Name: Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Naucz się izolować kompleksy FCP z okrzemki Cyclotella meneghiniana i włączać je w liposomy z lipidami tylakoidowymi. Ta metoda umożliwia badanie transferu energii wzbudzenia w kontrolowanych warunkach jonowych i pH.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Rana Adeel Ahmad za pomoc w oczyszczaniu FCP. Prof. Claudia Büchel jest wdzięczna za pomocne dyskusje i przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą dla LD (DI1956-1/1) oraz Fundację Humboldta dla stypendium Feodor-Lynen dla LD.

<ol><li>Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18983262">The Dynamics of Photosynthesis.</a> Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).</li>
<li>Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+Responding+to+Excess+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensing and Responding to Excess Light.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).</li>
<li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).</li>
<li>Li, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li>
<li>Peers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+light-harvesting+protein+is+critical+for+the+regulation+of+algal+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis.</a> Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).</li>
<li>Correa-Galvis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosystem+II+Subunit+PsbS+Is+Involved+in+the+Induction+of+LHCSR+Protein-dependent+Energy+Dissipation+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).</li>
<li>Bailleul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atypical+member+of+the+light-harvesting+complex+stress-related+protein+family+modulates+diatom+responses+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).</li>
<li>Taddei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisignal+control+of+expression+of+the+LHCX+protein+family+in+the+marine+diatom+Phaeodactylum+tricornutum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).</li>
<li>Lepetit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diatom+Phaeodactylum+tricornutum+adjusts+nonphotochemical+fluorescence+quenching+capacity+in+response+to+dynamic+light+via+fine-tuned+Lhcx+and+xanthophyll+cycle+pigment+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis.</a> New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).</li>
<li>Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+function+of+light+harvesting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evolution and function of light harvesting proteins.</a> Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).</li>
<li>Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+Diadinoxanthin+Pool+Size+on+Photoprotection+in+the+Marine+Planktonic+Diatom+Phaeodactylum+tricornutum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).</li>
<li>Ruban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+super-excess+energy+dissipation+in+diatom+algae%3A+comparative+analysis+with+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants.</a> Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).</li>
<li>Mann, D. G. <a target="_blank" href="http://www.phycologia.org/doi/abs/10.2216/i0031-8884-38-6-437.1">The species concept in diatoms.</a> Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).</li>
<li>Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+Characterization+of+the+Excitation+Energy+Transfer+in+the+Fucoxanthin-Chlorophyll+Protein+of+Diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms.</a> Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).</li>
<li>Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810005761">Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).</li>
<li>Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301010410000601">The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy.</a> Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).</li>
<li>Ramanan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+mechanism%28s%29+of+energy+dissipation+in+the+light+harvesting+complex+of+the+photosynthetic+algae+Cyclotella+meneghiniana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).</li>
<li>Haferkamp, S., Kirchhoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+molecular+crowding+in+grana+membranes+of+higher+plants+for+light+harvesting+by+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II.</a> Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).</li>
<li>Wahadoszamen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stark+fluorescence+spectroscopy+reveals+two+emitting+sites+in+the+dissipative+state+of+FCP+antennas%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monogalactosyldiacylglycerol+on+the+interaction+between+photosystem+II+core+complex+and+its+antenna+complexes+in+liposomes+of+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids.</a> Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).</li>
<li>Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+fluorescence+analysis+of+the+photosystem+II+antenna+proteins+in+detergent+micelles+and+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes.</a> Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).</li>
<li>Natali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-harvesting+Complexes+%28LHCs%29+Cluster+Spontaneously+in+Membrane+Environment+Leading+to+Shortening+of+Their+Excited+State+Lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).</li>
<li>Gundermann, K., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+fluorescence+yield+of+fucoxanthin-chlorophyll+complexes+%28FCP%29+involved+in+non-photochemical+quenching+in+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).</li>
<li>Ahmad, R. A., Dietzel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+cellular+K%2B+gradients+by+valinomycin+induces+diatoxanthin+accumulation+in+Cyclotella+meneghiniana+cells+and+alters+FCPa+fluorescence+yield+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro.</a> Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).</li>
<li>Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+artificial+media+for+marine+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+Mikrobiologie%22%5BJournal%5D)">The development of artificial media for marine algae.</a> Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).</li>
<li>Jeffrey, S., Humphrey, G. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0015379617307783">New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton.</a> Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).</li>
<li>Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+Composition+and+Pigmentation+of+Fucoxanthin%E2%88%92Chlorophyll+Proteins+in+Diatoms%3A+Evidence+for+a+Subunit+Involved+in+Diadinoxanthin+and+Diatoxanthin+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding.</a> Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269787905872">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).</li>
<li>Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin-Chlorophyll+Proteins+in+Diatoms%3A+18+and+19+kDa+Subunits+Assemble+into+Different+Oligomeric+States%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States.</a> Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).</li>
<li>Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+composition+of+the+unicellular+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii+and+the+diatom+Cyclotella+meneghiniana+investigated+by+MALDI-TOF+MS+and+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).</li>
<li>Gundermann, K., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+yield+of+the+trimeric+fucoxanthin-chlorophyll-protein+FCPa+in+the+diatom+Cyclotella+meneghiniana+is+dependent+on+the+amount+of+bound+diatoxanthin%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin.</a> Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).</li>
<li>Miloslavina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+fluorescence+study+on+the+location+and+mechanism+of+non-photochemical+quenching+in+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).</li>
<li>Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+xanthophyll+cycle+activity+and+of+non-photochemical+fluorescence+quenching+by+two+alternative+electron+flows+in+the+diatoms+Phaeodactylum+tricornutum+and+Cyclotella+meneghiniana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).</li>
<li>Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272814000681">Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).</li>
<li>Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+Lhcx+protein+Fcp6+of+the+diatom+Cyclotella+meneghiniana+in+the+macro-organisation+and+structural+flexibility+of+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).</li>
<li>Darley, W. M. Biochemical composition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarley%2C+WM+%22The+biology+of+diatoms%22">The biology of diatoms</a>. 13, 198-223 (1977).</li>
<li>Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+large+single+bilayer+liposomes+by+a+fast+and+controlled+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).</li>
<li>Zumbuehl, O., Weder, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+of+controllable+size+in+the+range+of+40+to+180+nm+by+defined+dialysis+of+lipid-detergent-mixed+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).</li>
<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Scientific Reports. 2 (306), (2012).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Liposomy FCP o naturalnym składzie lipidowym stanowią poręczne, proste i powtarzalne narzędzie do badania właściwości spektroskopowych in vitro. Środowisko lipidowe w liposomach FCP przypomina sytuację w błonie tylakoidów, co prowadzi do uzyskania wyników eksperymentalnych bliższych warunkom naturalnym.
Istnieje kilka zalet stosowania C. meneghiniana jako systemu modelowego dla anteny FCP. Rośnie stosunkowo szybko i jest bardziej wytrzymały w porównaniu z innymi modelowymi ga...

Organizmy fotosyntetyzujące, takie jak okrzemki, muszą radzić sobie z nieustannie zmieniającymi się warunkami oświetlenia i reagować za pomocą złożonych mechanizmów aklimacyjnych, które podtrzymują wysoką wydajność fotosyntetyczną i chronią przed uszkodzeniami fotooksydacyjnymi wywołanymi nadmiernym światłem. Głównym procesem ochronnym przed światłem u eukariotów fotosyntetyzujących jest wysokenergetyczne gaszenie (qE) pochłoniętego światła, które stanowi główny wkład w niefotochemiczne gaszenie (NPQ) w warunkach stresu świetlnego1,2,3. Kompleksy antenowe zbierające światło (LHC) biorą udział w regulacji dróg transferu energii wzbudzenia. W odpowiedzi na niskie pH w lumenie chloroplastu indukowane przez silne światło, system antenowy przełącza się ze stanu zbierania światła w stan gaszenia. Ten energetycznie rozpraszający stan chroni fotosystemy (PS) i inne kompleksy w błonie tylakoidów przed fotooksydacją. U eukariotów fotosyntetyzujących qE jest zazwyczaj indukowane przez dwa czynniki1,2,3. Jednym z nich jest specjalistyczne białko zbierające światło, które reaguje na niskie pH. Białko PsbS indukuje qE u roślin wyższych4. LhcSRs5, modulowane przez aktywność PsbS, indukują qE u zielonych glonów6. Okrzemki posiadają białka typu Lhcx, które są strukturalnie spokrewnione z LhcSRs7,8,9,10.
Drugim czynnikiem qE jest cykl ksantofili, w którym karotenoidy anteny są przekształcane w formę fotoprotekcyjną poprzez deepoksydację i przywracane przez epoksydację. U roślin i zielonych glonów violaksantyna jest przekształcana w zeaksantynę. W okrzemkach diadinoksantyna jest przekształcana w diatoksantynę, co następnie koreluje z zakresem NPQ11. Antena zbierająca światło okrzemków posiada pewne specyficzne cechy, mimo że jest ewolucyjnie powiązana z LHC roślin i glonów. Przełączenie z pochłaniania światła na fotoprotekcję jest niezwykle szybkie, a pojemność NPQ jest wyższa w porównaniu do roślin12. Może to być jednym z powodów, dla których okrzemki odnoszą tak duże sukcesy w różnych niszach ekologicznych, odpowiadając za maksymalnie 45% oceanicznej netto pierwotnej produkcji13. W związku z tym systemy zbierania światła okrzemków stanowią interesujący obiekt badań nad fotosyntezą.
Okrzemki, takie jak centriczny gatunek Cyclotella meneghiniana, posiadają wewnątrzthylakoidowe układy zbierania światła nazwane od wiązanych przez nie pigmentów – fukoksantyny oraz chlorofilu (chl) a i c, stąd nazwa FCP. Białka zbierające światło, takie jak FCP, są osadzone w systemie błon thylakoidów składającym się z kilku warstw błonowych. Okrzemki tworzą pasma trzech thylakoidów. Ta złożona sytuacja utrudnia ich badanie na poziomie molekularnym w błonie thylakoidu. Ponadto w regulację zbierania światła zaangażowanych jest wiele komponentów (patrz wyżej). Dlatego w wielu podejściach kompleksy te izolowano z błony przy użyciu łagodnych detergentów, takich jak n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), które solubilizują błonę, ale pozostawiają kompleksy FCP w nienaruszonym stanie. Wiele badań spektroskopowych przeprowadzono z wykorzystaniem solubilizowanych FCP w celu zbadania wewnątrzmolekularnego transferu energii14,15,16,17. Jednak to wcześniejsze podejście było ograniczone, ponieważ regulacja transferu energii wymaga oddziaływań ekscytonowych z innymi kompleksami antenowymi lub fotosystemami. W związku z tym tego rodzaju badania nie mogą być prowadzone na solubilizowanych kompleksach, ponieważ oddziaływania między kompleksami zostają utracone.
Ważną cechą w regulacji anten jest „zatłoczenie molekularne” (molecular crowding) anten i fotosystemów w błonie tylakoidu18. Wcześniej stosowano proste podejście w celu symulacji tego efektu in vitro. Usuwano detergent, co prowadziło do przypadkowej agregacji kompleksów antenowych. Chociaż dzięki tej metodzie uzyskano pewne wiarygodne dane17,19, usuwanie detergentu nie odzwierciedla sytuacji in vivo i posiada pewne ograniczenia, ponieważ kompleksy nie oddziałują ze sobą w ramach swojej regularnej struktury trzeciorzędowej.
Zastosowanie liposomów pozwala pokonać wiele z wcześniejszych ograniczeń. Struktura trzeciorzędowa pozostaje w pełni nienaruszona. Błona liposomu zapewnia środowisko quasi-natywne dla kompleksów antenowych. Błona oddziela wnętrze liposomu od środowiska zewnętrznego. W ten sposób liposomy zapewniają dwa przedziały reakcyjne do badań gradientów jonowych i pH, a także procesów transportu. Ponadto parametry układu eksperymentalnego mogą być łatwiej kontrolowane w badaniach nad błoną tylakoidów. Wykazano już, że liposomy są doskonałym narzędziem do badania kompleksów fotosyntetycznych. W przeszłości główny nacisk kładziono na roślinne LHC, gdzie badano wpływ zmienionego składu lipidowego na LHC II20. W innych podejściach badano oddziaływania białko-białko pomiędzy różnymi LHC II21. Przeprowadzono również niektóre badania na zielonych algach, które opisują spontaniczne klastrowanie LHC22. Biorąc pod uwagę znaczenie okrzemków dla ekosystemów wodnych, wykonano stosunkowo niewiele badań nad kompleksami antenowymi okrzemków. Dwie prace badały kompleksy antenowe okrzemka centrującego Cyclotella meneghiniana, wykazując klastrowanie anten FCP23 oraz reaktywność FCP na gradienty elektrochemiczne24. Zatem liposomy są doskonałym narzędziem do badania anten okrzemków oraz ich oddziaływań i regulacji w warunkach niemal natywnych. Liposomy są wszechstronne, ponieważ można kontrolować wiele parametrów, takich jak skład lipidowy, wielkość liposomów, gęstość białek oraz otaczająca faza wodna. Ponadto metoda ta wymaga niewielkich ilości próbek. Układ eksperymentalny jest stabilny i wysoce powtarzalny. Przedziałowość liposomów umożliwia badanie gradientów pH i jonów, które są istotnymi czynnikami w regulacji kompleksów antenowych.
W niniejszej pracy opisujemy izolację kompleksów antenowych FCP z C. meneghiniana oraz ich wbudowywanie w liposomy o naturalnym składzie lipidowym tylakoidów. Dostarczamy również przykładowych danych dla charakterystyki spektroskopowej solubilizowanego FCP i porównujemy je z FCP w liposomach. Metoda ta podsumowuje wiedzę i zestandaryzowane protokoły uzyskane dzięki ulepszeniom wprowadzonym przez Gundermann i Büchel w 2012 roku.23, Natali i wsp. 201622, oraz Ahmad i Dietzel 201724.
<img alt="Izolacja tylakoidów i wbudowanie FCP w syntezie proteoliposomów; schemat etapów metody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przebieg procesu. (1) Odnosi się do akapitu 1, który opisuje wzrost komórek, ich rozbicie oraz izolację tylakoidów z następującym rozdzieleniem FCP na gradientach gęstości sacharozy; komórki C. m.-Cyclotella meneghiniana. (2) Przygotowanie naturalnej mieszaniny lipidów tylakoidalnych (MGDG, DGDG i SQDG) opisane w akapicie 2 oraz tworzenie miceli lipidowo-detergentowych z użyciem oktyloglikozydu (OG). Określoną wielkość miceli lipidowych uzyskuje się poprzez ekstruzję przez membrany o zdefiniowanej średnicy porów. FCP i micele lipidowe są łączone w określonym stosunku lipid:białko, a detergenty OG i β-DDM są usuwane poprzez kontrolowaną dializę, co prowadzi do powstania proteoliposomów FCP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>500 ml fiolki</td><td></td><td></td><td></td>wirówkowe</tr><tr><td>wirówka szybkoobrotowa</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&uuml; hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>nowsza wersja: Vibrogen-Zellm&uuml; hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 &micro; m</td><td></td><td>Sigmund-Lindner.com 5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Kulki silikonowe S 1,-1,3 mm</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>Lejek filtracyjny VitraPOR - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>fiolki ultrawirówki z poliwęglanu (30 ml) do T-865</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>314348</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Discovery 90SE</td><td>Sorvall</td><td>n.a.rotor</td><td></td></tr> <tr><td>T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>Komora licznika komórek Neubauera (ulepszona)</td><td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td><td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>kuwety ze szkła optycznego (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>"6040-10-10"</td><td></td></tr><tr><td>V-630 Spektrofotometr UV-VIS (z oprogramowaniem)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear probówki 17 ml do AH629</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>rotor AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>Membrana concentrator_Centriprep 30 kDa odcięcie</td><td>Milipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebra</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny 1610449 libre office</td><td>Podstawa dokumentów</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr> <tr><td>specjalne szklane kuwety do fluorescencji (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr FP-6500 (z oprogramowaniem)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładowania SDS Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-oktyl &beta;-D-glukopiranozyd</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalaktozylodiaglicerol (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>przygotować roztwór podstawowy w chloroformie</td></tr><tr><td>Digalaktozylodiacyloglicerol (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>zrobić roztwór podstawowy w chloroformie</td></tr><tr><td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>przygotować roztwór podstawowy w chloroformie</td></tr><tr><td>L-alfa-fosfatydyloglicerol (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>przygotować roztwór podstawowy w chloroformie</td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatydylocholina</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>przygotować roztwór podstawowy w</td></tr><tr><td>kąpieli sonikatora chloroformu S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td><td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td>mini-ekstruder</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa Nuleopore</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>membrana dializowa Visking 14 kDa odcięcie</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>przed użyciem zagotować w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Biobeads SM2 Adsorbent</td><td>Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>kopolimer epichlorhydryny sacharozy - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do ultrawirówek z poliwęglanu (2,7 mL) do TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>rotor TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>materiał wymieniony w kolejności występowania </td><td></td><td></td><td>Szczegółowe instrukcje dotyczące bezpieczeństwa można znaleźć w kartach charakterystyki materiałów i instrukcjach dotyczących materiału. Standardowe materiały laboratoryjne i substancje nie są wymienione.</td></tr></tbody></table>

izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki cyclotella meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Wydajność fotosyntezy roślin, glonów i okrzemek zależy od szybkiej i efektywnej regulacji procesów zbierania światła i transferu energii w błonie tylakoidowej chloroplastów. Antena zbierająca światło okrzemek, tzw. białka wiążące chlorofil a/c (FCP) fukoksantyny, są niezbędne do absorpcji światła i efektywnego przekazywania go do centrów reakcji fotosyntezy, a także do fotoochrony przed nadmiernym światłem. Przełączanie między tymi dwiema funkcjami jest od dawna przedmiotem badań. Wiele z tych badań przeprowadzono z użyciem FCP w micelach detergentowych. Do badań interakcji detergenty zostały usunięte, co doprowadziło do niespecyficznej agregacji kompleksów FCP. W tym podejściu trudno jest odróżnić artefakty od danych fizjologicznie istotnych. W związku z tym bardziej wartościowe informacje na temat FCP i innych błonowych kompleksów zbierania światła można uzyskać, badając interakcje białko-białko, transfer energii i inne cechy spektroskopowe, jeśli są one osadzone w ich natywnym środowisku lipidowym. Główną zaletą jest to, że liposomy mają określoną wielkość i określony stosunek lipidów do białek, dzięki czemu kontrolowany jest zakres grupowania FCP. Co więcej, zmiany w pH i składzie jonów, które regulują zbieranie światła in vivo, mogą być łatwo symulowane. W porównaniu z błoną tylakoidów liposomy są bardziej jednorodne i mniej złożone, co ułatwia uzyskanie i zrozumienie danych spektroskopowych. Protokół opisuje procedurę izolacji i oczyszczania FCP, przygotowania liposomów oraz włączenia FCP do liposomów o naturalnym składzie lipidowym. Wyniki z typowej aplikacji są podane i omówione.

Protokół opisuje izolację całkowitej frakcji FCP z Cyclotella meneghiniana oraz jej inkorporację do liposomów o natywnym składzie lipidowym. Izolacja tylakoidów jest wysoce powtarzalna, jednak wydajność uzyskiwania tylakoidów może ulec zmianie. Wynik jest akceptowalny, jeśli w kroku 1.1.4 odzyskano ponad 50% wszystkich pigmentów. Optymalny wynik to ponad 80%.
Solubilizacja tylakoidów jest krytycznym etapem. Dobrze solub...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Metoda ta może pomóc nam zrozumieć kluczowe pytania w badaniach nad fotosyntezą, takie jak zanik przechwyconej energii świetlnej i kompleksów zbierających światło, jego kinetyka i wydajność transferu. Główną zaletą tej techniki jest to, że liposomy zapewniają przedział błonowy przypominający natywny stan błony tylakoidowej, co pozwala na badanie zmian jonów i pH podczas fotosyntezy. Aby rozpocząć protokół, odwiruj wcześniej przygotowane komórki C.meneghiniana w temperaturze 4 300 razy G we wstępnie schłodzonym wirniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą 500-mililitrowych fiolek wirówkowych przez 15 minut.Zawiesić bufor homogenizacyjny do homogenizacji granulek komórkowych przez wytrząsanie i pipetowanie. Przenieść zawiesinę do jednej odpowiedniej plastikowej rurki i ograniczyć końcową objętość do 12 mililitrów. Następnie wstępnie schłodzić młyn perełkowy i sprzęt przez około 60 minut.Napełnij 50-mililitrową zlewkę do 75% mieszanką kulek szklanych i dodaj zawiesinę komórek. Wymieszaj go szpatułką lub szklaną pałeczką i w razie potrzeby dodaj HB. W przypadku rozerwania ogniwa użyj impulsów o wymiarach siedem na 45 sekund z pełną prędkością, z 30 sekundami chłodzenia między każdym impulsem.Przefiltruj uszkodzone komórki przez szklany lejek filtracyjny i umyj je, wylewając HB na szklane kulki, aż staną się przezroczyste. Następnie połącz frakcję płuczącą z filtratem i utrzymuj końcową objętość niższą niż 150 mililitrów. Odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 140 razy G, używając trzech 50-mililitrowych plastikowych probówek do granulowania resztek komórek.Ostrożnie przenieść supernatant do 20-mililitrowych fiolek do ultrawirowania z poliwęglanu i wyrzucić osad. Napełnić fiolki HB. Zrównoważ wagę. Wirować w odpowiednim wirniku przez jedną godzinę w temperaturze 300 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby osadzać błony tylakoidów.Zawiesić osad membrany z jak najmniejszą ilością bufora myjącego, używając małego pędzla malarskiego. Napełnij fiolki do ultrawirowania poliwęglanu buforem do mycia. Zrównoważ ich wagę.Wiruj je przez 20 minut w temperaturze 200 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ponownie zawiesić umyte membrany za pomocą pędzla malarskiego. Zbierz wszystkie tylakoidy w jednej 15-mililitrowej fiolce na próbkę.Napełnij probówki ultrawirówki roztworem gradientu sacharozy do góry na objętość jednego mililitra. Zamroź probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż całkowicie się zamrozą. Następnie pozwól rurkom rozmrozić się w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie użyj próbek odpowiadających 125 mikrogramom chlorofilu i dostosuj je buforem B1 do objętości 0,9 mililitra. W celu rozpuszczenia dodać maltopyranozyd N.Dodecyl Beta D do końcowego stężenia 20 milimolów. Odwróć rurkę trzy razy.Umieść go na lodzie na 20 minut, delikatnie potrząsając, aby zapobiec tworzeniu się piany. Wirować przez pięć minut w temperaturze 12 000 razy G we wstępnie schłodzonej wirówce stołowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Załadować supernatant na gradient i nie ładować więcej niż 125 mikrogramów całkowitego chlorofilu na gradient, jeśli używane są fiolki o pojemności 17 mililitrów.Wirować przez 22 godziny w temperaturze 100 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Odzyskaj pożądane brązowe frakcje FCP z gradientu za pomocą strzykawki. Oszacuj głośność.Następnie usunąć podwielokrotność pięciu mikrolitrów i rozcieńczyć ją 995 mikrolitrami B1A. Następnie zmierz objętość odzyskanej próbki za pomocą pięciomililitrowej pipety. Przemyć kompleksy FCP, dodając dwukrotność odzyskanej objętości buforem B1, który jest wolny od detergentów.Skoncentrować próbki w koncentratorze membranowym z granicą 30 kilodaltonów przy 1 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza do absorbancji przy 672 nanometrach co najmniej 20. Odpipetować płyny do dwumililitrowej probówki reakcyjnej i odparować chloroform za pomocą delikatnego przepływu azotu i rozprowadzić lipidy na całej powierzchni podstawy probówki. Pozwól azotowi przepływać, aż cały rozpuszczalnik odparuje.Rozpuść mieszaninę lipidów w 29 mikrolitrach glukopiranozydu N Octyl beta d w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny. Inkubuj mieszaninę lipidów przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj mieszaninę lipidów w kąpieli sonikatora w temperaturze 25 stopni Celsjusza trzy razy przez trzy minuty.Umieść mieszaninę na lodzie na 30 sekund między każdą sonikacją. Dodać 221 mikrolitrów buforu trycynowego i 250 mikrolitrów czterokrotnego buforu do dializy. Użyj ekstrudera z membranami poliwęglanowymi o grubości 0,1 mikrona, aby uzyskać określoną średnicę liposomu 50-70 nanometrów.Zamontuj ekstruder z membraną i wspornikiem filtra. Opłucz i zwilż sprzęt, a następnie pracuj ostrożnie i powoli, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, i dokładnie dokręć zespół. Napełnij strzykawkę czterokrotnym buforem do dializy i wstępnie zwilż ekstruder, aż w drugiej strzykawce nie będzie widać pęcherzyków.Nałóż micele detergentu lipidowego na wytłaczarkę i wyciskaj roztwór z jednej strzykawki do drugiej w przód iw tył. Powtórz ten krok pięć razy, aż roztwór stanie się jednorodny. Przejdź do włączenia kompleksów FCP i dodaj FCP równe 20 mikrogramom chlorofilu a w całkowitej objętości 500 mikrolitrów buforu B1A do 250 mikrolitrów wytłaczanych miceli lipidowych plus 250 mikrolitrów czterokrotnego DP. Inkubować próbki w trzech odstępach czasu przez trzy minuty każda, w temperaturze 25 stopni Celsjusza, w termomikserze przy 1 500-3 000 obr./min, przerywając 30-sekundową przerwą na lodzie.Przetnij pokrywkę czterech 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych tuż pod górą, uzyskując pierścień, który nadal pasuje do pokrywki. Przygotuj kawałki membran dializacyjnych o wymiarach 1,5 na 1,5 centymetra i umyj je w 20 mililitrach jednorazowego buforu do dializy. Napełnij każdą pokrywkę 250 mikrolitrami próbki.Ostrożnie ułóż membranę na pokrywie, tak aby komora była całkowicie wypełniona próbką i nie występowały pęcherzyki powietrza. Dokręć pierścień rurki reakcyjnej na zespole, tak aby komora była zamknięta. Próbki należy dializować w 50 mililitrach jednorazowego buforu dializacyjnego przez noc przez 12-16 godzin na lodzie na bębnowym wytrząsarce.Zastąp bufor świeżym buforem do dializy i dodaj siedem miligramów kulek adsorbcyjnych, aby usunąć pozostałe detergenty przez co najmniej sześć godzin. Ponownie wymienić bufor do dializy i dializować próbki przez kolejne 12 godzin. Odzyskaj liposomy, przekłuwając membranę dializacyjną końcówką mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów i odessaj wszystkie liposomy z pokrywy probówki reakcyjnej.Odwiruj liposomy FCP w co najmniej dwóch mililitrach buforu dializacyjnego 1X przez 1,5 godziny w temperaturze 100 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Odzyskaj liposomy, obracając probówkę wirówkową pod kątem 45 stopni. Pozwól liposomom przesunąć się w dół przez jedną minutę.Odzyskaj liposomy FCP w końcowej objętości 25-50 mikrolitrów i unikaj zakłócania osadu. Różnice w znormalizowanych widmach absorbancji wskazują na utratę pigmentu, która występuje w zakresie widmowym od 500 do 550 nanometrów, gdzie absorbują się karotenoidy. Utrata pigmentu jest dopuszczalna, jeśli kompleksy są nadal funkcjonalne, na co wskazują podobne widma emisji i wzbudzenia.Wydajność fluorescencji chlorofilu wynikająca z FCP w liposomach jest zmniejszona z powodu interakcji ekscytonowej w klastrach FCP. Wpływ gradientu jonów potasu na wydajność fluorescencji FCP badano w obecności standardowego buforu, który spada o 30 procent po dodaniu chlorku potasu. Gradient potasu został uwolniony przez walinomycynę, która przywraca fluorescencję FCP do poziomu początkowego i potwierdza hipotezę, że kompleksy FCP reagują na gradienty stężeń jonów potasu in vivo.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak fluorescencja tamrasolu, sonda pompująca i spektroskopia pojedynczych cząsteczek w celu zbadania dodatkowych pytań dotyczących przenoszenia energii świetlnej.

isolating-incorporating-light-harvesting-antennas-from-diatom

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Ten protokół szczegółowo opisuje odtwarzanie kompleksów zbierających światło in vitro. Te integralne białka błonowe koordynują chlorofile i karotenoidy i są odpowiedzialne za zbieranie światła w roślinach wyższych i zielonych algach.

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Tutaj opisany jest protokół do generowania regulowanych światłem i odwracalnych wzorców białkowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną na sztucznych błonach lipidowych. Metoda polega na zlokalizowanej fotoaktywacji białka iLID (ulepszonego dimeru indukowanego światłem) unieruchomionego na błonach modelowych, które w świetle niebieskim wiąże się ze swoim białkiem partnerskim Nano (SspB typu dzikiego).

Dynamiczne wzorce białek indukowane światłem na błonach modelowych

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Naucz się izolować kompleksy FCP z okrzemki Cyclotella meneghiniana i włączać je w liposomy z lipidami tylakoidowymi. Ta metoda umożliwia badanie transferu energii wzbudzenia w kontrolowanych warunkach jonowych i pH.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Przeglądaj więcej filmów