Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni
21 lipca 2018
Sondy elektroniczne Mesh bezproblemowo integrują się i zapewniają stabilny, długoterminowy zapis na poziomie pojedynczego neuronu w mózgu. Protokół ten wykorzystuje elektronikę siatkową do eksperymentów in vivo, obejmujących wytwarzanie elektroniki siatkowej, ładowanie do igieł, wstrzykiwanie stereotaktyczne, łączenie wejść / wyjść, eksperymenty rejestracyjne i histologię tkanki zawierającej sondy siatkowe.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, jak procesy starzenia manifestują się w mózgu, jak rozwija się mózg oraz jak powstają i postępują choroby mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że elektronika siatkowa nie wywołuje przewlekłej odpowiedzi immunologicznej w glejozie po wszczepieniu do mózgu i pozwala na bezproblemową integrację z otaczającą tkanką nerwową. Procedurę zademonstrują Tao Zhou, doktorant w Grupie Lieber, oraz Jung Min Lee, post-doc w Grupie Lieber.
Aby rozpocząć procedurę, załaduj czystą płytkę krzemową do parownika termicznego i odparuj 100 nanometrów niklu. Następnie należy obrócić ujemny fotorezyst SU-8 2000.5 na płytce z prędkością 400 obrotów na minutę, aby uzyskać przybliżoną grubość SU-8 od 400 do 500 nanometrów. Załaduj wafel do wyrównywacza maski, aby naświetlić SU-8 maską fotolitograficzną odpowiadającą dolnej warstwie siatki SU-8.
Naświetlić w dawce I-line 100 milidżuli na centymetr kwadratowy. Zanurz je w tacce wywoływacza SU-8. Delikatnie mieszaj roztwór przez dwie minuty, aż wzór siatki w SU-8 zostanie w pełni rozwinięty.
Następnie opłucz wafel na tacy z alkoholem izopropylowym przez minutę i wysusz suszarką. Wafelek pieczemy na twardo na rozgrzanej płycie w temperaturze 180 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie należy obtoczyć LOR 3A na płytce z prędkością 4 000 obrotów na minutę, aby uzyskać przybliżoną grubość 300 nanometrów.
Dodatni fotorezyst S1805 z prędkością 4 000 obrotów na minutę o przybliżonej grubości 500 nanometrów. Następnie załaduj wafel do wyrównywacza maski, aby naświetlić S1805 z maską fotolitograficzną dwie odpowiadające metalowym interkonektom i padom wejściowym, wyjściowym. Naświetlić w dawce H-line na 40 milidżuli na centymetr kwadratowy, a następnie zanurzyć wafel w tacy z wywoływaczem fotorezystu CD-26.
Delikatnie mieszaj roztwór przez jedną minutę, aż wzór metalowych połączeń zostanie w pełni rozwinięty. Opłucz wafel na tacy z wodą dejonizowaną przez minutę i wysusz do sucha. Następnie odparuj termicznie trzy nanometry chromu, a następnie 80 nanometrów złota.
Zanurz wafel w płaskiej zlewce ze zmywaczem PG na około trzy godziny, aż metal całkowicie się podcinie, pozostawiając metal tylko w pożądanych obszarach interkonektu i wejścia, padów wyjściowych elektroniki siatkowej. Powtórz powlekanie wirowe, litografię, odparowanie i oderwanie, aby pozostawić trzy nanometry chromu i 50 nanometrów platyny w obszarach elektrod. Następnie powtórz powlekanie wirowe i fotolitografię SU-8, aby zdefiniować górną warstwę siatki SU-8.
Traktuj płytkę plazmą tlenową o mocy 50 watów przez jedną minutę. Następnie zanurz wafel w niklu wytrawionym w roztworze na około trzy godziny, aż elektronika siatki zostanie całkowicie uwolniona z płytki krzemowej. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść uwolnione sondy elektroniczne siatki z wytrawiania niklu do 100-mililitrowej zlewki z dejonizowaną wodą.
Następnie przenieś elektronikę siatki do świeżej zlewki z dejonizowaną wodą co najmniej trzy razy, aby zapewnić płukanie. Aby załadować elektronikę siatkową do igły, włóż szklaną igłę kapilarną do 100-mililitrowej zlewki PBS zawierającej elektronikę siatki. Umieść koniec igły w pobliżu wkładek wejściowych i wyjściowych elektrosondy elektronicznej z siatką i ręcznie wycofaj strzykawkę, aby wciągnąć siatkową sondę elektroniczną do igły.
Wciskać i pociągać tłok strzykawki, gdy jest ona nadal zanurzona w soli fizjologicznej, aby wyregulować położenie elektroniki siatkowej w igle. Aby wstrzyknąć siatkę elektroniczną do mózgu myszy, użyj wiertła dentystycznego i ramy stereotaktycznej, aby otworzyć kraniotomię w pożądanych współrzędnych czaszki. Otworzyć drugą kraniotomię z dala od miejsca wstrzyknięcia w celu wprowadzenia lub drutu ze stali nierdzewnej.
Następnie przymocuj podłoże zaciskowe do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Nacięcie w podłożu o szerokości około jednego milimetra poprawia niezawodność etapu składania w dalszej części procedury. Następnie zamontuj uchwyt pipety z igłą zawierającą elektronikę siatkową w ramie stereotaktycznej za pomocą zacisku końcowego pod kątem prostym.
Podłącz boczny wylot uchwytu pipety do pięciomililitrowej strzykawki zamocowanej w pompie strzykawkowej z rurką kapilarną o długości od 0,5 do jednego metra. Następnie użyj ramki stereotaktycznej, aby ustawić końcówkę igły w pożądanym miejscu początkowym w mózgu. Ustaw kamerę tak, aby wyświetlić górną część sondy elektronicznej siatki w szklanej igle.
Zainicjuj przepływ, ustawiając pompę strzykawkową na niską prędkość i naciskając start. Powoli zwiększaj natężenie przepływu, jeśli sonda elektroniczna siatki nie porusza się w obrębie igły. Gdy sonda elektroniczna siatki zaczyna poruszać się w igle, użyj ramki stereotaktycznej, aby cofnąć igłę z taką samą szybkością, z jaką wstrzykiwana jest sonda elektroniczna siatki, używając zaznaczonej oryginalnej pozycji elektroniki siatkowej jako prowadnicy.
Kontynuuj przepływ soli fizjologicznej i cofanie igły, aż igła opuści czaszkę. Następnie zatrzymaj przepływ z pompy strzykawkowej. W tej procedurze użyj ramy stereotaktycznej, aby ostrożnie poprowadzić igłę do płaskiego, elastycznego podłoża zaciskającego w poprzek szczeliny, przepływając roztwór za pomocą pompy strzykawkowej, aby wytworzyć luz w połączeniach elektroniki siatkowej.
Gdy igła znajdzie się nad podłożem zaciskowym i w poprzek szczeliny, wznowij przepływ z dużą szybkością, aby wstrzyknąć elektrotechnikę siatkową i podkładki wyjściowe na podłoże zaciskowe. Za pomocą pęsety i pipety z wodą dejonizowaną zegnij wkładkę, wyjdź podkładki pod kątem 90 stopni jak najbliżej pierwszej podkładki wejściowej, wyjściowej. Po wejściu podkładki wyjściowe są wyrównywane i składane, a następnie pod kątem 90 stopni do trzpienia siatki wysuszyć je na miejscu delikatnie przepływającym sprężonym powietrzem.
Przyciąć podłoże zaciskowe na krawędzi cieśniny około 0.5 do jednego milimetra od krawędzi podkładek wejściowych, wyjściowych. Należy również odciąć obce części podłoża zaciskowego, które utrudnią włożenie do 32-kanałowego złącza zif zamontowanego na płytce drukowanej. Następnie włóż pola wejściowe, wyjściowe do złącza zif na płytce drukowanej i zamknij zatrzask.
Użyj elektroniki pomiarowej, aby zmierzyć impedancję między kanałami a śrubą uziemiającą, aby potwierdzić pomyślne połączenie. Jeśli wartości impedancji są zbyt wysokie, odblokuj złącze zif, wyreguluj włożenie i przetestuj ponownie, aż zostanie potwierdzone pomyślne połączenie. Następnie zakryj złącze zif i odsłonięte połączenia elektroniczne siatki cementem dentystycznym w celu ochrony.
Odwróć płytkę drukowaną w szczelinie w podłożu i przymocuj płytkę drukowaną za pomocą cementu do czaszki myszy. W przypadku swobodnie poruszających się nagrań, zwolnij mysz z ogranicznika po włożeniu płytki PCB przedwzmacniacza i uziemieniu odniesienia. Nagrywaj przez żądany czas za pomocą systemu akwizycji danych, podczas gdy mysz zachowuje się swobodnie.
Pokazano tutaj reprezentatywne mapy cieplne pola lokalnego z 32-kanałowych sond elektronicznych typu mesh wstrzykniętych do hipokampa myszy i kory somatosensorycznej. Dane zostały zarejestrowane, gdy mysz swobodnie eksplorowała swoją klatkę po dwóch miesiącach i czterech miesiącach od wstrzyknięcia. Amplituda potencjału pola lokalnego jest oznaczona kolorami zgodnie z kolorowym paskiem po prawej stronie.
Ślady filtra górnoprzepustowego, czarne, pokazujące aktywność impulsową, są nakładane na spektrogram dla każdego z 32 kanałów. Oto skok wyizolowany po posortowaniu wykreślonych danych. Aktywność skokową pojedynczej jednostki wykryto na 26 z 32 kanałów, zarówno dwa miesiące po wstrzyknięciu, jak i cztery miesiące po wstrzyknięciu.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przetestowaniu interfejsu I/O w celu potwierdzenia pomyślnego połączenia elektrycznego z sondą elektroniki siatkowej. Pomiar impedancji pomaga w rozwiązywaniu problemów ze źródłem wszelkich problemów i ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji problemów z interfejsem lub produkcją. Po tej procedurze można wykonać histologię w celu zbadania środowiska komórkowego wokół każdej zarejestrowanej elektrody.
W przeciwieństwie do konwencjonalnych, sztywnych sond mózgowych, elektronika siatkowa może pozostać w tkance podczas histologii, co umożliwia precyzyjne skorelowanie danych elektrofizjologicznych z analizą immunohistochemiczną.
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje zastosowanie elektroniki siatkowej (mesh electronics) do stabilnej, długoterminowej rejestracji aktywności na poziomie pojedynczych neuronów w mózgu. Opisuje on proces wytwarzania i implantacji, kładąc nacisk na bezszwową integrację z tkanką nerwową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Inżynieria neuronalna
Wstęp
- Sondy elektroniczne w formie siatki umożliwiają przeprowadzanie eksperymentów in vivo.
- Nie wywołują one przewlekłej odpowiedzi immunologicznej w postaci gliozy.
- Technika ta pomaga w zrozumieniu starzenia się, rozwoju oraz chorób mózgu.
- Stabilne pomiary mogą usprawnić gromadzenie danych w badaniach z zakresu neuronauki.
Cel badania
- W celu wytworzenia elektroniki siatkowej do implantacji w mózgu.
- W celu dostarczenia szczegółowego protokołu dla badaczy.
- W celu zademonstrowania zalet elektroniki siatkowej w rejestracji aktywności neuronalnej.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie elektroniki siatkowej z wykorzystaniem fotolitografii.
- Ładowanie elektroniki siatkowej do igieł w celu iniekcji.
- Iniekcja stereotaktyczna do mózgów myszy.
- Analiza histologiczna tkanek po implantacji.
Główne wyniki
- Skuteczna integracja elektroniki siatkowej z tkanką nerwową.
- Stabilne rejestracje z pojedynczych neuronów przez dłuższe okresy.
- Przeprowadzenie procedury przez przeszkolonych badaczy.
- Walidacja metody poprzez badanie histologiczne.
Wnioski
- Elektronika siatkowa stanowi obiecujące narzędzie w badaniach nad neuronauką.
- Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie funkcji mózgu oraz schorzeń neurologicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie różnych stanów neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektronika w formie siatki wstrzykiwanej strzykawką rozwiązuje krytyczny problem w badaniach i rozwoju w dziedzinie neuronauki: uzyskanie stabilnych, długoterminowych zapisów neuronalnych bez wywoływania przewlekłej odpowiedzi immunologicznej lub degradacji sygnału. Technologia ta umożliwia predykcyjne zmniejszenie ryzyka w badaniach walidacji celów terapeutycznych poprzez zapewnienie niezawodnego śledzenia pojedynczych neuronów przez dłuższe okresy, co wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną. Bezproblemowa integracja z tkanką redukuje zmienność biologiczną, zwiększając powtarzalność danych w celu potwierdzenia celów oraz selekcji projektów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez stabilną detekcję aktywności impulsowej pojedynczych jednostek w wielu obszarach mózgu przez okres wielu miesięcy.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez minimalizację niestabilności sygnału indukowanej gliozą, co zmniejsza zmienność w podłużnych badaniach nad angażowaniem celu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w starzenie się, rozwój i patogenezę poprzez korelację elektrofizjologii z analizą histologiczną.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Zapewnia standaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę do ilościowego pomiaru aktywności neuronalnej, umożliwiając wiarygodną ocenę związków w modelach swobodnie poruszających się.
- Skalowalność: Elektronika siatkowa może być wytwarzana za pomocą standardowej fotolitografii, co pozwala na adaptację w wielu potokach walidacji celów.
- Standaryzacja wyników: Generuje spójne dane dotyczące lokalnych potencjałów polowych oraz danych po sortowaniu impulsów (spike-sorting), co wspiera międzyfunkcyjne porównywanie interwencji farmakologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Bezpośrednio wspiera badania procesów starzenia, rozwoju mózgu oraz patogenezy chorób poprzez przewlekłe interfejsowanie bez wywoływania gliozy.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia precyzyjną korelację danych elektrofizjologicznych z analizą immunohistochemiczną, co wzmacnia spójność w określaniu biomarkerów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Stabilne rejestracje w skali rocznej zwiększają pewność w wyborze celów przedklinicznych oraz w decyzjach dotyczących identyfikacji głównych kandydatów na leki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnej walidacji celu po badania przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i funkcjonalną walidację celów poprzez detekcję aktywności impulsowej pojedynczych jednostek w 26 z 32 kanałów zarówno dwa, jak i cztery miesiące po iniekcji.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych rejestracji neuronalnych u swobodnie poruszających się myszy, co ułatwia wiarygodne przesiewanie związków i ocenę zaangażowania celu.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych, w tym amplitudę lokalnego potencjału polowego oraz posortowane ślady impulsów, umożliwiając porównania statystyczne między różnymi warunkami i punktami czasowymi.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając wykonanie badań histologicznych na tkance z implantem, co pozwala na precyzyjną korelację elektrofizjologii z otoczeniem komórkowym.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Produkcja opiera się na standardowej fotolitografii, co pozycjonuje tę technologię jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w wielu programach badawczych z zakresu neuronauki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu dzięki przewlekłemu, stabilnemu śledzeniu pojedynczych neuronów bez utraty sygnału wywołanej odpowiedzią immunologiczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność dzięki wytwarzaniu opartemu na fotolitografii oraz wstrzykiwaniu stereotaktycznemu przy użyciu standardowych igieł kapilarnych.
- Wartość strategiczna: Ulepszenie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach, związanego ze zmiennością oddziaływania na cel w modelach przewlekłych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów w programach dotyczących chorób neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych z uwzględnieniem ryzyka, dzięki niezawodnemu gromadzeniu danych podłużnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu inżynierii neuronowej, fotolitografii oraz chirurgii stereotaksycznej w celu pomyślnej prefabrykacji i implantacji.
- Metoda zależy od dostępu do odparowywaczy termicznych, ekspozytorów masek oraz ram stereotaksycznych z pompami strzykawkowymi do precyzyjnego wprowadzania elektroniki siatkowej.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa pomiędzy zespołami zajmującymi się prefabrykacją, chirurgią i elektrofizjologią, aby zapewnić spójną obsługę i interfejsy sond.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie wymiarów siatki i gęstości elektrod do różnych obszarów mózgu i systemów modelowych przy jednoczesnym zachowaniu ultrawelastyczności.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ostrożnego obchodzenia się z sondą podczas ładowania do igły i wstrzykiwania w celu zapobieżenia jej uszkodzeniu, co zaznaczono w krokach procedury dotyczących wycofywania igły przy dopasowanych prędkościach przepływu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Fabrication of Mesh Electronics
3:59
Loading of Mesh Electronics into Needles
4:32
Stereotaxis Injection of Mesh Electronics into Live Mouse Brain
6:16
Input/output Interfacing
8:06
Neural Recording Experiments
8:25
Results: Representative Neural Recording Results
9:17
Conclusion
