- Wizualne wytyczne są ważne dla technicznych aspektów procedury.
Cel badania
- Analiza rozwoju i heterogenności komórek endokrynalnych trzustki.
- Badanie procesów regeneracji w wyspach trzustkowych.
- Poprawa rozumienia cukrzycy i pokrewnych chorób poprzez analizę transkryptomu.
Stosowane metody
- Izolowanie komórek endokrynalnych trzustki z trzustek embrionalnych, noworodkowych i pooperacyjnych.
- Sekwencjonowane RNA pojedynczych komórek dla analizy transkryptomowej.
- Wizualna demonstracja metody dla jasności.
- Użycie kleszczy łokciowych i zimnego PBS podczas procedury.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie izoluje pojedyncze komórki wysp trzustkowych.
- Generowanie wysokiej jakości danych sekwencji RNA.
- Wgląd w różnicowanie i dojrzewanie linii wysp trzustkowych jest dostarczany.
- Omówione są potencjalne zastosowania w terapii cukrzycy.
Wnioski
- Ta technika jest cennym narzędziem do badania komórek endokrynalnych trzustki.
- Oferuje ścieżkę do lepszego zrozumienia i leczenia chorób związanych z endokrynologią trzustki.
- Dalsze badania mogą opierać się na znajdowane, aby zbadać opcje terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of pancreatic endocrine cells enables mechanistic de-risking in diabetes target validation by resolving cellular heterogeneity and lineage trajectories. This approach supports predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to functional states of insulin-producing β cells across developmental stages. The method provides a disease-relevant system for assessing target engagement and transcriptional responses in preclinical models of metabolic disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping endocrine progenitor differentiation and β cell maturation pathways.
- Operational Value: Provides quantitative single-cell resolution for de-risking targets involved in islet lineage specification and regeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality transcriptomic datasets for biomarker discovery and assay standardization in endocrine cell populations.
- Operational Value: Supports scalable isolation workflows for preparing validated cellular inputs in downstream screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by comparing transcriptional states across embryonic, neonatal, and postnatal pancreatic contexts.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cell state transitions to inform risk-adjusted advancement in preclinical diabetes models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing transcriptional readouts that inform target validation and lead identification in metabolic disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in endocrine lineage development and β cell functional maturation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative single-cell outputs for assay readiness and compound effect profiling in islet-derived systems.
- Analytics: Enables principal component analysis and hierarchical clustering to identify heterogeneously expressed genes and define cell states.
- Translational Research: Connects developmental transcriptional signatures to postnatal maturation and regeneration processes relevant to disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for endocrine cell profiling applicable across multiple disease stages and genetic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of β cell identity and function targets.
- Operational Value: Standardized isolation and sequencing workflow ensuring reproducibility across developmental timepoints.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology and cellular response predictions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on transcriptional evidence in disease-relevant endocrine cell contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic perfusion, and single-cell handling under RNase-free conditions.
- Dependent on access to perfusion instrumentation, flow cytometry, and thermocycling platforms for library preparation.
- Necessitates cross-team standardization of digestion timing, staining protocols, and QC thresholds for cell viability and RNA integrity.
- Adaptation across model systems requires optimization of collagenase concentration and perfusion volume based on pancreatic size and developmental stage.
- Practical limitations include tissue yield variability and the need for rapid perfusion to prevent over-digestion, as noted in the procedural guidance.
