Name: Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj elektronikę siatkową do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłej w mózgu gryzoni. Ta metoda umożliwia długoterminowe rejestracje na poziomie pojedynczych neuronów bez przewlekłej odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.M.L. dziękuje za wsparcie tej pracy przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych (FA9550-14-1-0136), nagrodę Akceleratora Nauk Fizycznych i Inżynierii Uniwersytetu Harvarda oraz Nagrodę Pioniera Dyrektora National Institutes of Health (1DP1EB025835-01). T.G.S. dziękuje za wsparcie ze strony Departamentu Obrony (DoD) poprzez program National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. dziękuje za wsparcie stypendialne od amerykańskiego Heart Association (16POST27250219) oraz Nagroda Pathway to Independence (Rodzic K99/R00) przyznana przez National Institute on Aging of the National Institutes of Health. Prace te zostały częściowo wykonane w Centrum Systemów Nanoskalowych (CNS) Uniwersytetu Harvarda, będącym członkiem National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Network (NNCI), która jest wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF ECCS Award nr 1541959.

<ol><li>Lopes da Silva, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EEG+and+MEG%3A+relevance+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EEG and MEG: relevance to neuroscience.</a> Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).</li>
<li>Logothetis, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+can+do+and+what+we+cannot+do+with+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">What we can do and what we cannot do with fMRI.</a> Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).</li>
<li>Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/micronano201666">State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066(2017).</li>
<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuzsaki%2C+G+%22Rhythms+of+the+Brain%22">Rhythms of the Brain</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroGrid%3A+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li>
<li>Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+level+brain+imaging+in+behaving+mammals%3A+an+engineering+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach.</a> Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).</li>
<li>Berenyi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale%2C+high-density+%28up+to+512+channels%29+recording+of+local+circuits+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).</li>
<li>Scholvin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-Packed+Silicon+Microelectrodes+for+Scalable+Spatially+Oversampled+Neural+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).</li>
<li>Schiller, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Central+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">The Central Visual System.</a> Vision Research. 26 (9), 1351-1386 (1986).</li>
<li>Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+subthalamic+nucleus+for+the+treatment+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease.</a> The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).</li>
<li>Hochberg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reach+and+grasp+by+people+with+tetraplegia+using+a+neurally+controlled+robotic+arm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm.</a> Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).</li>
<li>Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Machine+Interfaces%3A+From+Basic+Science+to+Neuroprostheses+and+Neurorehabilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).</li>
<li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).</li>
<li>Perge, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-day+signal+instabilities+affect+decoding+performance+in+an+intracortical+neural+interface+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system.</a> Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004(2013).</li>
<li>Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesh+electronics%3A+a+new+paradigm+for+tissue-like+brain+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).</li>
<li>Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesh+Nanoelectronics%3A+Seamless+Integration+of+Electronics+with+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).</li>
<li>Feiner, R., Dvir, T. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/natrevmats201776">Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues.</a> Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076(2017).</li>
<li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McFraw-Hill. (2013).</li>
<li>Rousche, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+polyimide-based+intracortical+electrode+arrays+with+bioactive+capability%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nnano.2015.115">Syringe-injectable electronics.</a> Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).</li>
<li>Kasthuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+Reconstruction+of+a+Volume+of+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex.</a> Cell. 162 (3), 648-661 (2015).</li>
<li>Saxena, T., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensor+web+for+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A sensor web for neurons.</a> Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).</li>
<li>Xie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+macroporous+nanoelectronic+networks+as+minimally+invasive+brain+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes.</a> Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).</li>
<li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe+Injectable+Electronics%3A+Precise+Targeted+Delivery+with+Quantitative+Input%2FOutput+Connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity.</a> Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe-injectable+mesh+electronics+integrate+seamlessly+with+minimal+chronic+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).</li>
<li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+chronic+brain+mapping+at+the+single-neuron+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level.</a> Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).</li>
<li>Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+scalable+multichannel+mesh+electronics+for+stable+chronic+brain+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).</li>
<li>Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe-Injectable+Electronics+with+a+Plug-and-Play+Input%2FOutput+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface.</a> Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3233859/">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4079(2012).</li>
<li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+chronic+neural+electrodes+for+recording+single+unit+activity+and+electrocorticographic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293(2015).</li>
<li>Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/5226763/">An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording.</a> IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).</li>
<li>Wentz, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wirelessly+powered+and+controlled+device+for+optical+neural+control+of+freely-behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals.</a> Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021(2011).</li>
<li>Harrison, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+neural+recording+with+single+low-power+integrated+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Neural+Systems+and+Rehabilitation+Engineering%22%5BJournal%5D)">Wireless neural recording with single low-power integrated circuit.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).</li>
<li>Landa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+injectable+alginate+implant+on+cardiac+remodeling+and+function+after+recent+and+old+infarcts+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat.</a> Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).</li>
<li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Zhang, A., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-Bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nano-Bioelectronics.</a> Chemical Reviews. 116 (1), 215-257 (2016).</li>
<li>Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanowire+bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in nanowire bioelectronics.</a> Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701(2017).</li>
<li>Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+and+regulation+of+action+potential+propagation+in+nanoelectronics-innervated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues.</a> Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie etapy produkcji i stosowania elektroniki mesh są ważne, ale kilka z nich jest szczególnie krytycznych. Przed uwolnieniem elektroniki siatkowej z płytki konieczne jest utlenienie powierzchni, aby siatki były łatwo zawieszone w roztworze wodnym (krok 1.6.1). Jeśli ten krok zostanie pominięty, siatki zwykle unoszą się na powierzchni wody, co utrudnia ich załadowanie do igieł, a jeśli można je załadować, często przyklejają się do boków szklanych igieł, co wymaga dużych objętości (>100 μl) do wstrzyknięcia. Brak utlenienia powierzchni przed zwolnieniem oznacza zatem, że siatki nie mogą być używane, a produkcja musi być wykonana od początku. Kolejnym krytycznym krokiem jest wygięcie "trzpienia" elektroniki siatki do ~90° podczas interfejsu I/O (krok 4.3). Jeśli kąt jest mniejszy niż 90°, wszystkie 32 pady I/O nie będą pasować do złącza ZIF; Niektóre będą musiały zostać odcięte na końcu, aby umożliwić wprowadzenie, zmniejszając liczbę podłączonych elektrod. Proces ten należy również wykonać delikatnie, aby zapobiec pękaniu łodygi.
Konstrukcję elektroniki siatkowej można dostosować do różnych zastosowań, modyfikując fotomaski i stosując tę samą procedurę produkcyjną opisaną na rysunku 2. Na przykład, podczas gdy elektroniczne sondy siatkowe użyte do rejestrowania danych na rysunku 9 zostały zaprojektowane tak, aby miały 32 elektrody rejestrujące obejmujące hipokamp myszy i pierwotną korę somatosensoryczną, rozmieszczenie elektrod w ultraelastycznej siatce można wybrać tak, aby celować w praktycznie dowolny obszar mózgu lub można włączyć większe elektrody do stymulacji27. Ta sama podstawowa struktura siatki i procedura wytwarzania są zachowane, ale rozmieszczenie i konstrukcja elektrod są dostosowywane do potrzeb badania. Badacze powinni jednak zachować ostrożność i zawsze sprawdzać, czy zmodyfikowane projekty mogą być łatwo wstrzykiwane przez przeznaczone igły. Niewielkie zmiany w mechanice zginania elektroniki siatkowej mogą mieć znaczący wpływ na wtryskiwalność. Jednym z takich przykładów jest to, że kąt 45° między poprzecznymi i podłużnymi wstęgami SU-8 daje siatkową sondę elektroniczną, którą można łatwo wstrzyknąć, ale kąt 90° powoduje, że igły zgniatają się i zatykają21.
Pomiar impedancji elektrod rejestrujących jest pomocny w rozwiązywaniu problemów. Okrągła elektroda Pt o średnicy 20 μm powinna mieć impedancję bliską 1 MΩ przy pomiarze z częstotliwością 1 kHz in vivo lub w 1x PBS29. Impedancja znacznie większa oznacza, że elektroda nie jest odsłonięta, co może się zdarzyć, jeśli jest zanieczyszczona pozostałościami fotorezystu lub nie jest podłączona elektrycznie. To ostatnie może wystąpić, jeśli na przykład na masce fotograficznej podczas PL znajduje się kurz, który powoduje rozłączenie w interkonektach Au lub jeśli jeden z siatkowych padów I/O nie styka się z pinami złącza ZIF podczas łączenia I/O. Wielkość impedancji mniej więcej o połowę mniejsza od oczekiwanej wartości sugeruje, że kanał może być zwarty z sąsiednim, tworząc obwód dwóch impedancji elektrod równolegle do siebie. Zmierzone wartości impedancji działają jako wskazówka podczas rozwiązywania problemów; w połączeniu z mikroskopią optyczną sond elektronicznych Mesh, źródło problemu można zwykle zidentyfikować i odpowiednio skorygować w następnym cyklu produkcyjnym lub próbie połączenia I/O.
Stosowanie elektrotechniki siatkowej do wstrzykiwania strzykawek w badaniach ostrych jest ograniczone, ponieważ aktywność impulsowa pojedynczej jednostki zwykle nie jest obserwowana do 1 tygodnia po wstrzyknięciu27, chociaż ostatnie prace (nieopublikowane) pokazują, że problem ten można łatwo przezwyciężyć. Kluczowymi determinantami czasu wymaganego do zaobserwowania aktywności impulsowej są konstrukcja siatki, objętość płynu wstrzykiwanego do mózgu wraz z elektroniką siatki oraz średnica igły używanej do wstrzykiwania, ponieważ wpływają one na stopień uszkodzenia tkanki podczas wstrzyknięcia i szybkość gojenia. Mogą być wymagane duże objętości wtrysku, jeśli elektronika siatki nie zostanie potraktowana plazmą tlenową przed uwolnieniem w wytrawiaczu Ni; Oznacza to, że jeśli siatka nie jest hydrofilowa, może przylegać do szklanej igły. Czasami siatki mają wady, które prowadzą do mechaniki zginania, co utrudnia ich wtryskiwanie. Podczas ładowania elektroniki siatkowej ważne jest, aby sprawdzić, czy siatki poruszają się łatwo i płynnie w igle (jak pokazano na filmie uzupełniającym 1). Jeśli nie, należy użyć innej elektronicznej sondy siatkowej. Najlepsze wyniki w zakresie bezproblemowego interfejsu neuronowego zostaną osiągnięte przy idealnych objętościach iniekcji wynoszących 10–50 μl na 4 mm wstrzykiwanej długości siatki. Nowsze wyniki z wstrzykiwanymi sondami elektronicznymi o drobniejszych oczkach i/lub igłami kapilarnymi o mniejszej średnicy (tak małe jak średnica wewnętrzna 150 μm, średnica zewnętrzna 250 μm) pokazują, że pojedyncze jednostki mogą być obserwowane od wkrótce po wstrzyknięciu (ostre pomiary) przez dłuższy czas. Pliki projektowe masek dla tych drobniejszych struktur siatkowych są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej zasobów, meshelectronics.org. Szacujemy, że ogólna wydajność naszych procedur iniekcji siatkowych in vivo przy użyciu igieł o średnicy wewnętrznej 400 μm (średnica zewnętrzna 650 μm) wynosi około 70%, chociaż wydajność jest bliższa 80–90% w przypadku naszych nowszych prac z igłami o średnicy wewnętrznej 150 μm (średnicy zewnętrznej 250 μm). Najczęstszymi przyczynami niepowodzenia są: (1) to, że siatka nie wstrzykuje się płynnie, co powoduje obrzęk mózgu spowodowany nieoczekiwanie dużymi objętościami wstrzyknięć do mózgu, (2) pęknięcie siatki podczas ręcznej manipulacji wymaganej w procedurze interfejsu I/O oraz (3) krwawienie z powodu uszkodzenia naczynia krwionośnego podczas wstrzykiwania. Uszkodzenie naczynia krwionośnego podczas iniekcji jest rzadkie (przyczyna mniej niż 10% niepowodzeń) i można je jeszcze bardziej ograniczyć, stosując chirurgię sterowaną obrazem. Zwracamy również uwagę, że uszkodzenie naczyń krwionośnych jest powszechnym ograniczeniem wszystkich procedur obejmujących penetrację tkanki mózgowej, w tym wstrzykiwania cząstek wirusa w celu transfekcji, wszczepiania sztywnych sond mózgowych i wstrzykiwania elektroniki siatkowej.
Sondy elektroniczne Mesh są w stanie stabilnie rejestrować i śledzić te same pojedyncze neurony w skali czasowej co najmniej miesięcy do roku i nie wywołują prawie żadnej przewlekłej odpowiedzi immunologicznej, jak pokazano odpowiednio na rysunku 9 i rysunku 10. Stanowi to istotną zaletę w porównaniu z konwencjonalnymi elektrodami głębokościowymi, które często cierpią z powodu zmniejszających się amplitud skoków, niestabilnych sygnałów i przewlekłego stanu zapalnego w trakcie długotrwałych eksperymentów rejestracyjnych14,15. Ponadto elektronika siatkowa ma tę zaletę, że można ją pozostawić w tkance podczas sekcji histologicznej, barwienia i obrazowania, w przeciwieństwie do konwencjonalnych sond, które są zbyt sztywne i dlatego muszą zostać usunięte przed analizami histologicznymi. W związku z tym elektronika siatkowa pozwala na unikalną możliwość wykorzystania analizy immunohistochemicznej do precyzyjnego badania środowiska komórkowego otaczającego każde miejsce rejestracji.
Przedstawiony tutaj protokół otwiera nowe, ekscytujące możliwości w neurobiologii. Minimalnie inwazyjna metoda dostarczania i bezproblemowa integracja elektroniki siatkowej z tkanką mózgową minimalizuje zakłócenia obwodów nerwowych i pozwala uniknąć przewlekłej odpowiedzi immunologicznej, co może przynieść korzyści większości rodzajów eksperymentów z przewlekłym zapisem neuronowym. Zdolność elektroniki siatkowej do rejestrowania i śledzenia tych samych pojedynczych neuronów przez długi czas będzie szczególnie interesująca dla badaczy starających się skorelować aktywność impulsową w skali milisekundowej z procesami trwającymi od miesiąca do roku, takimi jak starzenie się, patogeneza chorób mózgu lub rozwój mózgu16,18. Ponadto istnieją znaczne możliwości rozszerzenia i dostosowania tego protokołu, takie jak dodanie aktywnej elektroniki do stopnia głównego PCB w celu wdrożenia funkcji takich jak multipleksowanie cyfrowe 8,35, komunikacja bezprzewodowa 35,36,37 i przetwarzanie sygnału35, jednoczesne wstrzykiwanie komórek macierzystych lub polimerów z elektroniką siatkową w celu pomocy w regeneracji tkanek 18,38,39 i włączenie nanoprzewodowych tranzystorów polowych (NW-FET) do elektroniki siatkowej dla wysoce zlokalizowanych i wielofunkcyjnych sond mózgowych 24,29,40,41,42.

Rozwój narzędzi zdolnych do mapowania mózgu z rozdzielczością pojedynczego neuronu ma kluczowe znaczenie dla neuronauki i neurologii. Nieinwazyjne technologie do badań neuronowych, takie jak elektroencefalografia (EEG), magnetoencefalografia (MEG) i funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (fMRI), okazały się cenne w korelacji aktywności mózgu z zachowaniem u ludzi1,2, ale brakuje im rozdzielczości czasoprzestrzennej niezbędnej do badania struktury i dynamiki sieci neuronowych w ich podstawowych skalach mikrometru i milisekundy, odpowiednio3,4. Niektóre sondy elektrokortykograficzne (ECoG) i metody obrazowania optycznego wykorzystujące barwniki wrażliwe na napięcie odniosły sukces w rejestrowaniu pojedynczej jednostki pobudzającej aktywność in vivo5,6, ale są one na ogół skuteczne tylko w pobliżu powierzchni mózgu, co ogranicza możliwość zastosowania do badań płytkich obszarów mózgu. W przeciwieństwie do tego, wszczepialne sondy elektryczne mogą mierzyć elektrofizjologię pojedynczego neuronu u swobodnie poruszających się zwierząt z praktycznie dowolnego obszaru mózgu bez potrzeby znakowania fluorescencyjnego, co czyni je niezbędnymi dla neuronauki na poziomie systemów, zwłaszcza że techniki mikrowytwarzania z branży półprzewodników przesunęły liczbę kanałów do setek i tysięcy3,7,8,9. Dzięki tym możliwościom, wszczepialne sondy elektryczne wniosły wiele ważnych wkładów w neuronaukę i neurologię, w tym w fundamentalne badania nad przetwarzaniem informacji w układzie wzrokowym10, leczenie zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona11, oraz demonstracja interfejsów mózg-maszyna (BMIs) dla zaawansowanej protetyki12,Rozdział 13.
Niemniej jednak, długotrwała niestabilność objawiająca się malejącymi amplitudami skoków i niestabilnymi sygnałami w skalach czasowych od tygodni do miesięcy14,15 ograniczyło możliwość zastosowania wszczepialnych sond do badania stosunkowo krótkoterminowych zjawisk, pozostawiając pytania takie jak starzenie się i rozwój mózgu w dużej mierze bez odpowiedzi. Ograniczenia w długoterminowej niestabilności są wynikiem niezgodności między konwencjonalnymi sondami a tkanką mózgową pod względem rozmiaru, mechaniki i topologii14,15,16,17,18. Jeśli chodzi o rozmiar, podczas gdy synapsy neuronalne i somaty mają średnicę około dziesiątek nanometrów do kilkudziesięciu mikrometrów19, odpowiednio, tradycyjne sondy są często znacznie większe, w przypadku matryc mikroelektrod krzemowych >4 razy większe niż ciało pojedynczej komórki neuronowej7,8. Stosunkowo duży rozmiar tych sond może zakłócać naturalną strukturę i łączność gęstej tkanki nerwowej, przyczyniając się w ten sposób do przewlekłej odpowiedzi immunologicznej i zaburzając badane obwody nerwowe. Pod względem właściwości mechanicznych tradycyjne sondy są drastycznie sztywniejsze niż niezwykle miękka tkanka nerwowa, w którą są wszczepiane; Nawet "elastyczne" sondy wykonane z arkuszy poliimidu o grubości 10–20 μm są co najmniej 100 000 razy sztywniejsze niż tkanka mózgowa20,21. To niedopasowanie sztywności zginania powoduje względny ruch ścinający między sondą a tkanką mózgową, co prowadzi do niewiarygodnego śledzenia pojedynczej jednostki podczas dłuższych nagrań i indukowania przewlekłego glejozy w miejscu implantacji. Wreszcie, struktura topologiczna konwencjonalnych sond mózgowych z konieczności wyklucza solidną objętość tkanki. Takie niedopasowanie w topologii zakłóca łączność obwodów neuronalnych, wyklucza naturalną, trójwymiarową, wzajemnie przenikającą dystrybucję neuronów, komórek glejowych i naczyń krwionośnych w tkance mózgowej22 i utrudnia transport 3D cząsteczek sygnałowych23. Wszystkie te niedociągnięcia konwencjonalnych sond sprawiły, że nie są one w stanie zapewnić długoterminowej kompatybilności poszukiwanej w zastosowaniach klinicznych i podłużnych badaniach neurobiologicznych na poziomie pojedynczego neuronu.
Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, staraliśmy się zatrzeć granicę między systemami neuronowymi i elektronicznymi, rozwijając nowy paradygmat "tkankopodobnych" sond neuronowych zwanych elektrolityką siatkową16,21,24. Elektronika mesh rozwiązuje powyższe problemy związane z dopasowaniem pod względem rozmiaru, mechaniki i topologii, uwzględniając (1) cechy strukturalne tej samej skali wielkości od nanometra do mikrometra tkanki nerwowej, (2) właściwości mechaniczne podobne do tkanki mózgowej oraz (3) makroporowatą topologię 3D, która jest >90% otwartą przestrzenią, a tym samym umożliwia przenikanie się neuronów i dyfuzję cząsteczek przez środowisko zewnątrzkomórkowe. Elektroniczne sondy siatkowe mogą być precyzyjnie dostarczane do określonych obszarów mózgu za pomocą strzykawki i igły, powodując minimalne ostre uszkodzenia podczas implantacji nawet w głębokich obszarach mózgu21,25. Wykazano, że soma neuronalna i aksony przenikają ze sobą otwartą strukturę sondy elektronicznej 3D w ciągu kilku tygodni po wstrzyknięciu, tworząc w ten sposób płynny, wolny od glejozy interfejs między elektroniką rejestrującą a otaczającą tkanką mózgową21,26,27. Te unikalne cechy umożliwiły elektroelektronicznym sondom siatkowym stabilne śledzenie aktywności impulsowej z tych samych pojedynczych neuronów przez co najmniej rok skali czasowej27. Co więcej, produkcja elektroniki siatkowej w oparciu o fotolitografię (PL) zapewnia wysoką skalowalność liczby elektrod, które można wbudować, z zademonstrowaną liczbą kanałów do 128 elektrod na sondę przy użyciu prostej litografii maski kontaktowej28 oraz konstrukcji wejścia/wyjścia plug-and-play (I/O), która pozwala na szybkie połączenie elektryczne z elektroniką peryferyjną bez specjalistycznego sprzętu29.
Szeroki zakres badań może skorzystać z włączenia elektroniki mesh do protokołów pomiarowych. Większość eksperymentów z zapisem wewnątrzkorowym może skorzystać z minimalnie inwazyjnej procedury implantacji elektrotechniki mesh poprzez wstrzyknięcie strzykawki, drastycznie zmniejszonej odpowiedzi immunologicznej po implantacji oraz możliwości pozostawienia elektroniki siatki w tkance podczas późniejszej histologii i barwienia immunologicznego w celu precyzyjnej analizy środowiska biologicznego otaczającego każde miejsce rejestracji. W szczególności eksperymenty z przewlekłym nagrywaniem będą czerpać wartość z unikalnej zdolności elektroniki siatkowej do śledzenia dużej liczby pojedynczych neuronów przez miesiące lub lata. Ta zdolność stwarza możliwości dla badań z rozdzielczością pojedynczego neuronu, które wcześniej były niepraktyczne, takich jak badania podłużnego starzenia się obwodów neuronalnych, badania rozwijającego się mózgu i badania patogenezy encefalopatii16.
W tym protokole opisujemy wszystkie kluczowe kroki w typowym eksperymencie z nagrywaniem neuronów myszy przy użyciu elektroniki siatkowej do wstrzykiwania strzykawki (zobacz Rysunek 1). Opisane kroki obejmują wytwarzanie elektroniki siatkowej w standardowym procesie opartym na PL możliwym na wielu uniwersytetach, ładowanie elektroniki siatkowej do standardowych igieł kapilarnych, stereotaktyczne wstrzykiwanie elektroniki siatkowej in vivo, podłączenie I/O siatki do standardowych interfejsów oprzyrządowania, skrępowane lub swobodnie poruszające się sesje nagraniowe oraz histologiczne cięcie tkanki mózgowej zawierającej elektronikę siatkową. Niektórzy badacze używający elektroniki siatkowej tylko do badań histologicznych mogą nie wymagać elektrycznego łączenia i nagrywania, w takim przypadku mogą pominąć te kroki. Po zapoznaniu się z tym protokołem, badacze powinni posiadać całą wiedzę niezbędną do wykorzystania elektroniki mesh we własnych eksperymentach.

<table><tbody><tr><td>Zmotoryzowana rama stereotaktyczna</td><td>World Precision Instruments</td><td>MTM-3</td><td>Do chirurgii stereotaktycznej myszy</td></tr><tr><td>512-kanałowy kontroler nagrywania</td><td>Intan Technologies</td><td>C3004</td><td>Element systemu rejestracji neuronowej</td></tr><tr><td>RHD2132 płytka wzmacniacza</td><td>Intan Technologies</td><td>C3314</td><td>Element systemu rejestracji neuronowej</td></tr><tr><td>RHD2000 ultracienki</td> <td>interfejsu SPI o długości 3 stópIntan Technologies</td><td>C3213</td><td>Komponent neuronowego systemu rejestracji</td></tr><tr><td>Ogranicznik myszy</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-150&nbsp; STD</td><td>Standardowa średnica wewnętrzna 1,25 cala; służy do przytrzymywania myszy podczas ograniczonych sesji nagraniowych.</td></tr><tr><td>Wafle krzemowe</td><td>Nova Electronic Materials</td><td></td><td>3" P < 100> 0,001-0,005 oma-cm 356-406 &mu; m Grube Płytki SSP Si klasy Prime z 2 pół-std. Mieszkania & 6,000 A&deg; &plusmn; 5% mokrego tlenku termicznego po obu stronach.</td></tr><tr><td>Fotomaski (chrom na szkle sodowo-wapniowym)</td><td>Zaawansowane reprodukcje</td><td></td><td>Advance Reproductions i inni dostawcy produkują fotomaski z dostarczonych plików projektowych. Nasze pliki z projektami fotomasek są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej z zasobami, meshelectronics.org. Alternatywnie, niektóre uniwersyteckie pokoje czyste mają maszyny do robienia masek do robienia fotomasek na miejscu.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie do projektowania do rysowania fotomasek. Darmową alternatywą jest LayoutEditor. Nasze pliki z projektami fotomasek są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej z zasobami, meshelectronics.org.</td></tr><tr><td>Parownik termiczny</td><td>Sharon Vacuum</td><td></td><td>Służy do odparowywania Ni, Cr i Au na elektronikę siatkową podczas produkcji. Wiele uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.</td></tr><tr><td>SU-8 2000.5 ujemny fotorezystor</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Fotorezystor ujemny używany do definiowania dolnej i górnej warstwy pasywacyjnej elektroniki siatkowej.</td></tr><tr><td>Wyrównywacz maski MA6</td><td>Karl Suss Microtec AG</td><td></td><td>Służy do wyrównania każdej fotomaski do wzoru na płytce i wystawienia płytki na działanie światła UV. Większość uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.</td></tr><tr><td>Deweloper SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Służy do wywoływania ujemnego fotorezystu SU-8 po ekspozycji na światło UV.</td></tr><tr><td>Odporność na podnoszenie LOR3A</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Używany z fotorezystem Shipley 1805 w celu promowania podcinania podczas procesów podnoszenia metalu</td></tr><tr><td>Shipley 1805 dodatni fotorezystor</td><td>Microposit, The Dow Chemical Company</td><td></td><td>Dodatni fotorezystor używany do definiowania metalowych interkonektorów i elektrod Pt w elektronice siatkowej</td></tr><tr><td>MF-CD-26 dodatni fotorezystu</td><td>Microposit, The Dow Chemical Company</td><td></td><td>Opracowanie dodatniego fotorezystu S1805 po naświetleniu w nakładce maski. Wiele uniwersyteckich pomieszczeń czystych przechowuje tę substancję chemiczną.</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Reynolds Tech</td><td></td><td>Do powlekania wafli o dodatnich i ujemnych rezystancjach. Większość uniwersyteckich pomieszczeń czystych jest wyposażona w powlekarki wirowe.</td></tr><tr><td>System plazmowej obróbki powierzchni</td><td>PJ AST Products, Inc.</td><td></td><td>Służy do utleniania powierzchni elektroniki siatkowej przed uwolnieniem do roztworu wodnego. Większość uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.</td></tr><tr><td>Parownik wiązki elektronów</td><td>Denton Vacuum</td><td></td><td>Do odparowywania Cr i Pt podczas wytwarzania elektroniki siatkowej. Wiele uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.</td></tr><tr><td>Zmywacz PG</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Służy do rozpuszczania LOR3A i Shipley S1805 jest odporny na podnoszenie metalu</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku żelaza</td><td>MG Chemicals</td><td>415-1L</td><td>Składnik roztworu do trawienia Ni</td></tr><tr><td>36% roztwór kwasu solnego</td><td>Kanto Corp.</td><td></td><td>Składnik roztworu do trawienia</td></tr><tr><td>Ni Szklane igły kapilarne</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td></td><td>Średnica wewnętrzna 0,40 mm, średnica zewnętrzna 0,65 mm. Dostępne są inne średnice.</td></tr><tr><td>Uchwyt do mikropipet U-type</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>1-HL-U</td><td>Służy do przytrzymywania szklanych igieł kapilarnych podczas wstrzykiwania stereotaktycznego</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>NORM-JECT&reg;, Henke Sass Wolf</td><td></td><td>Służy do ręcznego ładowania elektroniki siatkowej do igieł kapilarnych</td></tr><tr><td>Rurki cewnika doaminiskowego z polietylenu</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td>Średnica wewnętrzna 1,19 mm, średnica zewnętrzna 1,70 mm</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td>Używana w pompie strzykawkowej do wstrzykiwania elektroniki siatkowej in vivo</td></tr><tr><td>Aparat</td><td>okularowy Thorlabs Inc.</td><td>DCC1240C</td><td>Służy do przeglądania elektroniki siatki w igłach kapilarnych podczas wstrzykiwania</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu ThorCam uc480 do kamer USB</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>Służy do oglądania elektroniki siatki w igłach kapilarnych podczas wstrzykiwań Pompa</td></tr><tr><td>strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>PHD 2000</td><td>Służy do przepływu precyzyjnych objętości roztworu przez igły kapilarne podczas wstrzykiwania elektroniki siatkowej</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne EXL-M40</td><td>Osada</td><td>3144-830</td><td>Do wiercenia kraniotomii</td></tr><tr><td>Frez wiertarski 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-09</td><td>Do wiercenia kraniotomii</td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>Służy do sterylizacji narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>Instrument do kriosekcji CM1950</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Służy do krojenia zamrożonej tkanki na sekcje. Wiele uniwersytetów ma to lub podobne narzędzie dostępne we wspólnym obiekcie.</td></tr><tr><td>0,3% Triton x-100</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Używany do histologii</td></tr><tr><td>5% koziej surowicy</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Używany do histologii</td></tr><tr><td>3% koziej surowicy</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Używany do histologii</td></tr><tr><td>Królik anty-NeuN</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>Używany do histologii</td></tr><tr><td>Mysz anty-Neurofilament</td><td>Abcam</td><td>ab8135</td><td>Używany do histologii</td></tr><tr><td>Szczur anty-GFAP</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>PA516291</td><td>Używany do histologii</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>P36930</td><td>Używany do histologii</td></tr><tr><td>Poly-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>P6407-5MG</td><td>Masa cząsteczkowa = 70-150 kDA</td></tr><tr><td>Zacisk końcowy pod kątem prostym</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RA180/M</td><td>Służy do mocowania uchwytu pipety do ramy stereotaktycznej</td></tr><tr><td>Płytka obwodu drukowanego (PCB)</td><td>Zaawansowane obwody</td><td></td><td>Służy do interfejsu między elektroniką siatkową a peryferyjną elektroniką pomiarową, taką jak system nagrywania Intan. Advanced Circuits i inni dostawcy produkują i montują płytki PCB na podstawie dostarczonych plików projektowych. Nasze pliki projektowe PCB są dostępne na żądanie lub na stronie z zasobami meshelectronics.org</td></tr><tr><td>32-kanałowym standardowym złączu wzmacniacza</td><td>Omnetics Connector Corp.</td><td>A79024-001</td><td>Komponent montowany na płytce drukowanej</td></tr><tr><td>32-kanałowy płaski elastyczny (FFC)</td> <td>Molex, LLC</td><td>152660339</td><td>Używany jako podłoże zaciskowe podczas łączenia z elektrolityką siatkową Pady I/O ze złączem ZIF montowanym na płytce drukowanej</td></tr><tr><td>32-kanałowe złącze o zerowej sile wprowadzania (ZIF)</td><td>Hirose Electric Co., LTD</td><td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td><td>Komponent zamontowany na płytce drukowanej</td></tr></tbody></table>

elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Wszczepialne sondy elektrofizjologiczne mózgu są cennymi narzędziami w neurobiologii, ze względu na ich zdolność do rejestrowania aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną z płytkich i głębokich obszarów mózgu. Ich stosowanie jest jednak utrudnione przez mechaniczne i strukturalne niedopasowania między sondami a tkanką mózgową, które często prowadzą do mikroruchu i glejozy, co skutkuje niestabilnością sygnału w eksperymentach z przewlekłym nagrywaniem. W przeciwieństwie do tego, po wszczepieniu ultraelastycznej elektroniki siatkowej poprzez wstrzyknięcie strzykawki, sondy siatkowe tworzą bezszwowy, wolny od glejozy interfejs z otaczającą tkanką mózgową, który umożliwia stabilne śledzenie poszczególnych neuronów w skali co najmniej roku. Protokół ten szczegółowo opisuje kluczowe kroki w typowym eksperymencie z zapisem neuronowym myszy przy użyciu elektroniki siatkowej wstrzykiwanej za pomocą strzykawki, w tym wytwarzanie elektroniki siatkowej w standardowym procesie opartym na fotolitografii możliwym na wielu uniwersytetach, ładowanie elektroniki siatkowej do standardowych igieł kapilarnych, wstrzykiwanie stereotaktyczne in vivo, podłączenie wejścia/wyjścia siatki do standardowych interfejsów oprzyrządowania, ograniczone lub swobodnie poruszające się sesje nagraniowe, oraz przekrój histologiczny tkanki mózgowej zawierającej siatkową elektronikę. Przedstawiono reprezentatywne nagrania neuronalne i dane histologiczne. Badacze zaznajomieni z tym protokołem będą posiadali wiedzę niezbędną do włączenia elektroniki siatkowej do własnych eksperymentów i wykorzystania unikalnych możliwości oferowanych przez długoterminowe stabilne interfejsy neuronowe, takich jak badania procesów starzenia, rozwoju mózgu i patogenezy chorób mózgu.

Wyniki będą się różnić w zależności od gatunku zwierząt w badaniu, docelowego obszaru mózgu, czasu, jaki upłynął od iniekcji, stopnia ostrego uszkodzenia powstałego podczas iniekcji oraz sukcesu procedury interfejsu wejścia/wyjścia (I/O), między innymi. Aktywność impulsowa pojedynczych jednostek może pojawić się dopiero od 1 dnia (w przypadku igieł o średnicy wewnętrznej 150 µm) do 1 tygodnia po iniekcji, a amplitudy impulsów mogą ulegać zmianom przez okres do 4–6 tygodni. Rysunek 9 przedstawia reprezentatywne dane elektrofizjologiczne z 32-kanałowej sondy z elektroniki siatkowej wprowadzonej do hipokampa i pierwotnej kory somatosensorycznej dorosłego samca myszy C57BL/6J. Na wszystkich 32 kanałach zarejestrowano lokalne potencjały polowe (LFPs) o amplitudzie około 300 µV, a aktywność impulsową pojedynczych jednostek zarejestrowano na 26 kanałach. LFPs i wyizolowane impulsy pozostały podobne między 2. a 4. miesiącem, co sugeruje wysoce stabilny interfejs między elektroniką rejestrującą a neuronami w tym wydłużonym okresie czasu. Rysunek 10 przedstawia reprezentatywne wyniki sekcjonowania histologicznego i immunobarwienia tkanki mózgowej zawierającej elektronikę siatkową 1 rok po iniekcji. Barwienie na NeuN, marker ciał neuronów, oraz na neurofilamenty, marker aksonów neuronalnych, wykazuje niewielki lub brak spadku gęstości tkanki w miejscu iniekcji, co wskazuje na płynne połączenie między elektroniką siatkową a tkanką mózgu. Barwienie na GFAP (marker astrocytów) dodatkowo ujawnia poziomy astrocytów bliskie tłu wokół elektroniki siatkowej, co wskazuje, że jej obecność wywołuje niewielką przewlekłą odpowiedź immunologiczną.
<img alt="Schemat procesu elektroniki siatkowej; wykonanie, wstrzyknięcie, interfejsowanie, rejestracja, histologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Etapy eksperymentu z wykorzystaniem wstrzykiwanej strzykawką elektroniki siatkowej. Niniejszy protokół opisuje wszystkie kluczowe etapy typowego eksperymentu z rejestracją aktywności neuronalnej u gryzoni z użyciem elektroniki siatkowej. Eksperymenty zazwyczaj obejmują, w kolejności realizacji, (1) wykonanie elektroniki siatkowej, (2) załadowanie elektroniki siatkowej do igieł kapilarnych, (3) stereotaktyczne wstrzyknięcie elektroniki siatkowej do mózgu, (4) stworzenie interfejsu wejścia/wyjścia elektrycznego dla elektroniki siatkowej, (5) rejestracje w unieruchomieniu lub podczas swobodnego poruszania się oraz (6) sekcjonowanie i barwienie siatki/tkanki do badań histologicznych. W niektórych badaniach pożądane mogą być jedynie dane histologiczne, w takim przypadku można pominąć etapy (4) i (5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wytwarzanie systemów mikroelektromechanicznych (MEMS), warstwy SU-8, Au, Pt, schemat strukturalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat przedstawiający procedurę wytwarzania elektroniki siatkowej typu plug-and-play w obszarze urządzenia ultrelastycznego (górny rząd), obszarze połączeń trzonia (środkowy rząd) i obszarze wejścia/wyjścia I/O (dolny rząd). (A) Negatywny fotorezyst SU-8 (czerwony) jest naświetlany z użyciem maski PL mask-1 w celu zdefiniowania dolnej warstwy pasywacyjnej każdej sondy elektroniki siatkowej plug-and-play. (B) Naświetlanie z maską PL mask-2, odparowanie termiczne i proces lift-off metalu definiują połączenia z Au oraz pady I/O (złoty). (C) Naświetlanie z maską PL mask-3, odparowanie wiązką elektronów i proces lift-off metalu definiują elektrody z Pt (niebieski). (D) Negatywny fotorezyst SU-8 (czerwony) jest naświetlany z maską PL mask-4 w celu zdefiniowania górnej warstwy pasywacyjnej. Otwory w SU-8 pozostają przy każdej elektrodzie Pt i padzie I/O. (E) Gotowa sonda elektroniki siatkowej z przerywanymi ramkami wskazującymi obszary powiększone w górnym, środkowym i dolnym rzędzie. Pliki projektowe fotomasek są dostępne na życzenie od autorów lub ze strony zasobów meshelectronics.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Fotoniczny układ scalony, obrazy mikroskopowe, struktura falowodu, ilustracja kierowania sygnałem optycznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Fotografie i obrazy z mikroskopu optycznego siatkowej elektroniki typu plug-and-play. (A) Mozaikowe obrazy z mikroskopu optycznego sondy z siatkową elektroniką do wstrzykiwania strzykawką z wejściami/wyjściami (I/O) typu plug-and-play. Sondę zobrazowano po zakończeniu etapów wytwarzania przedstawionych na Rycini 2, ale przed oddzieleniem od podłoża powlekanego Ni. Przerywane ramki odpowiadają (od lewej do prawej) sekcjom obszaru urządzenia ultryelastycznego, trzpienia i obszaru I/O, powiększonym odpowiednio na obrazach C, D i E. Pasek skali = 1 mm. (B) Fotografia 3-calowego wafla Si zawierającego 20 gotowych sond z siatkową elektroniką. Pasek skali = 20 mm. (C) Obraz z mikroskopu optycznego elektrod rejestrujących z Pt o średnicy 20 µm w obszarze urządzenia ultraelastycznego. Pasek skali = 100 µm. (D) Obraz z mikroskopu optycznego gęstych połączeń z Au w obszarze trzpienia. Każde połączenie z Au jest izolowane elektrycznie i łączy pojedynczą elektrodę Pt z pojedynczym polem I/O. Pasek skali = 100 µm. (E) Obraz z mikroskopu optycznego pól I/O. Każde pole składa się z zapadającego się obszaru siatkowego i ciągłego obszaru cienkowarstwowego znajdującego się na trzpieniu. Nieprzewodzące wstążki z SU-8 łączą siatkowe części pól, aby pomóc w zachowaniu wyrównania. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ pompy strzykawkowej do kontroli przepływu cieczy; schematy montażowe aparatury eksperymentalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Montaż aparatury do mocowania igieł kapilarnych podczas iniekcji. (A) Zdjęcie komponentów aparatury. Komponenty obejmują (1) szklaną igłę kapilarną, (2) uchwyt do pipety, (3) okrągły element mocujący z wkrętem do uchwytu do pipety oraz (4) podkładkę stożkową do uchwytu do pipety. Elementy od (2) do (4) są dołączone do uchwytu do pipety przy zakupie. Strzałka wskazuje wylot uchwytu do pipety, który należy zakleić żywicą epoksydową. (B) Zdjęcie uchwytu do pipety po montażu i włożeniu szklanej igły kapilarnej. Dodana żywica epoksydowa jest widoczna w górnym wylocie uchwytu do pipety (oznaczonym strzałką), a rurka kapilarna łączy uchwyt do pipety ze strzykawką (nie pokazana). (C) Zdjęcie uchwytu do pipety i igły kapilarnej po przymocowaniu do ramy stereotaktycznej za pomocą kątowego zacisku końcowego. Paski skali wynoszą 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces wyciągania włókna, schemat i sekwencja obrazów ilustrująca dynamikę formowania włókna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ładowanie elektroniki siatkowej do szklanych igieł. (A) Schematyczna ilustracja procedury ładowania elektroniki siatkowej typu plug-and-play. Szklana igła jest ustawiona w pobliżu końca wejścia/wyjścia sondy elektroniki siatkowej, gdy ta jest zawieszona w roztworze. Następnie tłok strzykawki jest ręcznie cofany, aby wciągnąć sondę elektroniki siatkowej. Idealne ustawienie polega na umieszczeniu ultraelastycznego obszaru urządzenia tuż za końcem igły. (B) Fotografie odpowiadające części (A), przedstawiające ładowanie sondy elektroniki siatkowej do szklanej igły. Paski skali = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikroskopowy do obrazowania mózgu in vivo z pompą strzykawkową, interfejsem komputerowym i analizą danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Schemat stanowiska do operacji stereotaktycznych. Zmotoryzowana rama stereotaktyczna (A) z przymocowanym uchwytem do pipety służy do pozycjonowania igły w pożądanej okolicy mózgu. Pozycja igły oraz załadowanej elektroniki siatkowej jest monitorowana za pomocą obiektywu i przymocowanej kamery (B) oraz wyświetlana na komputerze (C). Pompa strzykawkowa (D) tłoczy precyzyjne objętości soli fizjologicznej przez igłę, co pozwala na dokładną, kontrolowaną iniekcję elektroniki siatkowej do wybranego obszaru mózgu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ eksperymentu neurobiologicznego z elektrodami u gryzoni do pomiaru sygnałów mózgowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Procedura interfejsu wejścia/wyjścia (I/O) typu plug-and-play. (A) Podłoże zaciskowe FFC zostaje przymocowane cementem dentystycznym obok kraniotomii. (B) Elektronika siatkowa plug-and-play jest wstrzykiwana stereotaktycznie do pożądanego obszaru mózgu przy użyciu metody FoV. (C) Igła, w której wciąż znajdują się pady I/O sondy elektroniki siatkowej, zostaje ponownie ustawiona nad podłożem zaciskowym FFC. (D) Przepływ przez igłę zostaje wznowiony, aby wyrzucić pady I/O na podłoże zaciskowe FFC. (E) Pady I/O zostają zgięte o 90° względem trzpienia, rozłożone stroną przewodzącą do góry i wysuszone w miejscu. (F) Podłoże FFC zostaje przycięte nożyczkami w linii prostej ok. 0,5 mm od krawędzi padów I/O. Nadmiar podłoża zostaje odcięty, aby umożliwić włożenie go do 32-kanałowego złącza ZIF. (G) Pady I/O zostają włożone do 32-kanałowego złącza ZIF zamontowanego na niestandardowej płytce PCB. Złącze ZIF zostaje zatrzaśnięte, aby nawiązać kontakt z padami I/O. (H) Zatrzask zostaje zaklejony cementem, płytka PCB zostaje odwrócona na czaszkę i przymocowana w miejscu cementem dentystycznym. (I) Płytka PCB tworzy kompaktowy moduł głowicowy ze standardowym złączem wzmacniacza, co ułatwia podłączenie podczas sesji rejestracyjnych. Paski skali = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do rejestracji aktywności neuronalnej myszy; sensory na głowach myszy do wykrywania aktywności mózgu; badanie neuronaukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Rejestracje w unieruchomieniu i w swobodnym poruszaniu się. (A) Fotografia samca myszy C57BL/6J w ograniczniku podczas sesji rejestracyjnej. Do standardowego złącza wzmacniacza wstawiono 32-kanałową płytkę PCB przedwzmacniacza. (B) Fotografia tej samej myszy z 32-kanałową płytką PCB przedwzmacniacza podczas eksperymentu z rejestracją w swobodnym poruszaniu się. Paski skali = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza sygnału LFP, mapy ciepła i wykresy przebiegów dla porównania aktywności neuronalnej w 2. i 4. miesiącu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Reprezentatywne wyniki rejestracji neuronalnej. (A) Reprezentatywne mapy ciepła LFP z 32-kanałowych siateczkowych sond elektronicznych wprowadzonych do hipokampa i kory somatosensorycznej myszy. Dane rejestrowano podczas swobodnej eksploracji klatki przez mysz w 2. miesiącu (góra) i 4. miesiącu (dół) po iniekcji. Amplituda LFP jest zakodowana kolorami zgodnie z paskiem skali po prawej stronie. Ślady przefiltrowane górnoprzepustowo (czarne), pokazujące aktywność impulsową, są nałożone na spektrogram dla każdego z 32 kanałów. (B) Impulsy wyizolowane po sortowaniu danych przedstawionych na (A). Aktywność impulsowa pojedynczych jednostek została wykryta w 26 z 32 kanałów zarówno w 2. miesiącu po iniekcji (góra), jak i w 4. miesiącu po iniekcji (dół). Liczby nad każdym klastrem impulsów odpowiadają numerom kanałów w (A). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Fu, et al.28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie przekroju mózgu, sieci neuronalne; mikroskopia fluorescencyjna; schemat, szlaki neuronalne, marker komórkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Reprezentatywne wyniki histologiczne. (A) Schemat ilustrujący orientację elektroniki siatkowej w horyzontalnych (panel środkowy) i strzałkowych (panel dolny) przekrojach mózgu. (B) Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego 10 µm grubego przekroju kory mózgowej rok po wstrzyknięciu 16-kanałowej sondy z elektroniki siatkowej. Przekrój został poddany immunostainingu na NeuN (zielony). (C) Ten sam przekrój mózgu poddany immunostainingu na neurofilamenty (czerwony). (D) Ten sam przekrój mózgu poddany immunostainingu na GFAP (cyjan). (E) Obraz kompozytowy z paneli (B) do (D) pokazujący interfejs elektroniki siatkowej z tkanką z oznakowanymi NeuN (zielony), neurofilamentami (czerwony), GFAP (cyjan) oraz elektroniką siatkową (niebieski). Paski skali = 100 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fu et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo uzupełniające 1: Powtarzalne ładowanie i wstrzykiwanie elektroniki siatkowej do roztworu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Sondy elektroniczne Mesh bezproblemowo integrują się i zapewniają stabilny, długoterminowy zapis na poziomie pojedynczego neuronu w mózgu. Protokół ten wykorzystuje elektronikę siatkową do eksperymentów in vivo, obejmujących wytwarzanie elektroniki siatkowej, ładowanie do igieł, wstrzykiwanie stereotaktyczne, łączenie wejść / wyjść, eksperymenty rejestracyjne i histologię tkanki zawierającej sondy siatkowe.

Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, jak procesy starzenia manifestują się w mózgu, jak rozwija się mózg oraz jak powstają i postępują choroby mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że elektronika siatkowa nie wywołuje przewlekłej odpowiedzi immunologicznej w glejozie po wszczepieniu do mózgu i pozwala na bezproblemową integrację z otaczającą tkanką nerwową. Procedurę zademonstrują Tao Zhou, doktorant w Grupie Lieber, oraz Jung Min Lee, post-doc w Grupie Lieber.Aby rozpocząć procedurę, załaduj czystą płytkę krzemową do parownika termicznego i odparuj 100 nanometrów niklu. Następnie należy obrócić ujemny fotorezyst SU-8 2000.5 na płytce z prędkością 400 obrotów na minutę, aby uzyskać przybliżoną grubość SU-8 od 400 do 500 nanometrów. Załaduj wafel do wyrównywacza maski, aby naświetlić SU-8 maską fotolitograficzną odpowiadającą dolnej warstwie siatki SU-8.Naświetlić w dawce I-line 100 milidżuli na centymetr kwadratowy. Zanurz je w tacce wywoływacza SU-8. Delikatnie mieszaj roztwór przez dwie minuty, aż wzór siatki w SU-8 zostanie w pełni rozwinięty.Następnie opłucz wafel na tacy z alkoholem izopropylowym przez minutę i wysusz suszarką. Wafelek pieczemy na twardo na rozgrzanej płycie w temperaturze 180 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie należy obtoczyć LOR 3A na płytce z prędkością 4 000 obrotów na minutę, aby uzyskać przybliżoną grubość 300 nanometrów.Dodatni fotorezyst S1805 z prędkością 4 000 obrotów na minutę o przybliżonej grubości 500 nanometrów. Następnie załaduj wafel do wyrównywacza maski, aby naświetlić S1805 z maską fotolitograficzną dwie odpowiadające metalowym interkonektom i padom wejściowym, wyjściowym. Naświetlić w dawce H-line na 40 milidżuli na centymetr kwadratowy, a następnie zanurzyć wafel w tacy z wywoływaczem fotorezystu CD-26.Delikatnie mieszaj roztwór przez jedną minutę, aż wzór metalowych połączeń zostanie w pełni rozwinięty. Opłucz wafel na tacy z wodą dejonizowaną przez minutę i wysusz do sucha. Następnie odparuj termicznie trzy nanometry chromu, a następnie 80 nanometrów złota.Zanurz wafel w płaskiej zlewce ze zmywaczem PG na około trzy godziny, aż metal całkowicie się podcinie, pozostawiając metal tylko w pożądanych obszarach interkonektu i wejścia, padów wyjściowych elektroniki siatkowej. Powtórz powlekanie wirowe, litografię, odparowanie i oderwanie, aby pozostawić trzy nanometry chromu i 50 nanometrów platyny w obszarach elektrod. Następnie powtórz powlekanie wirowe i fotolitografię SU-8, aby zdefiniować górną warstwę siatki SU-8.Traktuj płytkę plazmą tlenową o mocy 50 watów przez jedną minutę. Następnie zanurz wafel w niklu wytrawionym w roztworze na około trzy godziny, aż elektronika siatki zostanie całkowicie uwolniona z płytki krzemowej. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść uwolnione sondy elektroniczne siatki z wytrawiania niklu do 100-mililitrowej zlewki z dejonizowaną wodą.Następnie przenieś elektronikę siatki do świeżej zlewki z dejonizowaną wodą co najmniej trzy razy, aby zapewnić płukanie. Aby załadować elektronikę siatkową do igły, włóż szklaną igłę kapilarną do 100-mililitrowej zlewki PBS zawierającej elektronikę siatki. Umieść koniec igły w pobliżu wkładek wejściowych i wyjściowych elektrosondy elektronicznej z siatką i ręcznie wycofaj strzykawkę, aby wciągnąć siatkową sondę elektroniczną do igły.Wciskać i pociągać tłok strzykawki, gdy jest ona nadal zanurzona w soli fizjologicznej, aby wyregulować położenie elektroniki siatkowej w igle. Aby wstrzyknąć siatkę elektroniczną do mózgu myszy, użyj wiertła dentystycznego i ramy stereotaktycznej, aby otworzyć kraniotomię w pożądanych współrzędnych czaszki. Otworzyć drugą kraniotomię z dala od miejsca wstrzyknięcia w celu wprowadzenia lub drutu ze stali nierdzewnej.Następnie przymocuj podłoże zaciskowe do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Nacięcie w podłożu o szerokości około jednego milimetra poprawia niezawodność etapu składania w dalszej części procedury. Następnie zamontuj uchwyt pipety z igłą zawierającą elektronikę siatkową w ramie stereotaktycznej za pomocą zacisku końcowego pod kątem prostym.Podłącz boczny wylot uchwytu pipety do pięciomililitrowej strzykawki zamocowanej w pompie strzykawkowej z rurką kapilarną o długości od 0,5 do jednego metra. Następnie użyj ramki stereotaktycznej, aby ustawić końcówkę igły w pożądanym miejscu początkowym w mózgu. Ustaw kamerę tak, aby wyświetlić górną część sondy elektronicznej siatki w szklanej igle.Zainicjuj przepływ, ustawiając pompę strzykawkową na niską prędkość i naciskając start. Powoli zwiększaj natężenie przepływu, jeśli sonda elektroniczna siatki nie porusza się w obrębie igły. Gdy sonda elektroniczna siatki zaczyna poruszać się w igle, użyj ramki stereotaktycznej, aby cofnąć igłę z taką samą szybkością, z jaką wstrzykiwana jest sonda elektroniczna siatki, używając zaznaczonej oryginalnej pozycji elektroniki siatkowej jako prowadnicy.Kontynuuj przepływ soli fizjologicznej i cofanie igły, aż igła opuści czaszkę. Następnie zatrzymaj przepływ z pompy strzykawkowej. W tej procedurze użyj ramy stereotaktycznej, aby ostrożnie poprowadzić igłę do płaskiego, elastycznego podłoża zaciskającego w poprzek szczeliny, przepływając roztwór za pomocą pompy strzykawkowej, aby wytworzyć luz w połączeniach elektroniki siatkowej.Gdy igła znajdzie się nad podłożem zaciskowym i w poprzek szczeliny, wznowij przepływ z dużą szybkością, aby wstrzyknąć elektrotechnikę siatkową i podkładki wyjściowe na podłoże zaciskowe. Za pomocą pęsety i pipety z wodą dejonizowaną zegnij wkładkę, wyjdź podkładki pod kątem 90 stopni jak najbliżej pierwszej podkładki wejściowej, wyjściowej. Po wejściu podkładki wyjściowe są wyrównywane i składane, a następnie pod kątem 90 stopni do trzpienia siatki wysuszyć je na miejscu delikatnie przepływającym sprężonym powietrzem.Przyciąć podłoże zaciskowe na krawędzi cieśniny około 0.5 do jednego milimetra od krawędzi podkładek wejściowych, wyjściowych. Należy również odciąć obce części podłoża zaciskowego, które utrudnią włożenie do 32-kanałowego złącza zif zamontowanego na płytce drukowanej. Następnie włóż pola wejściowe, wyjściowe do złącza zif na płytce drukowanej i zamknij zatrzask.Użyj elektroniki pomiarowej, aby zmierzyć impedancję między kanałami a śrubą uziemiającą, aby potwierdzić pomyślne połączenie. Jeśli wartości impedancji są zbyt wysokie, odblokuj złącze zif, wyreguluj włożenie i przetestuj ponownie, aż zostanie potwierdzone pomyślne połączenie. Następnie zakryj złącze zif i odsłonięte połączenia elektroniczne siatki cementem dentystycznym w celu ochrony.Odwróć płytkę drukowaną w szczelinie w podłożu i przymocuj płytkę drukowaną za pomocą cementu do czaszki myszy. W przypadku swobodnie poruszających się nagrań, zwolnij mysz z ogranicznika po włożeniu płytki PCB przedwzmacniacza i uziemieniu odniesienia. Nagrywaj przez żądany czas za pomocą systemu akwizycji danych, podczas gdy mysz zachowuje się swobodnie.Pokazano tutaj reprezentatywne mapy cieplne pola lokalnego z 32-kanałowych sond elektronicznych typu mesh wstrzykniętych do hipokampa myszy i kory somatosensorycznej. Dane zostały zarejestrowane, gdy mysz swobodnie eksplorowała swoją klatkę po dwóch miesiącach i czterech miesiącach od wstrzyknięcia. Amplituda potencjału pola lokalnego jest oznaczona kolorami zgodnie z kolorowym paskiem po prawej stronie.Ślady filtra górnoprzepustowego, czarne, pokazujące aktywność impulsową, są nakładane na spektrogram dla każdego z 32 kanałów. Oto skok wyizolowany po posortowaniu wykreślonych danych. Aktywność skokową pojedynczej jednostki wykryto na 26 z 32 kanałów, zarówno dwa miesiące po wstrzyknięciu, jak i cztery miesiące po wstrzyknięciu.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przetestowaniu interfejsu I/O w celu potwierdzenia pomyślnego połączenia elektrycznego z sondą elektroniki siatkowej. Pomiar impedancji pomaga w rozwiązywaniu problemów ze źródłem wszelkich problemów i ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji problemów z interfejsem lub produkcją. Po tej procedurze można wykonać histologię w celu zbadania środowiska komórkowego wokół każdej zarejestrowanej elektrody.W przeciwieństwie do konwencjonalnych, sztywnych sond mózgowych, elektronika siatkowa może pozostać w tkance podczas histologii, co umożliwia precyzyjne skorelowanie danych elektrofizjologicznych z analizą immunohistochemiczną.

syringe-injectable-mesh-electronics-for-stable-chronic-rodent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten protokół opisuje montaż i użycie iniekcji do precyzyjnego dostarczania leku do wybranych obszarów mózgu znieczulonego szczura, a następnie monitorowanie aktywności neuronalnej za pomocą zarejestrowanych sygnałów elektrycznych.

Mikroiniekcja leku z zapisem elektrofizjologicznym w mózgu szczura

Film demonstruje wstrzykiwanie sond elektronicznych siatki do mózgu myszy w celu uzyskania stabilnych, długoterminowych zapisów na poziomie pojedynczego neuronu. Znieczulona mysz z odsłoniętą czaszką jest zabezpieczona na stereotaktycznej ramie, a obszar urządzenia siatkowego sondy jest wstrzykiwany do mózgu przez wywiercone otwory. Pady wejścia-wyjścia sondy są podłączone do obwodu, a nagrania są uzyskiwane za pomocą systemu akwizycji danych.

Wstrzykiwana elektronika siatkowa do stabilnych zapisów pojedynczych neuronów w mózgu myszy

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Tutaj demonstrujemy użycie bezprzewodowej technologii umożliwiającej elektroencefalogram (EEG) w modelach chorób ludzkich noworodków gryzoni. Dzięki telemetrii nie ma obciążających połączeń, co pozwala na naturalne zachowania.

Długotrwałe, ciągłe monitorowanie EEG w modelach chorób człowieka u małych gryzoni przy użyciu systemu nadajników bezprzewodowych Epoch

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Znieczulone myszy wykazują niefizjologiczne ogólnoustrojowe ciśnienie krwi, co uniemożliwia miarodajną ocenę tonu autonomicznego, biorąc pod uwagę ścisły związek między ciśnieniem krwi a autonomicznym układem nerwowym. W związku z tym przedstawiono nowatorską metodę jednoczesnego rejestrowania aktywności nerkowego nerwu współczulnego i ciśnienia krwi za pomocą wlewu dożylnego u przytomnych myszy.

Nowatorskie podejście do jednoczesnego rejestrowania aktywności nerek współczulnych i ciśnienia krwi za pomocą wlewu dożylnego u przytomnych, nieskrępowanych myszy.

Opisana poniżej jest metoda implantacji wielu układów elektrod polimerowych w anatomicznie odległych obszarach mózgu w celu przewlekłego zapisu elektrofizjologicznego u swobodnie poruszających się szczurów. Przygotowanie i implantacja chirurgiczna są szczegółowo opisane, z naciskiem na zasady projektowania, które mają pomóc w adaptacji tych metod do stosowania u innych gatunków.

Przewlekła implantacja wielu elastycznych matryc elektrod polimerowych

Prezentujemy system mikroiniekcji przeznaczony do elektrofizjologii i wspomaganego dostarczania eksperymentalnych sond (tj. nanosensorów, mikroelektrod), z opcjonalnym wlewem leku. Powszechnie dostępne składniki mikroprzepływowe są sprzężone z kaniulą zawierającą sondę. Dołączony jest protokół krok po kroku dotyczący budowy mikroiniekcji, z wynikami podczas infuzji muscymolu w korze makaka.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.

Opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłej wielomiejscowej elektroencefalografii u swobodnie poruszających się myszy

Poznaj elektronikę siatkową do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłej w mózgu gryzoni. Ta metoda umożliwia długoterminowe rejestracje na poziomie pojedynczych neuronów bez przewlekłej odpowiedzi immunologicznej.

Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni

Przeglądaj więcej filmów