Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Metoda ta pozwala studentom studiów licencjackich szybko oczyścić metaloenzymy wiążące żelazo, a następnie wykorzystać to białko do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące struktury i funkcji, a wszystko to w ramach laboratorium dydaktycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona zastosowanie do enzymów wiążących żelazo niehemowe. Jest dostępny dla studentów studiów licencjackich i można go łatwo wdrożyć w laboratorium dydaktycznym.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy zaopatrzyć się w kolumnę o wymiarach 1,5 na 20 centymetrów wyposażoną w wylot typu luer lock, górną nasadkę, która zawiera również złączkę typu luer lock, oraz dolny wspornik łoża, który zatrzymuje cząstki żywicy. Zamontuj dolną złączkę luer lock z kurkiem, aby kontrolować przepływ. Następnie zdobądź butelkę zawierającą 50% zawiesinę żywicy kwasu nitrylooctowego związanego niklem w 20% etanolu, który był wcześniej przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Delikatnie zakręć butelką, aby równomiernie zawiesić żywicę. Pracując w temperaturze pokojowej, za pomocą pipety miarowej pobrać dwa milimetry gnojowicy i przenieść ją do kolumny. Po spuszczeniu nadmiaru roztworu do przechowywania z żywicy, użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie dodać co najmniej 30 mililitrów schłodzonego buforu do lizy, uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy.

Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Zrównoważyć żywicę, pozwalając buforowi na powolny odpływ grawitacyjny z kolumny do zlewki zbiorczej. Na początek należy przygotować kolumnę nikiel-NTA do dodania bezkomórkowych ekstraktów surowych, otwierając zawór odcinający i pozwalając, aby pozostały bufor wiążący lizę spłynął grawitacyjnie przez żywicę niklowo-NTA.

Gdy bufor całkowicie opróżni się, a powierzchnia żywicy zostanie odsłonięta, zamknij kurek. Następnie za pomocą pipety Pasteura ostrożnie odpipetuj bezkomórkowe surowe ekstrakty na żywicę, uważając, aby nie naruszyć powierzchni. Sprowadź surowe ekstrakty w dół ściany kolumny, aby uniknąć rozpryskiwania.

Po przeniesieniu wszystkich surowych ekstraktów do kolumny należy otworzyć zawór odcinający, aby kolumna mogła opróżnić się grawitacyjnie. Zbierz 100 mikrolitrów przepływu do późniejszej analizy. Użyj krótkiego odcinka plastikowej rurki, aby podłączyć 10-mililitrową strzykawkę typu luer lock do nasadki kolumny.

Wyciągnąć tłok strzykawki, a następnie szczelnie napełnić nasadkę kolumny na górze kolumny. Delikatnie ścisnąć tłok, jednocześnie zbierając eluent do cylindra z podziałką, aby ręcznie ocenić natężenie przepływu. Dawki od jednego do dwóch mililitrów na minutę są kompatybilne z żywicą i konfiguracją eksperymentalną.

Delikatnie zwiększać nacisk tłoka strzykawki w miarę zmniejszania się szybkości przepływu. Gdy menisk nałożonej cieczy osiągnie od pięciu do 10 mililitrów powyżej złoża żywicy, zdejmij nasadkę kolumny i dołączoną pompkę ręczną, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do żywicy. Pozwól, aby pozostała objętość spłynęła grawitacyjnie.

Po zakończeniu odsączania surowych ekstraktów i ponownym odsłonięciu powierzchni żywicy, za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodaj około 30 mililitrów schłodzonego buforu do płukania do kolumny, uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Otwórz kran i pozwól, aby bufor płuczący spłynął przez kolumnę. Podczas opróżniania kolumny oznacz 16 probówek do mikrowirówek do zbierania frakcji.

Gdy bufor całkowicie opróżni się, a powierzchnia żywicy zostanie ponownie odsłonięta, zamknij kurek. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodać do kolumny około 30 mililitrów schłodzonego buforu elucyjnego, uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Następnie powoli otwórz kran odcinający, aby umożliwić buforowi elucji wymycie białka znakowanego polihistydyną z kolumny.

Zebrać jeden mililitr eluentu w każdej z zaznaczonych probówek do mikrowirówek. Po przetestowaniu na obecność białka połącz frakcje zawierające białko w czystą stożkową probówkę. Kontynuuj rozpuszczenie kofaktora jonów metalu lub zamroź białko w trzech mililitrowych porcjach w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby rozpocząć odtworzenie metalu, należy umieścić na lodzie trzymililitrową porcję oczyszczonego enzymu, zawieszoną w buforze elucyjnym. Wykorzystując objętość białka w probówce, obliczyć ilość askorbinianu sodu i ditiotreitolu niezbędną tak, aby końcowe stężenie każdego z nich w próbce wynosiło 12,5 milimola. Dodaj stały askorbinian sodu i ditiotreitol i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.

Wystukaj kilka mililitrowych granulek siedmiowodnego siarczanu żelaza na kawałek papieru wagowego. Złóż papier na granulkę i zmiażdż go płaską stroną metalowej szpatułki. Dodaj ziarno powstałego proszku do probówki zawierającej roztwór białka.

Wirować do mieszania, co daje różowo-różowy kolor. Zakryj probówkę i inkubuj różowy roztwór na lodzie przez 10 do 30 minut. Różowy kolor z czasem wyblaknie.

Do filtracji żelowej należy użyć żelowej kolumny filtracyjnej wypełnionej 10 mililitrami sferycznego żelu poliakrylamidowego w kolumnie o wymiarach 1,5 na 12 centymetrów, która jest również wyposażona w zbiornik o pojemności 10 mililitrów. Następnie zrównoważ kolumnę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Gdy bufor spłynie z kolumny, a górna podpora łoża zostanie odsłonięta, zamknij kurek.

Odpipetować trzymililitrowy roztwór żelaza dwa rozpuszczone metaloenzymy na odsłonięty górny wspornik łoża. Otwórz kran i pozwól, aby cała trzymililitrowa próbka dostała się do kolumny grawitacyjnie. Wyrzuć pierwsze trzy mililitry eluentu.

Każdy różowy kolor, który utworzy się podczas obchodzenia się z roztworem, zostanie uwięziony w górnej części kolumny. Gdy kolumna przestanie kapać, a górny wspornik złoża zostanie odsłonięty, dodaj cztery mililitry żelowego buforu filtracyjnego i zbierz cztery mililitry eluentu na 8,5 mililitra frakcji. Po połączeniu frakcji zawierających białko należy przystąpić do oznaczania lub przechowywania próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W tym badaniu studenci oczyścili, a następnie odtworzyli znakowaną polihistydyną dioksygenazę niehemową wiążącą żelazo. Analiza SDS-PAGE pokazuje, że znakowane białko jest skutecznie oczyszczane. Zebrane przez studentów dane dotyczące aktywności enzymatycznego oczyszczonej dioksygenazy L-dopa po rozpuszczeniu w żelazie drugim i późniejszej filtracji żelowej przedstawiono tutaj.

Pięciosekundowe opóźnienie przed rozpoczęciem zbierania danych jest typowe dla uczniów wykonujących tę technikę po raz pierwszy. Test w stanie ustalonym wskazuje, że parametry kinetyczne, określone przez dopasowanie krzywych postępu, są zgodne z opublikowanymi wynikami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że więcej żelaza nie jest lepsze, ponieważ zbyt dużo żelaza spowoduje wytrącanie się białek.

Stężenie żelaza w nadmiarze białka od trzech do pięciu molowych jest wystarczające. Zgodnie z tą procedurą uczniowie mogą wykonywać dodatkowe eksperymenty, aby zmierzyć strukturę roztworu, przyjrzeć się chemii zależnej od enzymu lub substratu, a wszystko po to, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmu reakcji.