Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej

Metoda ta może być pomocna podczas wykonywania diagnostyki przyłóżkowej pacjentów z objawami infekcji wirusowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać bez sprzętu laboratoryjnego i prądu, a co za tym idzie można ją wykonać na oddziale szpitalnym. Procedurę pobierania krwi zademonstrują doktor medycyny Anders Fomsgaard i naukowiec Morten Rasmussen, obaj z mojego laboratorium.

Zacznij od przygotowania probówek do pobierania krwi. Użyj jednocalowej igły o rozmiarze 25 dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml, aby wstrzyknąć 1,6 ml komercyjnego buforu do lizy do rurki próżniowej EDTA o pojemności 4 ml. Bardzo ważne jest utrzymanie podciśnienia w probówce do pobierania krwi w celu pobrania krwi.

Dlatego zawsze używaj igły do wstrzykiwania buforu do lizy do probówki do pobierania krwi. Następnie całkowicie ponownie zawiesić 960-litrową objętość cząstek szkła magnetycznego lub MGP i przenieść do oznaczonej probówki o pojemności 1,8 ml. Następnie odpipetuj 4 ml buforu do płukania jeden do 4,5 ml probówki oznaczonej WB-1,1,5 ml buforu do płukania dwa do 3,6 ml probówki oznaczonej WB-2, a 3 ml buforu płuczącego trzy do 4,5 ml probówki oznaczonej WB-3.

Na koniec dodaj 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do 1,8 ml probówki oznaczonej EB i pozostaw probówki w temperaturze pokojowej do użycia. Do dożylnego pobrania krwi pełnej od pacjenta należy użyć igły motylkowej z rurką przedłużającą o małym otworze oraz jednej z wcześniej przygotowanych probówek próżniowych do pobierania krwi zawierających bufor do lizy. Oprzyj rękę pacjenta w pozycji skierowanej w dół.

Włóż igłę motylkową do żyły pacjenta i przymocuj rurkę próżniową do pobierania krwi do małego przedłużenia. Po pobraniu krwi wymieszaj zawartość probówki, obracając probówkę od pięciu do dziesięciu razy. Zdezynfekuj zewnętrzną część rurki za pomocą 70% etanolu.

Następnie inkubować probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu inaktywacji wirusa. Aby oczyścić kwasy nukleinowe z pobranej krwi, ponownie wymieszaj zawartość probówki, obracając rurkę próżniową ręcznie od pięciu do dziesięciu razy. Wlać przygotowaną porcję MGP bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.

Umieść nową pokrywkę z nieużywanej probówki do pobierania krwi na probówce zawierającej próbkę. Umieść palec na pokrywce, aby upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta, i wymieszaj zawartość probówki, obracając ją od pięciu do dziesięciu razy. Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym i trzymaj palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.

Następnie kilkakrotnie obróć uchwyt magnetyczny z rurką, aby rozproszyć MGP, zanim zgromadzą się z boku rurki z magnesem. Zdejmij pokrywkę probówki i wyrzuć zawartość probówki do probówki o pojemności 50 ml za pomocą jednorazowej pipety. Wlać przygotowaną porcję WB-1 bezpośrednio do probówki do pobierania krwi i zamknąć pokrywkę probówki.

Wymieszaj zawartość ręcznie od pięciu do dziesięciu razy. Następnie zbierz kulki z boku rurki za pomocą magnesu i usuń płyn jak poprzednio. Ponownie zawiesić kulki w przygotowanej podwielokrotności WB-2, następnie wyrzucić roztwór i powtórzyć procedurę z przygotowaną podwielokrotnością WB-3.

Na koniec wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego i wlej przygotowaną porcję EB bezpośrednio do probówki do pobierania krwi. Umieść pokrywkę na tubie i ponownie zawieś MGP, stukając palcem od pięciu do dziesięciu razy. Na koniec użyj jednorazowej pipety o pojemności 1,5 ml, aby przenieść jedną kroplę ponownie zawieszonych MGP do dalszej mieszaniny reakcyjnej amplifikacji kwasów nukleinowych.

Należy pamiętać o całkowitym ponownym zawieszeniu MGP przed przeniesieniem tylko jednej kropli do reakcji PCR. Aby zademonstrować słuszność koncepcji, ujemna krew pełna została wzbogacona 10-krotnymi rozcieńczeniami wzorca wirusa Ebola, przygotowanego z niedawnego wybuchu epidemii w południowej Gwinei, lub trzema różnymi stężeniami wirusa Epsteina-Barra. Wyekstrahowane kwasy nukleinowe analizowano za pomocą wewnętrznego specyficznego dla wirusa R2 qPCR lub qPCR.

Im niższy próg przejścia, czyli CT, tym wyższa liczba kopii genomu wirusa. W tym przypadku krew pełna wzbogacona o różne stężenia wirusa Ebola została wykryta przez lampę specyficzną dla wirusa Ebola. Końcowe stężenie wirusa w wzbogaconej próbce krwi pełnej jest widoczne na osi X, a minuty do dodatniego wyniku są widoczne na osi Y.

W tym przypadku krew pełną wzbogacono 10-krotnymi rozcieńczeniami standaryzowanej próbki surowicy wirusowego zapalenia wątroby typu C WHO, z wykrywaniem za pomocą RT qPCR specyficznego dla HCV. Wreszcie, ten obraz przedstawia wyniki reakcji lampowej specyficznej dla wirusa Epsteina-Barra, na krwi pełnej z dodatnim wynikiem wirusa Epsteina-Barra. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby użyć określonego buforu wiążącego lizę.

Jest to kluczowy krok i kluczowy czynnik dla metody. Ten bufor wiążący lizę dezaktywuje wirusa w próbce. Stosując tę technikę, można wykonać różne metody wykrywania molekularnego, takie jak lampa i PCR, a tym samym przeprowadzić diagnostykę różnicową.