Zapalenie jelita grubego (Caenorhabditis) Sito: niezaawansowany technologicznie instrument i metodologia sortowania małych organizmów wielokomórkowych
4 lipca 2018
Obecny protokół zawiera metodologię sortowania i czyszczenia populacji Caenorhabditis elegans w zależności od wieku.Wykorzystuje proste, niedrogie i wydajne narzędzie wykonane na zamówienie w celu uzyskania dużej eksperymentalnej populacji nicieni do badań.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii molekularnej, obejmujące testy, które wymagają określonych etapów rozwojowych C. elegans. Podobnie jak testy poziomów ekspresji genów i białek. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala na dokładną i wydajną selekcję dużej liczby C. elegans według wielkości ciała, co ułatwia stosowanie testów, które normalnie byłyby zbyt czasochłonne i kosztowne.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nie mogą wykonać kroku obrotu łukowego lub nie utrzymują przepływu roztworu w środku siatki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki mycia i odwracania są trudne do nauczenia. Niektórzy mogą mieć problemy z interpretacją i wizualizacją określonych ruchów w tekście.
Na początek zaopatrz się w dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml z pokrywkami, a następnie użyj wiertła stopniowego, aby usunąć środek z wewnętrznej krawędzi pokrywek. W razie potrzeby użyj pilnika, papieru ściernego lub narzędzia obrotowego, aby wyczyścić i przeszlifować krawędzie i wierzchołki pokrywek. Następnie wytnij krążek z nylonowej siatki tkanej z monofilamentu, nieco mniejszy niż średnica pokrywy.
Teksturuj górne powierzchnie pokrywek i wyczyść je etanolem. Po pozostawieniu pokrywek do wyschnięcia, nałóż klej cyjanoakrylowy na górne powierzchnie obu pokrywek. Następnie połóż krążek z siatki monofilamentowej na jednej przyklejonej pokrywie.
Odwróć drugą pokrywkę na wierzchu siatki i mocno dociśnij pokrywki do siebie. Po wyschnięciu pierwszej warstwy kleju nałóż obfity pierścień kleju cyjanoakrylowego wokół zewnętrznej szczeliny między pokrywkami. Następnie oznacz filtr odpowiednim rozmiarem porów siatki.
Najpierw umieść sitko na oznaczonej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie pipetować roztwór soli fizjologicznej przez środek sita, aż utworzy się kropla, która połączy się i zacznie kapać ze środka filtra. Używając bufora M9, zmyj populację C.elegans z płytki ślimaka, a następnie użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść bufor zawierający robaki na górną stronę siatki monofilamentowej.
Działając w środku siatki, przepłucz filtr buforem M9, powtórz ten krok płukania w razie potrzeby, aby wszystkie bakterie i mniejsze robaki przeszły przez siatkę. Następnie przymocuj nową stożkową rurkę o pojemności 50 ml do górnej części sita, wcześniej zebrane robaki większe niż pory w siatce będą skierowane do wnętrza nowej probówki. Wyjmij rurkę odpływową i szybko odwróć sitko.
Następnie przepłukać siatkę za pomocą buforu M9 do nowej probówki zbiorczej. Pozwól zebranym robakom osiąść przez około minutę, a następnie ostrożnie odessać roztwór buforowy od osadu robaków. Za pomocą szklanej pipety Pasteura utwórz kropelki robaków na płytce NGM i pozwól im wyschnąć.
Na koniec przepłucz sito wodą z odwróconej osmozy i etanolem. Po wyschnięciu sita przechowuj je w czystym pojemniku do wykorzystania w przyszłości. Wyrzuć sitko, gdy zacznie wyglądać na obwisłe.
W tym protokole skonstruowano sito do sortowania i czyszczenia populacji C.elegans dopasowanych do wieku. Zwierzęta w grupie poddanej działaniu sita wykazywały normalny i spontaniczny wzorzec ruchowy przez całe dorosłe życie. Ponadto grupy kilofów i sit nie wykazały istotnych różnic w szybkości pompowania gardła.
Zwierzęta w grupie sitowej również reagowały normalnie na bodziec mechaniczny ze strony przedniej lub tylnej w porównaniu ze wszystkimi grupami badanymi w którymkolwiek z dni testów. Na koniec porównano płodność badanych grup; Zastosowanie sita nie wpłynęło istotnie na liczbę potomstwa w porównaniu z grupą badaną przez Pick. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dziesięć minut.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby działać w środku obszaru siatki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak złożyć i prawidłowo używać sita Caenorhabditis do sortowania robaków według wielkości ciała.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodologię sortowania i oczyszczania populacji Caenorhabditis elegans o tym samym wieku przy użyciu narzędzia wykonanego na zamówienie. Pozwala on badaczom na wydajne i ekonomiczne uzyskanie licznej populacji eksperymentalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia molekularna
- Biologia rozwojowa
Wstęp
- Konkretne stadia rozwojowe C.elegans mają kluczowe znaczenie dla wielu różnych testów.
- Testy te mogą obejmować poziomy ekspresji genów i białek.
- Tradycyjne metody mogą być czasochłonne i kosztowne.
- Prezentacje wizualne są niezbędne do zrozumienia metodologii.
Cel badania
- Aby zapewnić efektywną metodę selekcji C.elegans ze względu na wielkość ciała.
- Aby ułatwić przeprowadzanie testów wymagających konkretnych stadiów rozwojowych.
- Aby zwiększyć dostępność tej techniki dla badaczy, którzy dopiero zaczynają z niej korzystać.
Zastosowane metody
- Narzędzie wykonane na zamówienie do sortowania nicieni.
- Krok łukowatego obracania w celu efektywnego płukania.
- Utrzymywanie przepływu roztworu w centrum siatki.
- Demonstracje wizualne wspomagające naukę.
Główne wyniki
- Osiągnięto dokładny wybór dużych liczb osobników C.elegans.
- Metoda skraca czas i obniża koszty analiz biologii molekularnej.
- Poprawiono zrozumienie specyficznych ruchów dzięki pomocy wizualnej.
- Zwiększono dostępność metody dla badaczy z nią niezapoznanych.
Wnioski
- Protokół oferuje niezawodną metodę sortowania C.elegans.
- Pomoce wizualne są kluczowe dla efektywnej nauki tej techniki.
- Metodyka ta może przynieść znaczące korzyści w badaniach z zakresu biologii molekularnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
W badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym uzyskanie zsynchronizowanych populacji organizmów modelowych, takich jak C. elegans, jest kluczowe dla powtarzalności screeningu fenotypowego i testów walidacji celów terapeutycznych. Sito do Caenorhabditis umożliwia szybkie i kosztowo efektywne sortowanie według wielkości ciała, redukując nakłady czasu i zasobów w początkowych etapach procesów odkrywania leków. Wspiera to pewność prognostyczną w zakresie gotowości testów oraz selekcji portfolio poprzez zapewnienie jednorodności materiału biologicznego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych z wykorzystaniem populacji nicieni o tym samym wieku, co zapewnia spójne wyniki fenotypowe.
- Wartość operacyjna: Zapewnia niskokosztową i skalowalną metodę generowania zsynchronizowanych kohort bez konieczności użycia specjalistycznego sprzętu.
- Wartość prognostyczna: Redukuje zmienność biologiczną w analizach, co zwiększa niezawodność danych w procesie minimalizacji ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewania związków poprzez izolację konkretnych stadiów rozwojowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie nicieni, zwiększając powtarzalność w obrębie płytek testowych i kampanii przesiewowych.
- Skalowalność: Obsługuje potrzeby wysokoprzepustowe dzięki szybkiemu przetwarzaniu dużych populacji nicieni w czasie krótszym niż dziesięć minut.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: zapewnia wierność fenotypową od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez zachowanie markerów motywności, odpowiedzi na stres i płodności.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: umożliwia wiarygodną ocenę poziomów ekspresji genów i białek w zsynchronizowanych populacjach, co wspiera dopasowanie biomarkerów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie spójnych danych z systemu modelowego dla profilowania skuteczności i toksyczności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Sito do Caenorhabditis wpisuje się w kontinuum odkryć od wczesnej fazy odkrywania do identyfikacji wiodących związków, wspierając w szczególności przygotowanie testów oraz powtarzalność przesiewową w fenotypowych badaniach przesiewowych opartych na C. elegans.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez dostarczanie jednorodnych populacji nicieni do wyjaśniania szlaków sygnałowych i przesiewania funkcjonalnego.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie do analizy dzięki sortowaniu opartemu na rozmiarze, zapewniając spójną wielkość i stadium rozwojowe nicieni dla wiarygodnej oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki z rozdzieleniem według rozmiaru, co pozwala zespołom porównywać warunki w różnych stadiach rozwojowych przy zredukowanym poziomie szumu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez utrzymanie kluczowych markerów zdrowotnych (ruchliwość, odpowiedź stresowa, płodność) po sortowaniu, co wspiera walidację biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Służy jako wielokrotnego użytku, niewymagające częstej konserwacji narzędzie dla różnych zespołów i projektów, promując standaryzację w postępowaniu z organizmami modelowymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej dzięki ograniczeniu niejednoznaczności mechanistycznej w testach fenotypowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność procesów przygotowania nicieni.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go), efektywność kapitałowa i zmniejszenie biologicznego ryzyka na późnych etapach dzięki wczesnej redukcji ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na wiarygodnych danych z systemów modelowych specyficznych dla danego etapu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane są podstawowe umiejętności laboratoryjne w zakresie montażu sit oraz przygotowywania i obchodzenia się z roztworami.
- Niezbędny jest dostęp do probówek stożkowych, siatki nylonowej, kleju cyjanoakrylowego oraz standardowych buforów (M9, sól fizjologiczna).
- Wymagane jest przeszkolenie międzyzespołowe w zakresie prawidłowej obsługi elementów opartych na siatce oraz techniki odwracania, aby zapewnić powtarzalność wyników.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dobór wielkości oczek siatki dla docelowych stadiów rozwojowych nicieni oraz kompatybilność z różnymi systemami hodowli na podłożu NGM lub w kulturach płynnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują możliwość odkształcania się siatki z upływem czasu, co wymaga jej okresowej wymiany w celu zachowania dokładności sortowania.
