Name: Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali i rekonstytucji metaloenzymu znakowanego polihistydyną. Protokół ten umożliwia studentom oczyszczanie i badanie struktury oraz funkcji żelazowych enzymów w laboratorium dydaktycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja jest oparta na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr CHE 1708237.

1. Przygotowanie do Oczyszczenia
<ol>
	<li>Przygotowanie bezkomórkowego ekstraktu surowego
	<ol>
		<li>Uzyskaj ~ 9-10 g granulki komórkowej E. coli (BL21), która wykazała nadekspresję metaloproteiny znakowanej polihistydyną25 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Dodaj 5 ml na gram buforu do lizy/wiązania w temperaturze pokojowej (50 mM fosforanu, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu o pH 8) do ~9-10 g osadu komórkowego, aby uzyskać całkowitą objętość ~ 45-50 ml. Okresowo wiruj, aby zachęcić do rozpuszczenia. Jeśli granulka została zamrożona, rozmrozić w letniej łaźni wodnej.</li>
		<li>Używając kąpieli lodowatej wody, schłodzić zawiesinę komórek do ~3 °C w celu przygotowania do lizy komórek. 
		Uwaga: W tym momencie możliwa jest liza komórek za pomocą sonikacji, mielenia perełkowego lub innej metody. Frezowanie ściegów jest tutaj pokazane, ponieważ jest szybkie, stosunkowo niedrogie i nie wymaga ochrony słuchu.</li>
		<li>Zamontuj komorę do mielenia kulek o pojemności 50 ml zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Napełnij komorę młynka do perełek do połowy schłodzonymi kulkami szklanymi o średnicy 0,1 mm, które były przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Napełnij pozostałą część komory zawiesiną schłodzonych komórek i użyj buforu do lizy/wiązania w temperaturze 4 °C, aby całkowicie napełnić komorę.</li>
		<li>Użyj małej szpatułki, aby obrócić wałek młynka do perełek i wymieszaj zawiesinę komórek z kulkami.</li>
		<li>Usuń wszelkie duże bąbelki za pomocą pipety, a następnie zakręć pokrywkę.</li>
		<li>Osuszyć komorę z wszelkich wycieków.</li>
		<li>Dodaj około 1 szklanki lodu do przezroczystej, plastikowej osłony, odwróć napełnioną komorę o pojemności 50 ml do wypełnionej lodem kurtki i zakręć.</li>
		<li>Przymocuj komorę z płaszczem lodowym do silnika.</li>
		<li>Włącz silnik młynka perełkowego na 15 sekund przy 15 800 obr./min, a następnie pozostaw na 45 sekund. Powtórz 8 razy.</li>
		<li>Po zakończeniu 8 cykli zdekantować całą zawiesinę do lizy komórek do probówki o pojemności 50 ml lub większej przystosowanej do wirowania z dużą prędkością (25 000 x g lub więcej). Umieść parę zrównoważonych probówek w wirówce i wiruj w temperaturze 25 000 x g przez 40-45 minut w temperaturze 4°C, aby osadzać resztki komórek i szklane kulki. 
		Uwaga: Jeśli probówki o pojemności 50 ml lub większe przeznaczone do wirowania z dużą prędkością nie są dostępne, usuń szklane kulki, odwirowując przy 1000 - 2000 x g przez 2-3 minuty w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby uzyskać mniejszą objętość zawiesiny komórek (~ 25 ml), którą można zdekantować do probówki o mniejszej objętości przystosowanej do wirowania z dużą prędkością.</li>
		<li>Po zakończeniu wirowania zdekantować klarowne, żółte, bezkomórkowe, surowe ekstrakty do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Uważaj, aby nie przenosić żadnych resztek komórek.</li>
		<li>Pobrać małą próbkę bezkomórkowych ekstraktów surowych do późniejszej analizy oczyszczania za pomocą SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kolumny IMAC
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w kolumnę o wymiarach 1,5 x 20 cm wyposażoną w dolny wspornik łoża zatrzymujący cząstki żywicy, wylot Luer lock i górną nasadkę, która zawiera również złączkę Luer lock. Zamontuj wylot Luer-lock w zawór odcinający, aby kontrolować przepływ.</li>
		<li>Pracując przy blacie, bezpiecznie zamontuj kolumnę na stojaku pierścieniowym.</li>
		<li>Otrzymać 50% zawiesinę żywicy kwasu nitrylooctowego na bazie niklu (Ni-NTA) w 20% etanolu, który był przechowywany w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Delikatnie zakręć butelką, aby równomiernie zawiesić żywicę.</li>
		<li>Pracując w temperaturze pokojowej i na blacie stołu, użyj pipety z podziałką, aby pobrać 2 ml zawiesiny, co da 1 ml osiadłej żywicy zdolnej do związania 50-60 mg białka znakowanego polihistydyną i przenieś zawiesinę do kolumny.</li>
		<li>Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby nadmiar roztworu do przechowywania spłynął grawitacyjnie z żywicy.</li>
		<li>Dokładnie zamknij zawór odcinający</li>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodać schłodzony bufor do lizy/wiązania (50 mM fosforanu, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu o pH 8) i do kolumny z żywicą – co najmniej 30 ml. Uważaj, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu.</li>
		<li>Zrównoważyć żywicę, pozwalając buforowi do lizy/wiązania powoli spływać grawitacyjnie z kolumny do zlewki zbiorczej.</li>
		<li>Gdy bufor do lizy/wiązania zostanie w większości opróżniony, zamknij kurek, aby zatrzymać przepływ buforu, gdy ~ 5 ml buforu do lizy pozostanie nad żywicą i pozostaw kolumnę, zamontowaną pionowo, do momentu gotowości do kontynuowania lub na okres do 1 tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie celu oznaczonego polihistydyną przez IMAC
<ol>
	<li>Przygotować bufor do przemywania (50 mM fosforanu, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu pH 8) i bufor elucyjny (50 mM fosforan, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, 10% glicerolu pH 8). Schłodzić w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przygotować kolumnę Ni-NTA do dodania bezkomórkowych ekstraktów surowych, otwierając zawór odcinający i pozwalając, aby pozostały bufor do lizy/wiązania spływał grawitacyjnie przez żywicę Ni-NTA. Gdy cały bufor zostanie opróżniony, a powierzchnia żywicy zostanie odsłonięta, zamknij kurek.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie odpipetuj surowe ekstrakty wolne od komórek na żywicę, uważając, aby nie naruszyć powierzchni. Sprowadź surowe ekstrakty po ściankach kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Objętość zastosowanych ekstraktów surowych zależy od poziomu ekspresji białka znakowanego polihistydyną; upewnić się, że całkowita objętość ekstraktów surowych zawiera 50-60 mg lub mniej białka docelowego na ml żywicy Ni-NTA (patrz krok 1.2.4).</li>
	<li>Gdy wszystkie ekstrakty surowe zostaną przeniesione do kolumny, otwórz kurek, aby kolumna mogła spłynąć grawitacyjnie. Przepływ ten składa się z białek, które nie związały się z żywicą – należy zebrać 100 μl do późniejszej analizy oczyszczania za pomocą SDS-PAGE. 26</li>
	<li>Lepkość bezkomórkowych ekstraktów surowych może znacznie spowolnić przepływ grawitacyjny kolumny. Aby zwiększyć natężenie przepływu, zastosuj prostą "pompę ręczną":
	<ol>
		<li>Wziąć strzykawkę Luer-lock o pojemności 10 ml i podłączyć ją do nasadki kolumny za pomocą krótkiego odcinka plastikowej rurki i łączników Luer-lock między nasadką kolumny a strzykawką. Wyciągnąć tłok strzykawki, a następnie mocno założyć nasadkę kolumny na jej górną część.</li>
		<li>Delikatnie ścisnąć tłok strzykawki, jednocześnie ręcznie oceniając natężenie przepływu, zbierając eluent do cylindra z podziałką; dawki 1-2 ml na minutę są zgodne z żywicą i tym ustawieniem. Delikatnie zwiększać nacisk tłoka strzykawki w miarę zmniejszania się szybkości przepływu.</li>
		<li>Aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do żywicy, zdejmij nasadkę kolumny i dołączoną pompę ręczną, gdy menisk nałożonej cieczy osiągnie 5-10 mm powyżej złoża żywicy i pozwól, aby pozostała objętość spłynęła grawitacyjnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy bezkomórkowe ekstrakty surowe zakończą odsączanie, a powierzchnia żywicy zostanie ponownie odsłonięta, użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie dodać ~30 ml schłodzonego buforu do płukania do kolumny – uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu.</li>
	<li>Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby bufor płuczący spłynął przez kolumnę. Proces ten polega na usuwaniu słabo związanych białek z żywicy. Wyrzucić eluent.</li>
	<li>Podczas opróżniania buforu płuczącego przygotuj szesnaście oznakowanych probówek do mikrowirówek do zbierania frakcji o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Gdy bufor płuczący zostanie opróżniony, a powierzchnia żywicy zostanie ponownie odsłonięta, zamknij kurek. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodaj ~30 ml schłodzonego buforu elucyjnego do kolumny – uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu.</li>
	<li>Powoli otworzyć kran i pozwolić, aby bufor elucyjny wymył białko znakowane polihistydyną z kolumny. Zebrać 1 ml eluentu w każdej z zaznaczonych probówek do mikrowirówek, od 1 do 16.</li>
	<li>Przetestuj frakcje pod kątem białka za pomocą kolorymetrycznego testu białkowego, takiego jak test Bradforda lub spektroskopia UV-widzialna, zgodnie z metodami określonymi przez producentów odczynnika i/lub instrumentu27,28. Jak pokazano tutaj, test kolorymetryczny przy użyciu błękitu Coomassie jest skalowany w dół do objętości 100 μl, aby poświęcić tylko niewielką objętość z każdej frakcji.</li>
	<li>Zmieszać 3 μl każdej frakcji ze 100 μl odczynnika do kolorymetrycznego oznaczania białek i ręcznie obserwować tworzenie się dowolnego koloru, aby wskazać obecność białka we frakcji; wykrywanie za pomocą spektrometru nie jest konieczne.</li>
	<li>Jeśli białko zostanie znalezione we frakcji 16, kontynuuj elucję frakcji 1 ml i okresowo oznaczaj białko, aż eluowane frakcje nie będą już zawierać znacznej ilości białka.</li>
	<li>Połącz frakcje zawierające białko w czystej stożkowej probówce i pobierz próbkę o objętości 100 μl do późniejszej analizy za pomocą SDS-PAGE26.</li>
	<li>Przystąpić do rekonstytucji kofaktora jonów metalu lub zamrozić białko w 3 ml podwielokrotności w temperaturze -80°C. Upewnij się, że 10% glicerol jest zawarty w buforze elucyjnym, który jest krioprotektantem stabilizującym czyste białko podczas zamrażania.</li>
	<li>Po zakończeniu elucji kolumny Ni-NTA, to znaczy całe białko zostaje usunięte z kolumny i zebrane we frakcje, przepuść kolejne 25 ml buforu elucyjnego przez kolumnę i przechowuj kolumnę w temperaturze 4 °C w ~ 5 ml buforu elucyjnego do krótkotrwałego przechowywania lub buforu do lizy/wiązania z 20% etanolem do dłuższego przechowywania.</li>
</ol>
3. Rekonstytucja docelowego białka za pomocąFe2+
<ol>
	<li>Dodatek Fe2 + 
	Uwaga: Enzym wiążący żelazo (II) niehemowy, taki jak dioksygenaza L-DOPA w tym przykładzie, wymaga do działania jonuFe2+; jednak żelazo (II) łatwo utlenia się do żelaza (III), które jest nieaktywne, a część białka oczyszcza się bez żadnego żelaza.
	<ol>
		<li>Aby rozpocząć rozpuszczanie metalu, należy otrzymać 3 ml oczyszczonego enzymu zawieszonego w buforze elucyjnym. W przypadku zamrożenia szybko rozmrozić w letniej kąpieli wodnej, a po rozmrożeniu umieścić białko na lodzie.</li>
		<li>Korzystając z objętości białka w probówce, obliczyć ilość askorbinianu sodu (198,1 g/mol) niezbędną do uzyskania końcowego stężenia 12,5 mM w próbce. Należy również obliczyć ilość ditiotreitolu (DTT, 154,25 g/mol) niezbędną do uzyskania końcowego stężenia 12,5 mM w próbce.</li>
		<li>Dodaj stały askorbinian sodu i DTT i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Uważaj, aby nie spowodować wytrącania się białka przy zbyt agresywnym mieszaniu. Dodać niewielką ilość siedmiowodnego siarczanu żelaza (II) (MW 278,01 g/mol) do próbki białka.</li>
		<li>W celu uzyskania wystarczająco małej ilości soli żelaza, należy wystukać kilka 1 mm granulek FeSO4•7H2O w postaci stałej na kawałku papieru wagowego, złożyć papier na granulce i rozgnieść go płaską stroną metalowej szpatułki.</li>
		<li>Dodaj ziarno powstałego proszku do probówki z białkiem.</li>
		<li>Wir do wymieszania, a w tubie pojawi się różowo-różowy kolor.</li>
		<li>Inkubować różowy roztwór białka, pod nakrętką, przez 10-30 minut na lodzie. Różowy kolor z czasem powoli blaknie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Filtracja żelowa
	<ol>
		<li>Użyj żelowej kolumny filtracyjnej wypełnionej 10 ml sferycznego żelu poliakrylamidowego o limicie wyłączenia masy cząsteczkowej około 6 000 i uwodnionym zakresie wielkości cząstek 90–180 μm w kolumnie o wymiarach 1,5 x 12 cm, która jest również wyposażona w zbiornik o pojemności 10 ml. Upewnij się, że kolumna jest wyposażona w dolne i górne wsporniki łoża w postaci porowatych krążków polietylenowych o średnicy 30 μm, aby zatrzymać żywicę w kolumnie i zapobiec wysychaniu złoża żywicy. Zamontuj kolumnę filtracyjną żelu na stojaku pierścieniowym.</li>
		<li>Jeśli używasz wstępnie zapakowanej żelowej kolumny filtracyjnej, zdejmij nakrętkę i odlej nadmiar buforu powyżej górnego wspornika łoża.</li>
		<li>Aby zrównoważyć kolumnę, należy rozpocząć od napełnienia zbiornika buforem zgodnym z późniejszym oznaczaniem i przechowywaniem, na przykład 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolu o pH 8,0.</li>
		<li>Jeśli używasz wstępnie zapakowanej żelowej kolumny filtracyjnej, oderwij dolną końcówkę żelowej kolumny filtracyjnej, aby rozpocząć przepływ bufora i odsłonić złączkę Luer slip. Zamontuj kran na końcu Luer slip kolumny, ale pozostaw go otwartym i pozwól, aby kolumna kapała grawitacyjnie.</li>
		<li>Gdy bufor spuści się z kolumny, a górna podpora łoża zostanie odsłonięta, zamknij zawór odcinający i dodaj ~ 3 ml metaloenzymu odtworzonego w Fe (II) do kolumny, pipetując roztwór na odsłonięty górny wspornik łoża.</li>
		<li>Otworzyć zawór odcinający i pozwolić, aby cała próbka o objętości 3,0 ml dostała się grawitacyjnie do kolumny. Wyrzuć te pierwsze 3 ml eluentu. Każdy różowy kolor, który utworzy się podczas obchodzenia się z roztworem, zostanie uwięziony w górnej części kolumny.</li>
		<li>Gdy kolumna przestanie kapać, a górny wspornik złoża zostanie odsłonięty, dodać 4 ml żelowego buforu filtracyjnego (np. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolu o pH 8,0) do kolumny. Otwórz zawór odcinający i zbierz eluent do probówek mikrowirówek o objętości ponad 8,5 ml frakcji.</li>
		<li>Przetestuj frakcje pod kątem białka za pomocą kolorymetrycznego testu białkowego lub UV-Vis27,28, jak opisano wcześniej.</li>
		<li>Połącz frakcje zawierające białko.</li>
		<li>Pobrać próbkę do analizy SDS-PAGE26.</li>
		<li>Przystąpić do oznaczania lub przechowywania próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1188-1321">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321(1988).</li>
<li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687909630275">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li>
<li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwitzer%2C+RL+%22Experimental+Biochemistry%22">Experimental Biochemistry</a>. , Macmillan. (1999).</li>
<li>Boyer, R. <a target="_blank" href="https://www.pearson.com/us/higher-education/program/Boyer-Modern-Experimental-Biochemistry-3rd-Edition/PGM122783.html">Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition</a>. , (2001).</li>
<li>le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ale+Maire%2C+M+%22Laboratory+Guide+to+Biochemistry%2C+Enzymology%2C+and+Protein+Physical+Chemistry%3A+A+Study+of+Aspartate+Transcarbamylase%22">Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase</a>. , Springer Science & Business Media. (2012).</li>
<li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBettelheim%2C+FA+%22Laboratory+Experiments+for+General%2C+Organic%2C+and+Biochemistry%22">Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2013).</li>
<li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed065p901">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901(1988).</li>
<li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed068p430">Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430(1991).</li>
<li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+mutation+to+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students%3A+An+illustration+of+protein+expression+and+purification%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li>
<li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li>
<li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li>
<li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKay%2C+BK+%22Phage+Display+of+Peptides+and+Proteins%3A+A+Laboratory+Manual%22">Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual</a>. , Elsevier. (1996).</li>
<li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21591176">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li>
<li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li>
<li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+writing-intensive%2C+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%3A+A+Bimonthly+Publication+of+the+International+Union+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li>
<li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization%3A+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Known+structure%2C+unknown+function%3A+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li>
<li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/metalloenzymes-use-of-recombinant-protein-expression-and-affinity-tags-to-aid-identification-of-native-metal-ion-cofactors-2161-1009.1000132.php?aid=11177">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li>
<li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/3527600906.mcb.200400107/abstract">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li>
<li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470048672.wecb327/abstract">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li>
<li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="https://Link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-485-2:257">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e45">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li>
<li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2%2C3-dioxygenase%2C+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li>
<li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+overexpression%2C+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2%2C3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li>
<li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li>
<li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis%3A+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li>
<li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016748389390013H">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li>
<li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2%2C3-Dihydroxyphenylpropionate+1%2C2-Dioxygenase+%28MhpB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li>
<li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246%2C+His-199%2C+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2%2C3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li>
<li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC%2C+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li>
<li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podczas gdy dodawanie znaczników polihistydynowych do białek rekombinowanych i ich oczyszczanie za pomocą IMAC stało się praktycznie wszechobecne w literaturze biochemicznej 3,4,5, zastosowania IMAC do oczyszczania enzymów w laboratorium dydaktycznym biochemii pozostają rzadkie, a opublikowane metody nie zawsze uwzględniają ograniczenia zasobów laboratorium dydaktycznego20. Co więcej, zastosowanie IMAC w laboratorium dydaktycznym jest najbardziej efektywne w połączeniu z eksperymentami, które oceniają aktywność i czystość, co sprawia, że oczyszczanie enzymu przez IMAC jest idealną czynnością instruktażową. Aby rozszerzyć zastosowanie IMAC na oczyszczanie enzymów, w tym metaloenzymów, w laboratorium dydaktycznym, potrzebne są niezawodne i niedrogie metody. W tym protokole demonstrujemy stacjonarny IMAC przy użyciu łatwo dostępnych i niedrogich materiałów laboratoryjnych, jednocześnie odnosząc się do ograniczeń w stosowaniu IMAC do metaloprotein22, poprzez odtworzenie metaloenzymu zależnego od żelaza(II), dioksygenazy L-DOPA, po oczyszczeniu. Korzystając z opisanych odczynników i materiałów, szacujemy, że koszt materiałów eksploatacyjnych dla ośmiu grup studenckich wynosi od 500 do 600 USD za semestr w celu uruchomienia tego protokołu, w tym kroków analizy przedstawionych na rysunku 1 i rysunku 2.
Ze względu na łatwość, z jaką Fe2+ może dysocjować od ligandów aminokwasowych24 i łatwe utlenianie Fe2+ przez O2 do Fe3+, rekonstytucja niehemowego, chelatowanego aminokwasami żelaza(II) do rekombinowanego metaloenzymu jest typowym składnikiem oczyszczania enzymatycznego. Gdy stosuje się chromatografię klasyczną, w niektórych przypadkach można uniknąć całkowitej utraty żelaza32, ale częściej żelazo (II) jest dodawane z powrotem w obecności czynników redukujących 33,34,35,36 często w atomosferze beztlenowej 37,38,39, a w niektórych przypadkach nadmiar żelaza nie jest usuwany 33, 34,36, co komplikuje wszelkie późniejsze testy. Następujące po sobie etapy klasycznej chromatografii i atmosfery beztlenowej nie są realistyczne dla laboratorium licencjackiego, co skłoniło do opracowania tego protokołu.
Podczas gdy ręczne przygotowanie kolumny Ni-NTA i przetwarzanie próbek w dużej mierze grawitacyjnie wymaga dodatkowego czasu i wysiłku w porównaniu z wstępnie zapakowanymi kolumnami i automatycznym oprzyrządowaniem chromatograficznym, kroki ręczne pozwalają na praktyczną naukę przez ucznia, która skutkuje lepszym zrozumieniem nauki stojącej za tym procesem. Dodanie soli żelaza (II) w warunkach opisanych tutaj jest szczególnie wrażliwe na nadmiar ditiotreitolu. Jeśli uczeń omyłkowo doda nadmiar ditiotreitolu, prawdopodobne jest wystąpienie opadów. Stwierdziliśmy, że pomocne jest wymaganie od studentów wykonania obliczeń ilości odczynników przed przybyciem do laboratorium, aby czas laboratoryjny mógł być jak najefektywniej wykorzystany na stanowisku laboratoryjnym. Całe oczyszczanie IMAC na stole - od lizy komórek do elucji białek - można przeprowadzić w jednym 4-godzinnym okresie laboratoryjnym, a następnie w kolejnym okresie laboratoryjnym rekonstytucji i testie.

Pierwsze doniesienia o oczyszczaniu białka oznaczonego polihistydyną z ekstraktów organizmu gospodarza za pomocą chelatacji znacznika histydyny przez unieruchomiony metal weszły do literatury w 1988 roku1,2. Od tego czasu dodawanie znaczników polihistydyny do rekombinowanych białek i ich oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali (IMAC) stało się praktycznie wszechobecne w literaturze biochemicznej3,4,5. Metody oczyszczania IMAC mogą być wdrażane na stole laboratoryjnym, przy użyciu automatycznej chromatografii i w formatach kolumn wirowych. Podczas gdy metody oczyszczania powinowactwa, zwłaszcza IMAC, są szeroko stosowane w laboratorium badawczym, są mniej powszechne w laboratorium nauczania licencjackiego. Najczęściej używane podręczniki laboratoryjne dla laboratoriów biochemicznych nie uczą rutynowo tych metod, zamiast tego wybierają bardziej tradycyjną chromatografię jonowymienną lub chromatografię wiążącą barwnik6,7,8,9. Na przykład oczyszczanie dehydrogenazy mleczanowej przez Anderson10 wykorzystuje powinowactwo przez wiązanie barwnika, a oczyszczanie mleka krowiego α-laktoalbuminę7,11 autorstwa Boyera wykorzystuje matrycę kwasu niklowo-nitrylooctowego, ale bez rekombinowanego znacznika polihistydyny, opierając się zamiast tego na wewnętrznym powinowactwie białka do żywicy. Niektóre nowoczesne podręczniki i publikacje laboratoryjne dla studentów studiów licencjackich implementują chromatografię powinowactwa do unieruchomionych metali na celach białkowych oznaczonych polihistydyną, takich jak białka zielonej lub czerwonej fluorescencji12,13,14,15, przeciwciała16, oraz wybrane enzymy17,18,19,20, nawet niektóre z nieznanych funkcji21. Prawdopodobnie oczyszczanie enzymu jest preferowane w laboratorium dydaktycznym, ponieważ cel może być badany pod kątem aktywności w kolejnych sesjach, wzbogacając doświadczenie "prawdziwej nauki" ze strony studenta; Rzeczywiście, tego typu doświadczenia laboratoryjne zostały opublikowane, a korzystne wyniki w uczeniu się uczniów zostały zgłoszone17,18,20,21. A jednak zastosowania IMAC do oczyszczania enzymów w laboratorium nauczania biochemii pozostają rzadkie, a opublikowane metody mogą nawet zakładać dostęp do oprzyrządowania chromatograficznego, które zwykle nie jest dostępne do użytku w laboratorium klasowym20. Istnieją również ograniczenia w stosowaniu IMAC do metaloprotein, zwłaszcza tych, które wiążą wrażliwe na redoks metale dwuwartościowe, które są niezbędne do aktywności22. Często jon metalu jest tracony lub utleniany podczas oczyszczania, co daje nieaktywny enzym, który nie nadaje się do laboratorium licencjackiego.
Pełna jedna trzecia enzymów wiąże jon metalu23, i pomimo niemal powszechnego zapotrzebowania na żelazo we wszystkich formach życia23, żelazo jest prawdopodobnie jednym z najbardziej problematycznych jonów metali w enzymologii. Enzymy wiążąceFe2+ niehemowe są szczególnie podatne na utratę i/lub utlenianie metalu podczas IMAC; prawdopodobnie z powodu braku dedykowanego liganda organicznego, takiego jak hem, i łatwości, z jaką Fe2+ może dysocjować od ligandów aminokwasowych24. Ponadto zależne od tlenu utlenianie Fe2+ do Fe3 + jest spontaniczne w roztworze wodnym, ze względu na ujemną zmianę energii swobodnej i względną stabilność Fe3+. Często wyzwania te są pokonywane przy użyciu atmosfery beztlenowej i/lub metod chromatograficznych innych niż IMAC22. W tym artykule zademonstrujemy zastosowanie stacjonarnego IMAC do oczyszczania dioksygenazy metaloenzymu L-DOPA zależnej od Fe2 + przy użyciu prostych, niedrogich materiałów chromatograficznych, a następnie odtworzenia miejsca aktywnego Fe2 + i testu enzymatycznego. Metody te są standardem w naszym własnym laboratorium biochemii na studiach licencjackich liczącym od 6 do 12 grup studenckich i mogą być wykorzystywane do poszerzania repertuaru badań enzymatycznych na poziomie licencjackim.

<table><tbody><tr><td>materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater Koraliki szklane 0,1 mm</td><td>Produkty BioSpec</td><td>11079101</td><td>1 funt każda</td></tr><tr><td>50 ml Probówki stożkowe z nakrętkami, sterylne</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, jednozasadowy</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(II) siedmiowodny</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>żywicy HisPur NiNTA&nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do chromatografii ekonomiczno-kolumnowej - 1,5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1,5 x 20 cm, 35 ml, 2 szt.</td></tr><tr><td>Zawór odcinający, jednokierunkowy, żeński na męski luer</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>opakowanie 50</td></tr><tr><td>strzykawek BD 10 ml luer-loc (niesterylne, bez igły)</td> <td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Złączka do rurki: 1,6 mm Barb do żeńskiej Luer</td><td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Złączka do rurki: 1,6 mm Barb do męskiego Luer&nbsp;</td><td>Rurka silikonowa Biorad</td><td>7318225</td><td></td></tr><tr><td>(ścianka 1,6 mm ID/0,8 mm, do 0,2-5 ml/min na pompie perystaltycznej)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>Opakowanie 1,1,6 mm ID/0,8 mm ścianka, 10 m, niskociśnieniowe rurki do pracy z cieczami</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Test białka</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, zatrzask, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe jednorazowe pipety serologiczne Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna pompa do pipet Fiserbrand</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe Fisherbrand</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Econo-Pac 10DG</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>pudełko 30</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5x bufor do próbek</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (Rozcieńczyć 1:5 z próbką)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 dołków</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 żeli</td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe Fisherbrand, Metylakrylan</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>Przypadek 500</td></tr><tr><td>Nasadki kuwetowe Kwadratowe jednorazowe</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-dihydroksyfenyloalanina)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Stałe wyposażenie:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora BeadBeater 50mL&nbsp;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1-komorowy</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101</td><td>350 ml komora z poliwęglanu, zespół wirnika, podstawa silnika, płaszcz chłodzący lodowato i woda lodowata i jeden funt szklanych kulek.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, szybkoobrotowe PPCO, 50mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Pionowe ogniwo do elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra do mini żeli prefabrykowanych, 4-żelowe</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&nbsp; 4-żelowy system elektroforezy pionowej, zawiera zespół elektrod, towarzyszący moduł jezdny, zbiornik, pokrywę z zasilającymi, mini zaporę buforową ogniw</td></tr><tr><td>PowerPac HC Zasilacz</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100&ndash; 120/220&ndash; 240 V, zasilacz do zastosowań wysokoprądowych, zawiera przewód zasilający</td></tr><tr><td>UV-1800 z oprogramowaniem UV-Probe</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek</td><td>Corp wersja 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Stacjonarna chromatografia IMAC z immobilizowanym powinowactwem do metalu (Benchtop) białek znakowanych polihistydyną jest łatwo opanowana przez studentów studiów licencjackich i stała się najczęściej stosowaną metodą oczyszczania białek we współczesnej literaturze. Jednak zastosowanie chromatografii powinowactwa do białek wiążących metale, zwłaszcza tych z metalami wrażliwymi na redoks, takimi jak żelazo, jest często ograniczone do laboratoriów z dostępem do schowka na rękawiczki - sprzętu, który nie jest rutynowo dostępny w laboratorium licencjackim. W tym artykule demonstrujemy nasze laboratoryjne metody izolacji, oczyszczania IMAC i rekonstytucji metalowo-jonowej dioksygenazy ekstratelelowej znakowanej polihistydyną, aktywnej redoks, niehemowej wiążącej żelazo dioksygenazy oraz oznaczanie dioksygenazy z różnymi stężeniami substratów i nasycaniem tlenu. Metody te są wykonywane przez studentów studiów licencjackich i wdrażane w laboratorium dydaktycznym i badawczym z oprzyrządowaniem, które jest dostępne i niedrogie głównie w instytucjach licencjackich.

Te reprezentatywne wyniki zostały zebrane przez studentów studiów licencjackich podczas realizacji niniejszego protokołu w trakcie dwóch laboratoryjnych zajęć w ramach kursu BCM 341: Experimental Biochemistry w Muhlenberg College. Rysunek 1 przedstawia wyniki oczyszczania metaloenzymu o masie 20 kDa z poli-histydynowym tagiem, L-DOPA dioxygenazy, przeprowadzonego przez dwóch studentów podczas 4-godzinnych zajęć laboratoryjnych i przeanalizowanego za pomocą SDS-PAGE przez tych samych studentów podczas kolejnych zajęć. Białko z poli-histydynowym tagiem zostało skutecznie oczyszczone (Rysunek 1, ścieżka 2). Immunoblot żelu z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko tagowi poli-histydynowemu wskazuje, że niewielka ilość docelowego białka z poli-histydynowym tagiem została utracona w frakcji przepływowej (dane nie zostały przedstawione), prawdopodobnie dlatego, że ilość białka docelowego w lizacie, przekraczająca 100 mg, przekroczyła pojemność wiążącą żywicy.
Rysunek 2 przedstawia zebrane przez studentów dane dotyczące aktywności enzymatycznej docelowego metaloenzymu z tagiem poli-histydynowym, L-DOPA dioxygenazy, po rekonstytucji żelazem (II) i następującej po niej filtracji żelowej zgodnie z opisanym w niniejszym protokole sposobem. Pięciosekundowy czas martwy przed rozpoczęciem gromadzenia danych jest typowy dla studentów wykonujących tę technikę po raz pierwszy. Wysoka aktywność metaloenzymu została wykryta przy użyciu opisanego w literaturze testu, co pozwoliło na wyznaczenie parametrów kinetyki stanu stacjonarnego zgodnych z opublikowanymi wynikami29. Parametry kinetyki stanu stacjonarnego określono poprzez dopasowanie krzywych postępu30 przedstawionych na Rysunku 2; możliwa jest jednak również nieliniowa metoda najmniejszych kwadratów dla szybkości początkowych zebranych dla szeregu stężeń substratu31.
<img alt="Wyniki elektroforezy białek, marker masy cząsteczkowej, separacja prążków, eksperyment, schemat żelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. SDS-PAGE26 analiza białka z przyłączonym znacznikiem poli-histydynowym przed, w trakcie i po oczyszczaniu. Ścieżki: 1 – markery masy cząsteczkowej, 2 – oczyszczone białko (20 kDa) po chromatografii Ni-NTA, 3 – frakcja niezatrzymana z kolumny Ni-NTA, 4 – surowe ekstrakty bezkomórkowe przed oczyszczaniem, 5 – osad z debris komórkowych po lizie. Próbki przygotowano z użyciem 5x buforu do nakładania próbek (loading buffer) i rozdzielono na gotowych żelach poliakrylamidowych 4-20% przy użyciu systemu elektroforezy żelowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres spektroskopii absorpcyjnej przejściowej przy 414 nm przedstawiający absorpcję w czasie 80 sekund." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Pomiar w stanie stacjonarnym metaloenzymu zrekonstytuowanego żelazem (II) (tj. L-DOPA-dioksygenaza, 10µM) z substratem (L-DOPA - 5 µM (czerwony), 25 µM (zielony), 50 µM (niebieski)) w buforze (50 mM fosforanu, 20 mM NaCl, pH 8). Krzywe przedstawiają powstawanie produktu przy 414 nm. Dane o absorbancji pozyskiwano w sposób ciągły przy użyciu kuwet metakrylowych o objętości 1 ml w skanującym spektrometrze UV-Vis z rozdzieleniem wiązki.29Surowe dane dopasowano do modelu przybliżenia stanu stacjonarnego Michaelisa-Menten (KM 30.8 µM ± 14,4, kkotpozorny 2,3 s-1 ± 0.05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Metoda ta pozwala studentom studiów licencjackich szybko oczyścić metaloenzymy wiążące żelazo, a następnie wykorzystać to białko do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące struktury i funkcji, a wszystko to w ramach laboratorium dydaktycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona zastosowanie do enzymów wiążących żelazo niehemowe. Jest dostępny dla studentów studiów licencjackich i można go łatwo wdrożyć w laboratorium dydaktycznym.Aby rozpocząć tę procedurę, należy zaopatrzyć się w kolumnę o wymiarach 1,5 na 20 centymetrów wyposażoną w wylot typu luer lock, górną nasadkę, która zawiera również złączkę typu luer lock, oraz dolny wspornik łoża, który zatrzymuje cząstki żywicy. Zamontuj dolną złączkę luer lock z kurkiem, aby kontrolować przepływ. Następnie zdobądź butelkę zawierającą 50% zawiesinę żywicy kwasu nitrylooctowego związanego niklem w 20% etanolu, który był wcześniej przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Delikatnie zakręć butelką, aby równomiernie zawiesić żywicę. Pracując w temperaturze pokojowej, za pomocą pipety miarowej pobrać dwa milimetry gnojowicy i przenieść ją do kolumny. Po spuszczeniu nadmiaru roztworu do przechowywania z żywicy, użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie dodać co najmniej 30 mililitrów schłodzonego buforu do lizy, uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy.Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Zrównoważyć żywicę, pozwalając buforowi na powolny odpływ grawitacyjny z kolumny do zlewki zbiorczej. Na początek należy przygotować kolumnę nikiel-NTA do dodania bezkomórkowych ekstraktów surowych, otwierając zawór odcinający i pozwalając, aby pozostały bufor wiążący lizę spłynął grawitacyjnie przez żywicę niklowo-NTA.Gdy bufor całkowicie opróżni się, a powierzchnia żywicy zostanie odsłonięta, zamknij kurek. Następnie za pomocą pipety Pasteura ostrożnie odpipetuj bezkomórkowe surowe ekstrakty na żywicę, uważając, aby nie naruszyć powierzchni. Sprowadź surowe ekstrakty w dół ściany kolumny, aby uniknąć rozpryskiwania.Po przeniesieniu wszystkich surowych ekstraktów do kolumny należy otworzyć zawór odcinający, aby kolumna mogła opróżnić się grawitacyjnie. Zbierz 100 mikrolitrów przepływu do późniejszej analizy. Użyj krótkiego odcinka plastikowej rurki, aby podłączyć 10-mililitrową strzykawkę typu luer lock do nasadki kolumny.Wyciągnąć tłok strzykawki, a następnie szczelnie napełnić nasadkę kolumny na górze kolumny. Delikatnie ścisnąć tłok, jednocześnie zbierając eluent do cylindra z podziałką, aby ręcznie ocenić natężenie przepływu. Dawki od jednego do dwóch mililitrów na minutę są kompatybilne z żywicą i konfiguracją eksperymentalną.Delikatnie zwiększać nacisk tłoka strzykawki w miarę zmniejszania się szybkości przepływu. Gdy menisk nałożonej cieczy osiągnie od pięciu do 10 mililitrów powyżej złoża żywicy, zdejmij nasadkę kolumny i dołączoną pompkę ręczną, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do żywicy. Pozwól, aby pozostała objętość spłynęła grawitacyjnie.Po zakończeniu odsączania surowych ekstraktów i ponownym odsłonięciu powierzchni żywicy, za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodaj około 30 mililitrów schłodzonego buforu do płukania do kolumny, uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Otwórz kran i pozwól, aby bufor płuczący spłynął przez kolumnę. Podczas opróżniania kolumny oznacz 16 probówek do mikrowirówek do zbierania frakcji.Gdy bufor całkowicie opróżni się, a powierzchnia żywicy zostanie ponownie odsłonięta, zamknij kurek. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodać do kolumny około 30 mililitrów schłodzonego buforu elucyjnego, uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Następnie powoli otwórz kran odcinający, aby umożliwić buforowi elucji wymycie białka znakowanego polihistydyną z kolumny.Zebrać jeden mililitr eluentu w każdej z zaznaczonych probówek do mikrowirówek. Po przetestowaniu na obecność białka połącz frakcje zawierające białko w czystą stożkową probówkę. Kontynuuj rozpuszczenie kofaktora jonów metalu lub zamroź białko w trzech mililitrowych porcjach w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby rozpocząć odtworzenie metalu, należy umieścić na lodzie trzymililitrową porcję oczyszczonego enzymu, zawieszoną w buforze elucyjnym. Wykorzystując objętość białka w probówce, obliczyć ilość askorbinianu sodu i ditiotreitolu niezbędną tak, aby końcowe stężenie każdego z nich w próbce wynosiło 12,5 milimola. Dodaj stały askorbinian sodu i ditiotreitol i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.Wystukaj kilka mililitrowych granulek siedmiowodnego siarczanu żelaza na kawałek papieru wagowego. Złóż papier na granulkę i zmiażdż go płaską stroną metalowej szpatułki. Dodaj ziarno powstałego proszku do probówki zawierającej roztwór białka.Wirować do mieszania, co daje różowo-różowy kolor. Zakryj probówkę i inkubuj różowy roztwór na lodzie przez 10 do 30 minut. Różowy kolor z czasem wyblaknie.Do filtracji żelowej należy użyć żelowej kolumny filtracyjnej wypełnionej 10 mililitrami sferycznego żelu poliakrylamidowego w kolumnie o wymiarach 1,5 na 12 centymetrów, która jest również wyposażona w zbiornik o pojemności 10 mililitrów. Następnie zrównoważ kolumnę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Gdy bufor spłynie z kolumny, a górna podpora łoża zostanie odsłonięta, zamknij kurek.Odpipetować trzymililitrowy roztwór żelaza dwa rozpuszczone metaloenzymy na odsłonięty górny wspornik łoża. Otwórz kran i pozwól, aby cała trzymililitrowa próbka dostała się do kolumny grawitacyjnie. Wyrzuć pierwsze trzy mililitry eluentu.Każdy różowy kolor, który utworzy się podczas obchodzenia się z roztworem, zostanie uwięziony w górnej części kolumny. Gdy kolumna przestanie kapać, a górny wspornik złoża zostanie odsłonięty, dodaj cztery mililitry żelowego buforu filtracyjnego i zbierz cztery mililitry eluentu na 8,5 mililitra frakcji. Po połączeniu frakcji zawierających białko należy przystąpić do oznaczania lub przechowywania próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W tym badaniu studenci oczyścili, a następnie odtworzyli znakowaną polihistydyną dioksygenazę niehemową wiążącą żelazo. Analiza SDS-PAGE pokazuje, że znakowane białko jest skutecznie oczyszczane. Zebrane przez studentów dane dotyczące aktywności enzymatycznego oczyszczonej dioksygenazy L-dopa po rozpuszczeniu w żelazie drugim i późniejszej filtracji żelowej przedstawiono tutaj.Pięciosekundowe opóźnienie przed rozpoczęciem zbierania danych jest typowe dla uczniów wykonujących tę technikę po raz pierwszy. Test w stanie ustalonym wskazuje, że parametry kinetyczne, określone przez dopasowanie krzywych postępu, są zgodne z opublikowanymi wynikami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że więcej żelaza nie jest lepsze, ponieważ zbyt dużo żelaza spowoduje wytrącanie się białek.Stężenie żelaza w nadmiarze białka od trzech do pięciu molowych jest wystarczające. Zgodnie z tą procedurą uczniowie mogą wykonywać dodatkowe eksperymenty, aby zmierzyć strukturę roztworu, przyjrzeć się chemii zależnej od enzymu lub substratu, a wszystko po to, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmu reakcji.

benchtop-immobilized-metal-affinity-chromatography-reconstitution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii powinowactwa niklu do oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną z bakterii Clostridium difficile.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Ten film demonstruje procedurę produkcji rekombinowanych przeciwciał przeciwko metallopeptydazie. Rekombinowane plazmidy przenoszące geny przeciwciała, białka zielonej fluorescencji i oporności na antybiotyki są transfekowane do komórek nabłonka za pomocą lipofektaminy. Transfekowane komórki są selekcjonowane i hodowane w celu wytworzenia rekombinowanych przeciwciał.

Metoda wytwarzania rekombinowanych przeciwciał przeciwko metallopeptydazie

Solidne odczynniki do wykrywania stają się coraz bardziej niezbędne do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych malarii. Zaprojektowano sondę irydową(III), która emituje długotrwały sygnał luminescencyjny w obecności bogatego w histydynę biomarkera białka malarii. Wykrywanie białka zarówno w roztworze, jak i unieruchomionego na cząstce magnetycznej zapewnia elastyczność w zastosowaniu.

Sonda luminescencyjna Iridium(III) do wykrywania biomarkera białka malarii Histidine Rich Protein-II

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN).  Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj metodę chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali i rekonstytucji metaloenzymu znakowanego polihistydyną. Protokół ten umożliwia studentom oczyszczanie i badanie struktury oraz funkcji żelazowych enzymów w laboratorium dydaktycznym.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego (Wideo) | JoVE Journal

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Przeglądaj więcej filmów