Name: Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj szybką ręczną ekstrakcję kwasów nukleinowych z pełnej krwi do wykrywania wirusów przy łóżku pacjenta. Ta metoda nie wymaga sprzętu laboratoryjnego ani prądu, co umożliwia diagnostykę w warunkach polowych i szpitalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Susanne Lopes Rasmussen i Solvej Kolbjørn Jensen za ich pomoc techniczną i obsługę próbek klinicznych. Projekt ten jest częścią konsorcjum EbolaMoDRAD, które otrzymało dofinansowanie ze Wspólnego Przedsięwzięcia na rzecz Inicjatywy 2 w zakresie Innowacyjnej Medycyny na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 115843. Wspólne przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" oraz EFPIA.

Komitet ds. Etyki Badań Biomedycznych, Region Stołeczny wyraził świadomą zgodę, a wszystkie opisane tutaj metody zostały wyłączone z oceny przez system komisji etyki, zgodnie z duńską ustawą o projektach rozwoju testów.
1. Przygotowanie probówek próżniowych do pobierania krwi do inaktywacji wirusa i szybkiej ekstrakcji NA
UWAGA: Bufor używany do tego protokołu zawiera tiocyjanian guanidyny (GITC) i niejonowy środek powierzchniowo czynny, które są drażniące. Podejmij odpowiednie laboratoryjne środki bezpieczeństwa, używaj kaptura przepływowego i noś rękawice podczas obchodzenia się z nim. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. W przypadku rozlania buforu, zanieczyszczonej powierzchni nigdy nie wolno dezynfekować bezpośrednio chloraminą lub podchlorynem sodu (aktywnymi składnikami "wybielacza"), ponieważ mieszanina ta może prowadzić do powstania toksycznego cyjanku. Najpierw wytrzyj rozlany bufor tkanką chłonną. Następnie oczyść powierzchnię 70% etanolem, a następnie wodą, a na koniec użyj chloraminy lub podchlorynu sodu.
<ol>
	<li>Aby przygotować probówki próżniowe do pobierania krwi, wstrzyknąć 1,6 ml specyficznego komercyjnego buforu do lizy do probówki próżniowej EDTA o pojemności 4 ml, nakłuwając wieczko probówki za pomocą igły 25 G x 1 i strzykawki 3 ml. 
	UWAGA: Nie zdejmuj pokrywy rury próżniowej. Próżnia musi być utrzymywana.</li>
	<li>Lampy próżniowe zawierające bufor należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia. 
	UWAGA: Probówki są stabilne przez co najmniej 1 rok po ich przygotowaniu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do ekstrakcji NA
<ol>
	<li>Aby przygotować do ekstrakcji NA, umieść dwie probówki o pojemności 1.8 ml, dwie 4.5 ml i jedną 3.6 ml w stojaku.</li>
	<li>Przez pipetowanie dodać 960 μl cząstek szkła magnetycznego (MGP) do czystej probówki o pojemności 1,8 ml i oznaczyć ją MGP. Przed pipetowaniem zawiesinę MGP należy całkowicie zawiesić. 
	UWAGA: MGP mają tendencję do szybkiego gromadzenia się na dnie tuby.</li>
	<li>Dodaj, pipetując, 4 ml buforu do przemywania I do czystej probówki o pojemności 4,5 ml i oznacz ją jako WB-1, 
	UWAGA: Bufor do płukania I zawiera chlorek guanidyny, który działa drażniąco. Podejmij odpowiednie laboratoryjne środki bezpieczeństwa, używaj kaptura przepływowego i noś rękawice podczas obchodzenia się z nim. Unikać kontaktu ze skórą i oczami.</li>
	<li>Dodać pipetując 1,5 ml buforu do przemywania II do czystej probówki o pojemności 3,6 ml i oznaczyć ją jako WB-2.</li>
	<li>Dodać, pipetując, 3 ml buforu do przemywania III do czystej probówki o pojemności 4,5 ml i oznaczyć ją jako WB-3.</li>
	<li>Dodać pipetując 100 μl buforu elucyjnego do czystej probówki o pojemności 1,8 ml i oznaczyć ją jako EB.</li>
	<li>Przechowywać poddane w temperaturze pokojowej do czasu użycia. 
	UWAGA: Probówki są stabilne przez co najmniej 1 miesiąc po ich przygotowaniu.</li>
</ol>
3. Pobieranie krwi od pacjentów z oznakami i objawami infekcji wirusowej
UWAGA: Podejmij odpowiednie laboratoryjne środki bezpieczeństwa podczas pobierania pełnej krwi od pacjenta. Nosić rękawiczki i okulary. Jeśli pacjent przebywa w izolacji, należy postępować zgodnie z procedurami 4 poziomu bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Aby pobrać dożylnie krew pełną od pacjenta, należy użyć igły motylkowej z rurką przedłużającą o małym otworze i rurki próżniowej do pobierania krwi zawierającej bufor do lizy/wiązania. Oprzyj rękę pacjenta w pozycji skierowanej w dół i umieść rurkę pobierającą niżej niż igła motylkowa. Włóż igłę motylkową do żyły pacjenta i przymocuj rurkę próżniową do pobierania krwi do przedłużki o małym otworze. 
	UWAGA: Zapobiegnie to przepływowi zwrotnemu.</li>
	<li>Po pobraniu krwi wymieszaj zawartość probówki, obracając probówkę 5 - 10 razy. 
	UWAGA: Ze względu na pozostałą próżnię w probówce do pobierania krwi zawierającej 1,6 ml buforu do lizy/wiązania, objętość pobranej próbki automatycznie wyniesie 1,6 ml.</li>
	<li>Zdezynfekuj zewnętrzną część rurki za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Inkubować probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać protokół, a pełne probówki do pobierania krwi można przechowywać w temperaturze -20 °C, 5 °C, 25 °C lub 37 °C przez co najmniej 1 miesiąc7.</li>
	<li>Przejdź bezpośrednio do uproszczonej metody ekstrakcji NA.</li>
</ol>
4. Uproszczona ekstrakcja NA krwi pełnej
<ol>
	<li>Aby oczyścić NA z krwi zebranej inaktywowanej buforem do lizy/wiązania, wymieszaj zawartość probówki, obracając rurkę próżniową ręcznie 5 - 10 razy.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij pokrywę rurki i opróżnij pokrywę.</li>
	<li>Wlać przygotowaną porcję MGP (1 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.</li>
	<li>Umieścić nową pokrywkę z nieużywanej probówki do pobierania krwi na probówce zawierającej próbkę.</li>
	<li>Umieść palec na wieczku, aby upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta i wymieszaj zawartość probówki, obracając probówkę do pobierania krwi ręcznie 5 - 10 razy.</li>
	<li>Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym i przytrzymaj palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.</li>
	<li>Odwróć kilka razy ręcznie uchwyt magnetyczny z rurką, aby upewnić się, że wszystkie MGP są zebrane z boku rurki z magnesem. 
	UWAGA: Uchwyt magnetyczny można zastąpić wydłużonym magnesem i gumową opaską.</li>
	<li>Zdjąć pokrywkę probówki i wyrzucić zawartość probówki za pomocą jednorazowej pipety lub po prostu wsypując zawartość do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Unikaj aerozoli z probówki zbiorczej o pojemności 50 ml, zamykając probówkę pokrywką.</li>
	<li>Wlać przygotowaną porcję WB-1 (4 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na tubie i połóż palec na pokrywce, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z uchwytu magnetycznego, trzymając pokrywę mocno dokręconą palcem. 
	UWAGA: Jeśli używasz magnesu i gumki, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.</li>
	<li>Ponownie zawiesić MGP, obracając probówkę do pobierania krwi ręcznie 5 - 10 razy.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.6 - 4.8.</li>
	<li>Wlać przygotowaną porcję WB-2 (1,5 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na tubie i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego. 
	UWAGA: Jeśli używasz magnesu i gumki, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.</li>
	<li>Umieść palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.</li>
	<li>Ponownie zawieś MGP, ręcznie obracając probówkę do pobierania krwi na kilka sekund.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.6 - 4.8.</li>
	<li>Wlać przygotowaną porcję WB-3 (3 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na tubie i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego. 
	UWAGA: Jeśli używasz magnesu i gumki, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.</li>
	<li>Umieść palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.</li>
	<li>Ponownie zawiesić MGP, obracając probówkę do pobierania krwi ręcznie 5 - 10 razy.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.6 - 4.8.</li>
	<li>Wlać przygotowaną porcję EB (100 μl) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na tubie i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego. 
	UWAGA: Jeśli używasz magnesu i gumki, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.</li>
	<li>Zawiesić MGP w EB, stukając palcem w probówkę do pobierania krwi 5 - 10 razy. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać protokół, a probówki można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przenieść jedną kroplę (5 - 8 μl) zawieszonych MGP do dalszej mieszaniny reakcyjnej amplifikacji NA za pomocą jednorazowej pipety o pojemności 1,5 ml (można zastosować dowolny dalszy diagnostyczny test amplifikacji NA, taki jak test LAMP/RT-LAMP lub qPCR/RT-qPCR). 
	UWAGA: Na będą trzymać się MGP, więc upewnij się, że używasz MGP w dalszej reakcji amplifikacji NA. Przed użyciem wymieszać zawiesinę MGP. Po wymieszaniu MGP zbiorą się na dnie probówki.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li>
<li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li>
<li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li>
<li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li>
<li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable%2C+Pressure+Driven%2C+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li>
<li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li>
<li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li>
<li>Schmitz, H., Köhler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li>
<li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li>
<li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li>
<li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li>
<li>Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+microfluidic%2C+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li>
<li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+%28v2.5%29+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li>
<li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone%3A+A+Field+Evaluation+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980(2016).</li>
<li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Instructions+for+Use%3A+Idylla+TM+Ebola+Virus+Triage+Test%22">Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf">https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf</a> (2016).</li>
<li>MPLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+Nucleic+Acid+Isolation+Kit.+Safety+data+sheet+version+1.7%22">Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001">https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001</a> (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym raporcie opisujemy bezpieczną, szybką i prostą metodę ręcznej ekstrakcji NA przy łóżku pacjenta do dalszego molekularnego wykrywania wirusa w pełnej krwi inaktywowanej przez lizę/bufor wiążący. Opisana metoda ekstrakcji NA została opracowana do wykonywania bezpośrednio na próbkach krwi pełnej pobranych w probówkach próżniowych do pobierania krwi zawierających bufor do lizy/wiązania (tabela materiałów)7. Ten specyficzny bufor dezaktywuje EBOV7 i jest k...

W sytuacjach wybuchu epidemii wirusa, gdy pacjenci są zamknięci w szpitalnych izolatkach lub gdy potrzebna jest szybka diagnoza, bezpieczna, prosta i dokładna diagnoza molekularna w miejscu opieki nad pacjentem jest niezbędna do opieki nad pacjentem i ograniczenia ryzyka. Dwa niedawne wybuchy wirusa, wirusa Ebola (EBOV) w Afryce Zachodniej (2013) i wirusa Zika w Ameryce Południowej (2015), zwiększyły zainteresowanie ulepszonymi molekularnymi testami diagnostycznymi w miejscu opieki nad pacjentem, takimi jak amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP)1,2 i amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA)3,4. Zarówno RT-LAMP, jak i RPA są szybkimi, czułymi i specyficznymi testami molekularnymi, które można wykonywać na uproszczonych preparatach próbek. W przypadku wirusa Zika RT-LAMP połączono z testem przepływu bocznego (LFA), który może wykryć wirusa Zika w nieoczyszczonych próbkach krwi pełnej w ciągu 30 min1; jednak w przypadku EBOV, który jest klasyfikowany jako patogen grupy ryzyka 4 i jest wysoce zaraźliwy, próbki muszą być traktowane w warunkach 4 poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-4) i inaktywowane, zanim będzie można przeprowadzić jakiekolwiek bezpieczne procedury diagnostyczne.
Uproszczone metody inaktywacji dla EBOV, takie jak dodawanie do lizy do próbki2,3,4,5, były używane podczas wybuchu epidemii; jednak metody te wymagają co najmniej obsługi w warunkach BSL-4 za pomocą sprzętu laboratoryjnego, takiego jak komory bezpieczeństwa biologicznego BSL-3, wirówki, bloki grzewcze i pipety. Sprzęt ten zwykle nie jest obecny na oddziałach izolacyjnych ani w szpitalach polowych. Aby sprostać temu wyzwaniu, podjęto próby przeprowadzenia diagnostyki w suitcases3, a także opracowano kilka przenośnych urządzeń i maszyn [np. przenośne urządzenie do ekstrakcji kwasów nukleinowych (NA)]6. Jednak próbki z dodatnim wynikiem EBOV nadal muszą zostać dezaktywowane, zanim będzie można użyć tych urządzeń.
Wcześniej informowaliśmy o metodzie szybkiej inaktywacji wirusa przy łóżku pacjenta dla klasy EBOV<sup="xref">7, wirusa krowianki i wirusa ospy krowiej8 poprzez dodanie komercyjnego buforu do lizy/wiązania do zwykłych probówek do pobierania krwi próżniowej, co pozwala na bezpośredni transfer krwi od pacjenta do buforu inaktywacyjnego7. Ta bezpośrednia i natychmiastowa inaktywacja w systemie zamkniętym eliminuje potrzebę obchodzenia się z próbkami przy użyciu dowolnych rygorystycznych zabezpieczeń, takich jak warunki BSL-47, a próbki mogą być obsługiwane w normalnych warunkach BSL-2. Ta metoda inaktywacji jest kompatybilna z kilkoma systemami ekstrakcji NA, takimi jak roboty i zestawy do oczyszczania rąk7; Metody te wymagają jednak sprzętu laboratoryjnego, takiego jak roboty, wirówki i energia elektryczna, które nie zawsze są obecne w warunkach polowych lub na szpitalnych oddziałach izolacyjnych.
W tym raporcie opisujemy bezpieczną, szybką i uproszczoną metodę ręcznej ekstrakcji NA do późniejszego molekularnego wykrywania wirusa w lizie/wiązaniu buforu inaktywowanego przez pełną krew. Metoda ekstrakcji NA nie wymaga żadnego sprzętu poza magnesem/uchwytem magnetycznym. Do ekstrakcji NA nie są potrzebne wirówki, bloki grzewcze ani energia elektryczna. W związku z tym metoda ta nie jest zależna od zaplecza laboratoryjnego i może być z łatwością stosowana w dowolnym miejscu (np. w szpitalach polowych, na szpitalnych oddziałach izolacyjnych lub w warunkach o niskich zasobach). Metoda ekstrakcji NA jest szybka i prosta i może być stosowana bezpośrednio w dowolnych dalszych testach NA, takich jak qPCR, RT-qPCR, LAMP lub RT-LAMP. Gdy ta metoda ekstrakcji NA jest połączona z LAMP i przenośnym przyrządem izotermicznym zasilanym bateryjnie, diagnozę przy łóżku pacjenta można uzyskać w ciągu 40 minut od pobrania krwi.

<table><tbody><tr><td>Probówki Vacutainer K2 EDTA (4 ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Pobieranie krwi</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 igła</td> Strzykawka <td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK (3 mL)</td><td>Igła Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly z rurką przedłużającą o małym otworze</td><td>J&oslash; rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Bufor do lizy/wiązania - Wkład</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji całkowitych kwasów nukleinowych MagNA Pure LC</td> Roche <td>Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Probówki kriogeniczne do biobankowania i hodowli komórkowych (1,8 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Probówki kriogeniczne do biobankowania i hodowli komórkowych (3,6 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Biobankowanie i hodowle komórkowe Probówki kriogeniczne (4,5 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa (3,5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Samco&handel; Pipety transferowe z cienką końcówką (1,5 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Nunc&handel; 50 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Szybka diagnoza infekcji jest niezbędna do opanowania epidemii, ograniczenia ryzyka i opieki nad pacjentem. Wcześniej pokazaliśmy metodę szybkiej inaktywacji wirusa Ebola przy łóżku pacjenta podczas pobierania próbek krwi w celu przeprowadzenia bezpiecznych testów kwasów nukleinowych (NA) poprzez dodanie komercyjnego buforu do lizy/wiązania bezpośrednio do probówek próżniowych do pobierania krwi. Korzystając z tego podejścia do inaktywacji przyłóżkowej, opracowaliśmy bezpieczną, szybką i uproszczoną metodę ekstrakcji NA przy łóżku pacjenta w celu późniejszego wykrywania wirusa w krwi pełnej inaktywowanej buforem. Ekstrakcja NA jest wykonywana bezpośrednio w probówkach do pobierania krwi i nie wymaga żadnego sprzętu ani prądu. 
Po zebraniu krwi do buforu do lizy/wiązania, zawartość jest mieszana przez ręczne obracanie probówki, a mieszanina jest inkubowana przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Cząsteczki szkła magnetycznego (MGP) są dodawane do probówki, a zawartość miesza się, ręcznie obracając probówkę zbiorczą. MGP są następnie pobierane z boku probówki do pobierania krwi za pomocą uchwytu magnetycznego lub magnesu i gumki. MGP są trzykrotnie przemywane, a po dodaniu buforu elucyjnego bezpośrednio do probówki zbiorczej, NA są gotowe do testów NA, takich jak qPCR lub amplifikacja w pętli izotermicznej (LAMP), bez usuwania MGP z reakcji. Metoda ekstrakcji NA nie jest zależna od żadnego zaplecza laboratoryjnego i może być łatwo stosowana w dowolnym miejscu (np. w szpitalach polowych i izolatkach szpitalnych). Gdy ta metoda ekstrakcji NA jest połączona z LAMP i przenośnym instrumentem, diagnozę można uzyskać w ciągu 40 minut od pobrania krwi.

Przedstawiony tutaj protokół jest prosty i wydajny i może być szeroko stosowany w dowolnym badaniu molekularnym wykonywanym na zakaźnych próbkach krwi pełnej inaktywowanych buforem lizującym/wiążącym. Schemat inaktywacji krwi i ekstrakcji kwasów nukleinowych (NA) przedstawiono na Rysunku 1, obejmując przygotowanie próżniowych probówek do pobierania krwi7 (Rysunek 1A), pobranie krwi7...

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej ekstrakcji kwasu nukleinowego wirusa z inaktywowanej wirusem krwi pełnej. Ekstrakcja odbywa się bezpośrednio w probówkach do pobierania krwi i nie wymaga żadnego sprzętu ani energii elektrycznej. Metoda nie jest zależna od zaplecza laboratoryjnego i może być stosowana wszędzie (np. w szpitalach polowych).

Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Metoda ta może być pomocna podczas wykonywania diagnostyki przyłóżkowej pacjentów z objawami infekcji wirusowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać bez sprzętu laboratoryjnego i prądu, a co za tym idzie można ją wykonać na oddziale szpitalnym. Procedurę pobierania krwi zademonstrują doktor medycyny Anders Fomsgaard i naukowiec Morten Rasmussen, obaj z mojego laboratorium.Zacznij od przygotowania probówek do pobierania krwi. Użyj jednocalowej igły o rozmiarze 25 dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml, aby wstrzyknąć 1,6 ml komercyjnego buforu do lizy do rurki próżniowej EDTA o pojemności 4 ml. Bardzo ważne jest utrzymanie podciśnienia w probówce do pobierania krwi w celu pobrania krwi.Dlatego zawsze używaj igły do wstrzykiwania buforu do lizy do probówki do pobierania krwi. Następnie całkowicie ponownie zawiesić 960-litrową objętość cząstek szkła magnetycznego lub MGP i przenieść do oznaczonej probówki o pojemności 1,8 ml. Następnie odpipetuj 4 ml buforu do płukania jeden do 4,5 ml probówki oznaczonej WB-1,1,5 ml buforu do płukania dwa do 3,6 ml probówki oznaczonej WB-2, a 3 ml buforu płuczącego trzy do 4,5 ml probówki oznaczonej WB-3.Na koniec dodaj 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do 1,8 ml probówki oznaczonej EB i pozostaw probówki w temperaturze pokojowej do użycia. Do dożylnego pobrania krwi pełnej od pacjenta należy użyć igły motylkowej z rurką przedłużającą o małym otworze oraz jednej z wcześniej przygotowanych probówek próżniowych do pobierania krwi zawierających bufor do lizy. Oprzyj rękę pacjenta w pozycji skierowanej w dół.Włóż igłę motylkową do żyły pacjenta i przymocuj rurkę próżniową do pobierania krwi do małego przedłużenia. Po pobraniu krwi wymieszaj zawartość probówki, obracając probówkę od pięciu do dziesięciu razy. Zdezynfekuj zewnętrzną część rurki za pomocą 70% etanolu.Następnie inkubować probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu inaktywacji wirusa. Aby oczyścić kwasy nukleinowe z pobranej krwi, ponownie wymieszaj zawartość probówki, obracając rurkę próżniową ręcznie od pięciu do dziesięciu razy. Wlać przygotowaną porcję MGP bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.Umieść nową pokrywkę z nieużywanej probówki do pobierania krwi na probówce zawierającej próbkę. Umieść palec na pokrywce, aby upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta, i wymieszaj zawartość probówki, obracając ją od pięciu do dziesięciu razy. Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym i trzymaj palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.Następnie kilkakrotnie obróć uchwyt magnetyczny z rurką, aby rozproszyć MGP, zanim zgromadzą się z boku rurki z magnesem. Zdejmij pokrywkę probówki i wyrzuć zawartość probówki do probówki o pojemności 50 ml za pomocą jednorazowej pipety. Wlać przygotowaną porcję WB-1 bezpośrednio do probówki do pobierania krwi i zamknąć pokrywkę probówki.Wymieszaj zawartość ręcznie od pięciu do dziesięciu razy. Następnie zbierz kulki z boku rurki za pomocą magnesu i usuń płyn jak poprzednio. Ponownie zawiesić kulki w przygotowanej podwielokrotności WB-2, następnie wyrzucić roztwór i powtórzyć procedurę z przygotowaną podwielokrotnością WB-3.Na koniec wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego i wlej przygotowaną porcję EB bezpośrednio do probówki do pobierania krwi. Umieść pokrywkę na tubie i ponownie zawieś MGP, stukając palcem od pięciu do dziesięciu razy. Na koniec użyj jednorazowej pipety o pojemności 1,5 ml, aby przenieść jedną kroplę ponownie zawieszonych MGP do dalszej mieszaniny reakcyjnej amplifikacji kwasów nukleinowych.Należy pamiętać o całkowitym ponownym zawieszeniu MGP przed przeniesieniem tylko jednej kropli do reakcji PCR. Aby zademonstrować słuszność koncepcji, ujemna krew pełna została wzbogacona 10-krotnymi rozcieńczeniami wzorca wirusa Ebola, przygotowanego z niedawnego wybuchu epidemii w południowej Gwinei, lub trzema różnymi stężeniami wirusa Epsteina-Barra. Wyekstrahowane kwasy nukleinowe analizowano za pomocą wewnętrznego specyficznego dla wirusa R2 qPCR lub qPCR.Im niższy próg przejścia, czyli CT, tym wyższa liczba kopii genomu wirusa. W tym przypadku krew pełna wzbogacona o różne stężenia wirusa Ebola została wykryta przez lampę specyficzną dla wirusa Ebola. Końcowe stężenie wirusa w wzbogaconej próbce krwi pełnej jest widoczne na osi X, a minuty do dodatniego wyniku są widoczne na osi Y.W tym przypadku krew pełną wzbogacono 10-krotnymi rozcieńczeniami standaryzowanej próbki surowicy wirusowego zapalenia wątroby typu C WHO, z wykrywaniem za pomocą RT qPCR specyficznego dla HCV. Wreszcie, ten obraz przedstawia wyniki reakcji lampowej specyficznej dla wirusa Epsteina-Barra, na krwi pełnej z dodatnim wynikiem wirusa Epsteina-Barra. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby użyć określonego buforu wiążącego lizę.Jest to kluczowy krok i kluczowy czynnik dla metody. Ten bufor wiążący lizę dezaktywuje wirusa w próbce. Stosując tę technikę, można wykonać różne metody wykrywania molekularnego, takie jak lampa i PCR, a tym samym przeprowadzić diagnostykę różnicową.

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowano zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do wzbogacania krążących komórek z jądrem z krwi obwodowej poprzez lizę erytrocytów, co zapewnia izolację wysokiej jakości próbki bez utraty komórek.

Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Ten film demonstruje technikę ekstrakcji kwasów nukleinowych z pełnej ludzkiej krwi za pomocą cząstek szkła magnetycznego (MGP) — małych kulek magnetycznych pokrytych krzemionką. Po lizie komórek krwi za pomocą buforu do lizy, uwolnione kwasy nukleinowe wiążą się z powierzchnią MGP pokrytych krzemionką, ekstrahując cząsteczki z próbki.

Technika ekstrakcji kwasów nukleinowych z krwi za pośrednictwem cząstek szkła magnetycznego

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety.  W związku z tym format przygotowania próbki jest kompatybilny z większością przyrządów do obsługi cieczy i może być używany do wielu zastosowań klinicznych o średniej i wysokiej przepustowości oraz typów próbek.

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

Testy oporności na leki dla osób zakażonych wirusem HIV-1, u których nie powiodła się terapia antyretrowirusowa (ART), mogą ukierunkować przyszłe terapie i poprawić wyniki leczenia. Optymalizacja indywidualnych i populacyjnych wyników zdrowotnych w warunkach wysokiego rozpowszechnienia HIV, ale ograniczonych zasobów, będzie ostatecznie wymagała przystępnych cenowo i dostępnych metod genotypowania i interpretacji oporności na leki.

Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Przedstawiamy metodologię przetwarzania krwi pełnej w celu uzyskania różnych składników do dalszej analizy. Zoptymalizowaliśmy uproszczony protokół, który umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych.

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Poznaj szybką ręczną ekstrakcję kwasów nukleinowych z pełnej krwi do wykrywania wirusów przy łóżku pacjenta. Ta metoda nie wymaga sprzętu laboratoryjnego ani prądu, co umożliwia diagnostykę w warunkach polowych i szpitalnych.

Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal

Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów