Name: Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metody wykrywania rybonukleotydów w DNA drożdży i pomiaru ich mutagenezy. Elektroforeza alkaliczna oraz hybrydyzacja Southern blot pozwalają ilościowo ocenić inkorporację i stabilność genomową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim obecnym i byłym członkom Kunkel Lab za ich pracę i dyskusje związane z protokołem i ponownie wykorzystanymi danymi przedstawionymi tutaj. Prace te były wspierane przez Projekt Z01 ES065070 do T.A.K. z Wydziału Badań Wewnętrznych Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS).

1. Hydroliza alkaliczna i Southern Blot specyficzna dla nici (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Wzrost komórek i izolacja genomowego DNA
	<ol>
		<li>Wyizoluj genomowe DNA drożdży za pomocą zestawu do oczyszczania DNA drożdży zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj kultur, które znajdują się w wykładniczej fazie wzrostu (od gęstości optycznej od 0,5 do 1). Zawiesić końcowe osady DNA w 35 ml 1x buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)).</li>
		<li>Dodać 1 ml 5 mg/ml RNazy A do DNA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wytrącić DNA za pomocą 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu przez 20 minut na lodzie.</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
		<li>Umyj granulat dwukrotnie 500 ml 70% etanolu. Usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
		<li>Wysuszyć osad na ławce i ponownie zawiesić w 35 ml 1x bufor TE.</li>
		<li>Określ ilościowo DNA za pomocą fluorymetru (tabela materiałów) z zestawem do oznaczania dsDNA BR</li>.
		<li>Wytrącić 5 mg DNA z każdej próbki, używając 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości 100% EtOH dla całkowitej objętości 200 ml (dodaćH2O, jeśli to konieczne, dodatkowe 5 mg DNA jest potrzebne, jeśli konieczna jest kontrola neutralnego żelu). Inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
		<li>Wysuszyć pellet na ławce. Zawiesić DNA w 14 mlH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hydroliza alkaliczna i elektroforeza żelowa
	<ol>
		<li>Dodać 6 ml 1 M KOH i inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Próbki należy inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
		<li>Dodaj 4 ml 6x alkalicznego buforu ładującego DNA: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0, 18% polisacharozy (tabela materiałów), 0,15% zieleni bromokrezolowej i 0,25% cyjanolu ksylenu FF.</li>
		<li>Odlej żel alkaliczny, który składa się z 1% agarozy, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Użyj grzebienia, który pozwala na załadowanie 24 ml próbki DNA na pas</li>.
		<li>Uruchom żel w temperaturze pokojowej w 1x alkaliczny bufor do elektroforezy: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Dołącz odpowiedni marker wielkości DNA.</li>
		<li>Krótko odkręć probówki i załaduj całą próbkę o objętości 24 ml do alkalicznego żelu agarozowego. Elektroforeza przez 30 minut przy 30 V, a następnie 18 - 20 h przy 10 V.</li>
		<li>Neutralizować żel przez 2 inkubacje po 45 minut każda w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem w buforze neutralizacyjnym I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M NaCl.</li>
		<li>Wybarwić DNA, mocząc zobojętniony żel w 200 ml wody zawierającej rozcieńczenie 1/10 000 barwnika SYBR Gold przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.</li>
		<li>Wizualizacja DNA za pomocą transiluminatora UV. Zwiększona wrażliwość na alkalia powoduje pojawienie się mniejszych fragmentów DNA, co wskazuje na większą gęstość nienaprawionych rybonukleotydów w DNA5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przelew południowy
	<ol>
		<li>Przenieś DNA z żelu alkalicznego do dodatnio naładowanej membrany nylonowej za pomocą działania kapilarnego10. Przykład tego, jak można skonfigurować ten transfer, znajduje się w podręczniku Sambrooka i Russella class10.</li>
		<li>Moczyć żel alkaliczny przez 15 minut w temperaturze pokojowej w alkalicznym buforze transferowym: 0,4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>Membranę nylonową (przyciętą do rozmiaru żelu) zwilżyć krótko wodą, a następnie moczyć przez 5 minut w alkalicznym buforze transferowym.</li>
		<li>Ustaw platformę transferową, odwracając 3 szklane zlewki (100 ml) w szklanym naczyniu do pieczenia. To danie powinno być nieco większe niż rozmiar żelu agarozowego. Postaw na nich szklany talerz.</li>
		<li>Na szklanej płytce ułożyć 2 duże kawałki bibuły chromatograficznej CHR o grubości 3 mm (przycięte do rozmiaru szerokości żelu plus dłuższe boki, które mogą zwisać po krawędziach do zbiornika buforowego).</li>
		<li>Wlej alkaliczny bufor transferowy na bibułę chromatograficzną i napełnij szklane naczynie do połowy. Wygładź bąbelki za pomocą szklanej pipety o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Na wierzch nałóż żel agarozowy, ponownie wygładzając bąbelki. Otocz wszystkie krawędzie żelu parafilmem. Wlej niewielką ilość Alkaline Transfer Buffer na żel.</li>
		<li>Umieść wstępnie nasączoną nylonową membranę na wierzchu żelu. Wygładź bąbelki.</li>
		<li>Zwilż 2 kawałki papieru pocięte na rozmiar żelu agarozowego. Umieść je na membranie i wygładź wszelkie pęcherzyki.</li>
		<li>Ułóż duży stos ręczników papierowych (przyciętych do rozmiaru nieco większego niż żel agarozowy) na wierzchu kanapki z transferem. Ostrożnie umieść szklany talerz na ręcznikach papierowych. Na wierzch dodaj obciążony przedmiot (dobrze sprawdza się książka o masie 400 g).</li>
		<li>Pozostaw transfer na noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie rozebrać stos transferowy i moczyć membranę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w buforze neutralizacyjnym II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Sieciuj DNA z naładowaną membraną nylonową za pomocą środka sieciującego UV. Umieść membranę w urządzeniu sieciującym i użyj ustawienia automatycznego sieciowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sondy południowej 
	Uwaga: Opisane tutaj podejście do wykrywania miejsc wrażliwych na alkalia w powstającej nici wiodącej i opóźnionej nici DNA opiera się na protokole opublikowanym wcześniej11. W naszym eksperymencie sondowanie przeprowadza się na genie reporterowym URA3, który został wstawiony w jednej z dwóch orientacji (OR1 lub OR2) sąsiadujących z początkiem replikacji ARS306 na chromosomie III (<silna klasa = "xfig">Figura 3A). Obecność miejsc wrażliwych na zasady w genomowym DNA drożdży jest wskaźnikiem inkorporacji rybonukleotydów, co pozwala na wykorzystanie rybonukleotydów jako biomarkerów aktywności polimerazy DNA12,13,14. To podejście, wykorzystujące docelową sekwencję DNA sąsiadującą z wydajnym początkiem replikacji ARS306, powinno być również podatne na inne lokalizacje genomowe i geny docelowe.
	<ol>
		<li>Amplifikacja PCR 520-parowego segmentu genu reporterowego URA3 przy użyciu następującej pary starterów: URA3-F1 (5'-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) i URA3-R1 (5'-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Przeprowadzić reakcję PCR używając 10 - 20 ng genomowego DNA drożdży jako matrycy, 4 μL każdego startera (10 μM zapasu), 10 μL 10x buforu Ex Taq (Mg2+ plus), 8 μL mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy), 0,5 μL polimerazy DNA Ex Taq (5 U/μL), i dostosować końcową objętość do 100 μl za pomocąH2O.</li>
		<li>Uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 5 min; 30 cykli po 95 °C przez 1 min, 55 °C przez 1 min, 72 °C przez 2 min; 72 °C przez 10 min i utrzymuj w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i eluuj DNA za pomocą 50 mlH2O. Można go teraz wykorzystać jako matrycę w reakcji znakowania radioaktywnego.</li>
		<li>Użyj następujących starterów do znakowania radioaktywnego specyficznego dla nici: Użyj URA3-A (5'-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) do wizualizacji DNA, które wyżarza się w celu sondowania A. Odpowiada to powstającej wiodącej nici DNA, gdy URA3 znajduje się w OR2 i powstającemu opóźnionemu DNA nici, gdy URA3 jest w OR1. Użyj URA3-B (5'-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) do wizualizacji powstającego DNA, które wyżarza się do sondy B. Odpowiada to powstającej wiodącej nici DNA, gdy URA3 znajduje się w OR1 i powstającemu opóźnionemu DNA nici, gdy URA3 jest w OR2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).
		<ol>
			<li>Przeprowadzić reakcję znakowania radioaktywnego przy użyciu 10 - 20 ng amplifikowanego fragmentu URA3 jako matrycy DNA, 2 μL startera (10 μM zapasu), 5 μL 10x buforu Ex Taq (Mg2+ plus), 4 μL 2,5 mM dNTP (minus dCTP), 5 μL (50 μCi) a-32 P-dCTP, 0,5 μL polimerazy DNA ExTaq (5 U/μL) i dostosować końcową objętość do 50 μL za pomocą H2O. Uruchomić następujący program do znakowania radioizotopowego: 94 °C przez 5 min; 25 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 min, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min; 72 °C przez 5 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj kolumny wirującej G-25, aby usunąć niewbudowaną radioaktywną etykietę. Przed dodaniem próbki znakowanej izotopem promieniotwórczym należy odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 720 x g i usunąć bufor przez pipetowanie. Załadować znakowany radioaktywnie produkt reakcji i odwirować przez 2 minuty przy 720 x g, aby wymyć znakowaną sondę.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu denaturacji sondy bezpośrednio przed hybrydyzacją. Ostudzić krótko na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja południowa
	<ol>
		<li>Zwiń zwilżoną membranę do probówki hybrydyzacyjnej i dodaj 25 ml świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego: 0,5 M buforu fosforanu sodu, pH 7,2, 7% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 1-2 godziny z rotacją w piecu do hybrydyzacji.</li>
		<li>Ostrożnie wylać roztwór i dodać 25 ml buforu hybrydyzacyjnego oraz sondę znakowaną radioizotopem. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 16 - 18 godzin na zmianach.</li>
		<li>Roztwór przelać do pojemnika na odpady radioaktywne. Wykonaj 5 płukań po 5 minut każde w temperaturze pokojowej roztworem myjącym Phosphate-SDS I: 40 mM bufor fosforanowo-sodowy, pH 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, pH 8,0.</li>
		<li>Wykonać 2 płukania po 15 minut każde w temperaturze 65 °C roztworem myjącym Phosphate-SDS II: 40 mM bufor fosforanowo-sodowy, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.</li>
		<li>Usuń membranę z probówki hybrydyzacyjnej za pomocą pęsety i umieść w otwartej plastikowej osłonie rękawa. Przykryj i wystaw na płytce obrazowej. Wypróbuj kilka różnych czasów naświetlania, od 4 godzin do 4 dni.</li>
		<li>W razie potrzeby usuń i ponownie wysonduj blot za pomocą innej sondy około 3 - 4 razy. Aby usunąć izolację, inkubować błonę przez 2 godziny w temperaturze 65 °C w 25 ml 50% formamidu, 2x roztwór SSPE. 
		Uwaga: 20x roztwór podstawowy SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,4.</li>
		<li>Roztwór przelać do pojemnika na odpady radioaktywne. Wykonać 2 płukania po 15 minut każde w temperaturze 65 °C w roztworze myjącym Phosphate-SDS II.</li>
		<li>Sprawdź membranę za pomocą licznika Geigera i powtórz protokół usuwania, jeśli sygnał pozostał.</li>
		<li>Przeprowadź wstępną hybrydyzację i hybrydyzację zgodnie z powyższym opisem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pomiar częstości mutacji i swoistości w szczepach S. cerevisiae
<ol>
	<li>Przygotuj kulturę komórkową
	<ol>
		<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię (zdrowe komórki drożdży potrzebują 2 - 3 dni w temperaturze 30 °C, aby utworzyć kolonie o odpowiedniej wielkości) wyhodowaną na agarze YPD uzupełnionym 100 mg / ml adeniny do 5 ml bulionu YPDA uzupełnionego 250 mg / ml adeniny (suplementacja adeniny jest konieczna tylko wtedy, gdy użyty szczep jest auksotrofem adeniny). Hodować w inkubatorze z wytrząsarką lub na rotatorze w temperaturze 30 °C, aż kultura osiągnie nasycenie (36 - 48 godzin w przypadku odmiany bez poważnych wad wzrostu).</li>
		<li>Wiruj komórki w temperaturze ~2000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i przemyć komórki 5 ml sterylnej wody.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 ml sterylnej wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczanie hodowli komórkowej i posiewanie
	<ol>
		<li>W przypadku kontroli bez selekcji należy rozcieńczyć komórki na 96-dołkowej płytce przez współczynnik 1 600 000 i rozlać 100 ml każdej kultury na kompletną płytkę (COM).</li>
		<li>Aby dokonać selekcji mutantów ura3, należy umieścić 100 ml nierozcieńczonych komórek na płytce 5-FOA dla szczepu typu dzikiego (WT). Odpowiednio rozcieńczyć komórki, jeśli oczekuje się, że szybkość mutacji interesującego nas szczepu będzie wyższa niż w szczepie WT.</li>
		<li>Aby wybrać mutanty can1, rozcieńczyć komórki 5-krotnie i umieścić 100 ml na płytce zawierającej kanawaninę (CAN) dla szczepu WT. Współczynnik rozcieńczenia wynosi 0,5.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C, aż utworzą się kolonie drożdży. W przypadku odmian bez wady wzrostu zwykle wystarczają 2-3 dni w przypadku płytek COM i CAN oraz 3-5 dni w przypadku płytek 5-FOA. Aby porównać tempo mutacji między różnymi szczepami, najlepiej wybrać ten sam dzień wzrostu, aby policzyć kolonie. Płytki gotowe do policzenia przechowywać w chłodni (~4 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie współczynnika spontanicznych mutacji
	<ol>
		<li>Policz widoczne kolonie na każdej tabliczce i zanotuj numery kolonii</li>
		<li>Oblicz szybkość mutacji za pomocą wzoru Drake'a: μ = f ÷ ln (μNt). f jest częstością mutacji obliczoną na podstawie liczby mutantów podzielonej przez liczbę komórek w końcowej hodowli. Nt to liczba komórek w końcowej hodowli, a μ to szybkość mutacji. Równanie to można rozwiązać za pomocą metody iteracyjnej, takiej jak metoda Newtona-Raphsona. Istnieją inne metody estymatora, w tym test Lea i Coulsona, do obliczania współczynnika mutacji15.</li>
		<li>Obliczyć przedział ufności przy założeniu logarytmicznego rozkładu normalnego szybkości użycia poszczególnych izolatów. Najczęściej stosuje się 95% przedział ufności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza spektrum mutacji
	<ol>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię z każdej płytki 5-FOA lub CAN i odśwież na talerzu YPDA.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR kolonii w celu amplifikacji genu i sekwencji URA3 lub CAN1 w celu wykrycia mutacji przy użyciu następujących starterów: URA3-F (5'-CGCATATGTGTGTTGAAGAA-3') i URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') zarówno do amplifikacji PCR, jak i sekwencjonowania genu URA3 o długości 800 pz; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') i CAN1-R (5'-CAGAGTTCTCTAGACTTC-3') do amplifikacji oraz CAN1-AR (5'- TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'- CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'- GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') i CAN1-BR (5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') do sekwencjonowania genu reporterowego CAN1 1800 pz.</li>
		<li>Aby przeprowadzić PCR kolonii, ponownie zawieś pojedynczą kolonię w 5 μlH2Oi użyj 1 μl jako matrycy. Dodać 1 μl każdego ze starterów (5 μM zapasu), 2 μL 5x buforu KAPA2G (Mg2+ plus), 0,5 μl dNTP (2,5 mM), 0,5 μL szybkiej polimerazy DNA KAPA2G, 12 μLH2O.</li>
		<li>W celu amplifikacji genu URA3 uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 5 minut; 5 cykli 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s; 35 cykli 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 2 minuty i utrzymuj w temperaturze 4 °C. W celu amplifikacji genu CAN1 uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 5 min; 5 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 45 s; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 45 s; 72 °C przez 2 minuty i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dopasuj wyniki sekwencjonowania do sekwencji referencyjnej za pomocą programu, takiego jak DNASTAR, Seqman Pro lub Sequencher w celu identyfikacji mutacji.</li>
		<li>Skompiluj dane dotyczące mutacji według typu mutacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4) lub lokalizacji mutacji (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 5). Obliczyć określone wskaźniki mutacji przez częstość mutacji (liczba zaobserwowanych zdarzeń podzielona przez liczbę zsekwencjonowanych mutantów) pomnożoną przez ogólny wskaźnik mutacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+sugar%3A+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li>
<li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja990592p">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li>
<li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+in+DNA%3A+origins%2C+repair+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li>
<li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).</li>
<li>Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luria-Delbruck+fluctuation+experiments%3A+design+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li>
<li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Research%22%5BJournal%5D)">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li>
<li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li>
<li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li>
<li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha%2C+epsilon%2C+delta%2C+and+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+%7Balpha%7D+and+%7Bdelta%7D%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li>
<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokoły dla dwóch zestawów eksperymentów, które są często używane do półilościowej analizy rybonukleotydów włączonych podczas replikacji DNA oraz mutagennego działania nienaprawionych rybonukleotydów. Chociaż podejścia te obejmują modelowego eukarionta S. cerevisiae, techniki te można łatwo dostosować do innych drobnoustrojów, a nawet wyższych eukariontów.
Sondowanie w poszukiwaniu nienaprawionych rybonukleotydów w DNA za pomocą elektroforezy alkaliczno-agaro...

Podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA, rybonukleotydy są włączane do genomu przez wszystkie trzy główne repliki DNA, polimerazy DNA (Pols) α, ε, oraz δ1,2. Naprawa przez wycięcie rybonukleotydu zależna od RNazy H2 (RER3) usuwa większość tych osadzonych rybonukleotydów.
Rybonukleotyd w DNA jest podatny na hydrolizę, ponieważ grupa hydroksylowa 2' ugrupowania cukrowego może atakować sąsiednie wiązanie fosfodiestrowe, uwalniając jeden koniec z cyklicznym fosforanem 2'-3', a drugi z 5'-OH4. Warunki alkaliczne mogą znacznie przyspieszyć tę reakcję. Tak więc hydroliza rybonukleotydów osadzonych podczas inkubacji w roztworze zasadowym powoduje fragmentację genomowego DNA, którą można uwidocznić za pomocą elektroforezy alkaliczno-agarozowej5. To DNA można przenieść do błony i sondować za pomocą analizy Southern blot przy użyciu sond specyficznych dla nici, które umożliwiają identyfikację miejsc wrażliwych na alkalia spowodowanych przez rybonukleotydy włączone odpowiednio do powstającego DNA o nici wiodącej lub opóźnionej.
W komórkach drożdży pozbawionych aktywności RNazy H2 usuwanie rybonukleotydów może być zainicjowane, gdy topoizomeraza I (Top1) nacina DNA w osadzonym rybonukleotydzie6,7. Jednakże, gdy Top1 rozszczepia się po stronie 3' rybonukleotydu, generuje to 5'-OH i 2'-3' cykliczne końce fosforanowego DNA, które są oporne na religację. Brak naprawy lub nieprawidłowe przetwarzanie tych "brudnych końców" może prowadzić do niestabilności genomu. Ponadto, jeśli nacięcie nastąpi w obrębie powtarzającej się sekwencji DNA, proces naprawy może prowadzić do mutacji delecyjnych. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku powtórzeń tandemowych, w których często obserwuje się krótkie delecje (od dwóch do pięciu par zasad) w komórkach z niedoborem RNazy H2. Szkodliwe efekty zależne od Top1 przy braku aktywności drożdżowej RNazy H2 nasilają się w zmutowanej polimerazie DNA ε (pol2-M644G) skłonnej do włączania rybonukleotydów podczas powstającej syntezy nici wiodącej.
Przetwarzanie rybonukleotydów w DNA prowadzi do spontanicznych mutacji, a ta mutageneza może być wykryta za pomocą odpowiednich genów reporterowych i selekcji pod kątem towarzyszącej zmiany fenotypowej. Test fluktuacji lub eksperyment Lurii i Delbrücka jest jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru wskaźników spontanicznych mutacji przy użyciu wybieralnych genów reporterowych8,9. U drożdży geny URA3 i CAN1 mogą być wykorzystywane jako reportery w teście mutacji do przodu, co pozwala na wykrycie wszystkich typów mutacji, które powodują utratę funkcji genu. Częstość spontanicznych mutacji szacuje się jako medianę obserwowaną dla wielu równoległych kultur, które rozpoczęły się od pojedynczych kolonii bez mutacji w docelowym genie reporterowym. Szczep drożdży z niedoborem RNazy H2, taki jak rnh201Δ, ma umiarkowanie podwyższony ogólny wskaźnik spontanicznych mutacji, który jest w dużej mierze spowodowany zwiększoną częstością występowania delecji 2 - 5 pz w sekwencjach powtórzeń tandemowych. W związku z tym, aby w pełni scharakteryzować mutagenne działanie rybonukleotydów w genomie, należy określić konkretne tempo mutacji. W takim przypadku geny reporterowe URA3 lub CAN1 mogą być amplifikowane i sekwencjonowane w celu określenia typów i lokalizacji mutacji, a także można obliczyć określone wskaźniki mutacji. Kompilacja mutacji zidentyfikowanych w wielu niezależnych mutantach URA3 lub CAN1 może być następnie wykorzystana do wygenerowania spektrum mutacji.

<table><tbody><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> YPD <td>20 g dekstrozy, 20 g peptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego, w dejonizowanym H2O do 1 l, dodać 20 g agaru Bacto do pożywek stałych, autoklaw.</td></tr><tr><td>Płytki</td><td></td><td></td> COM <td>1,3 g SC dropout mix, 1,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów lub (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dekstrozy, 20 g Bacto agar dejonizowany H2O do 1 L. Dostosuj pH do 5,8. Autoklaw i 30 &ndash; 35 ml na talerz.</td></tr><tr><td>Płytki CAN</td> 1,3 g proszku SC-Ura, 1,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów <td></td><td></td><td>lub (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dekstrozy, 20 g agaru Bacto, 25 mg uracylu i H2O do 1 L. Autoklaw przez 15 minut w temperaturze 121 &deg; C i schłodzić do 56 stopni C. Dodać 6 ml sterylizowanego przez filtr 1% roztworu siarczanu kanawaniny.</td></tr><tr><td>5 płytek</td><td></td><td></td> FOA <td>1,3 g proszku SC-Ura, 1,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów lub (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dekstrozy, 20 g agaru Bacto, 25 mg uracylu i H2O do 800 ml. Autoklaw przez 15 minut w temperaturze 121 stopni; C i schłodzić do 60 stopni C. Dodać 200 ml wysterylizowanego przez filtr 0,5% roztworu 5-FOA.</td></tr><tr><td>Siarczan L-kanawaniny</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 ml szklana probówka</td><td></td><td></td><td>hodowlana Dowolna marka</td></tr><tr><td>Rotator kultur w 30 & stopniach; Inkubator</td><td></td><td></td> C Zamiast <td>tego można użyć inkubatora z wytrząsarką</td></tr><tr><td>96 dołków</td><td></td><td></td><td>Okrągłe płytki denne Sterylne, dowolnej marki</td></tr><tr><td>Koraliki szklane 3 mm</td><td>Autoklaw Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td> 12-kanałowe <td>Dowolna marka</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polimeraza</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Drożdże DNA Zestaw do oczyszczania</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometr</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Dostępny nowszy model</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania dsDNA BR</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>Zieleń bromokrezolowa</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenu FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8,0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Żel kwasu nukleinowego Bejca</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Transformator</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>Membrana nylonowa Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Bibuła chromotograficzna</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Kolumna wirująca</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Bufor fosforanowy sodu (pH 7,2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr>Licznik <td></td><td></td><td></td><td>Geigera</td></tr></tbody></table>

badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Wykazano, że obecność rybonukleotydów w jądrowym DNA jest źródłem niestabilności genomu. Stopień włączenia rybonukleotydów można ocenić za pomocą hydrolizy alkalicznej i elektroforezy żelowej, ponieważ RNA jest bardzo podatne na hydrolizę w warunkach zasadowych. To, w połączeniu z analizą Southern blot, może być wykorzystane do określenia lokalizacji i nici, do której zostały włączone rybonukleotydy. Jednak ta procedura jest tylko częściowo ilościowa i może nie być wystarczająco czuła, aby wykryć niewielkie zmiany w zawartości rybonukleotydów, chociaż sondowanie Southern blot specyficzne dla nici poprawia czułość. Jako miara jednej z najbardziej uderzających konsekwencji biologicznych rybonukleotydów w DNA, mutageneza spontaniczna może być analizowana za pomocą testu mutacji do przodu. Za pomocą odpowiednich genów reporterowych można wybrać rzadkie mutacje, które powodują utratę funkcji, a ogólne i specyficzne wskaźniki mutacji można zmierzyć, łącząc dane z eksperymentów fluktuacyjnych z sekwencjonowaniem DNA genu reporterowego. Test fluktuacji ma zastosowanie do badania szerokiej gamy procesów mutagennych w określonym tle genetycznym lub warunkach wzrostu.

Obróbka genomowego DNA zasadą, a następnie alkaliczna elektroforeza żelowa, pozwala na półilościowe wykrywanie fragmentacji DNA ze względu na obecność stabilnie włączonych rybonukleotydów. Rysunek 2 przedstawia obrazy żelu z genomowym DNA drożdży poddanym lub nie obróbce KOH5. Wariant M644L Pol2, katalitycznej podjednostki Polε, wykazuje zmniejszoną zdolność do włączania rybonukleotydów, podczas gdy mutant M644G włącza więcej rybonukle...

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania, takie jak to, ile rybonukleotydów jest włączonych do powstającej, wiodącej i opóźnionej nici DNA w genomie. Chociaż metoda ta może dostarczyć ilościowych i jakościowych informacji dotyczących gęstości rybonukleaotydów w genomie drożdży, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak genomy ssaków. Elektroforeza w żelu alkalicznym zapewnia półilościowy obraz włączenia rybonukleotydów do całego genomu, a specyficzne dla nici southern blot pozwala na większą czułość i ilościowe oznaczanie w określonym locus genomu.Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj sześć mikrolitrów jednego molowego wodorotlenku potasu do każdej próbki świeżo przygotowanego genomowego DNA drożdży i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwóch godzinach inkubować próbki na lodzie przez pięć minut. Następnie dodaj do każdej próbki cztery mikrolitry 6-6 alkalicznego buforu ładującego DNA.Odlać żel alkaliczny składający się z jednego procenta agarozy, 50 milimolowego wodorotlenku sodu i jednego milimolowego EDTA o pH osiem za pomocą grzebienia, który pozwala na załadowanie 24 mikrolitrów próbki DNA na pas. Krótko odkręć probówki z próbkami. Załaduj całe 24 mikrolitry każdej próbki do alkalicznego żelu agarozowego.Dołącz odpowiedni marker wielkości DNA. Elektroforeza pod napięciem 30 V przez 30 minut. Następnie obniż napięcie do 10 woltów i elektroforuj przez 18 do 20 godzin.Następnego dnia zneutralizuj żel. Zanurzyć żel w buforze neutralizacyjnym i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 45 minut. Zastąp mieszankę buforu neutralizującego świeżym buforem.I inkubować przez kolejne 45 minut. Aby zabarwić DNA, namocz zneutralizowany żel w 200 mililitrach wody zawierającej rozcieńczenie od jednego do 10000 barwienia złota sybr w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez dwie godziny. Wizualizacja DNA za pomocą transiluminatora UV.DNA z żelu alkalicznego zostanie przeniesione do dodatnio naładowanej membrany nylonowej przez działanie kapilarne. Najpierw namocz żel alkaliczny w temperaturze pokojowej przez 15 minut w alkalicznym buforze transferowym. Następnie krótko zwilż nylonową membranę wodą i zanurz ją w alkalicznym buforze transferowym na pięć minut.Ustaw platformę transferową, odwracając trzy szklane zlewki o pojemności 100 mililitrów w szklanym naczyniu do pieczenia, które jest nieco większe niż rozmiar żelu agarozowego. Umieść szklaną płytkę na szklanych zlewkach. Ułóż dwa duże kawałki trzech bibuł chromatograficznych MMCHR na szklanej płytce.Wlać alkaliczny bufor transferowy na bibułę chromatograficzną i napełnić szklane naczynie do połowy. Wygładź bąbelki za pomocą pięciomililitrowej szklanej pipety. Na wierzchu ułożyć żel agarozowy.Ponownie, wygładzanie bąbelków. Otocz wszystkie krawędzie żelu parafilmem. Wlej niewielką ilość alkalicznego buforu transferowego na żel.Umieść wstępnie nasączoną nylonową membranę na wierzchu żelu i wygładź pęcherzyki. Połóż dwa kawałki bibuły chromatograficznej przycięte do rozmiaru żelu agarozowego. Umieść je na membranie i wygładź wszelkie pęcherzyki.Umieść duży stos ręczników papierowych na wierzchu kanapki do przenoszenia i ostrożnie umieść szklany talerz na ręcznikach papierowych. Dodaj obciążony przedmiot na górę i pozwól transferowi postępować w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia ostrożnie rozebrać stos transferowy.Namocz membranę w temperaturze pokojowej w drugim buforze neutralizacyjnym na 15 minut. Usieciuj DNA z naładowaną membraną nylonową za pomocą środka sieciującego UV. Użyj ustawienia automatycznego sieciowania.Przed rozpoczęciem procedury hybrydyzacji należy przygotować sondę znakowaną radioizotopem zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zwiń zwilżoną membranę do probówki hybrydyzacyjnej i dodaj 25 mililitrów świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego. Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza z rotacją w piecu hybrydyzacyjnym przez jedną do dwóch godzin.Ostrożnie odlej roztwór i dodaj 25 mililitrów buforu hybrydyzacyjnego plus sondę. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin na zmianę. Następnie wylej roztwór do pojemnika na odpady radioaktywne.Dodaj fosforanowy roztwór myjący STS jeden do probówki hybrydyzacyjnej i obracaj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W ten sposób wykonaj pięć przemyć po pięć minut każde, z fosforanowym roztworem myjącym STS. Po piątym przepłukaniu fosforanowym roztworem myjącym STS należy przepłukać membranę dwukrotnie, fosforanowym roztworem myjącym STS, dwa razy po 15 minut, za każdym razem w temperaturze 65 stopni Celsjusza z rotacją.Użyj pęsety, aby usunąć membranę z probówki hybrydyzacyjnej i umieść membranę w otwartej plastikowej osłonie rękawa. Przykryj i wystaw na płytce obrazowej. W razie potrzeby usuń i ponownie zbadaj blot za pomocą innej sondy.Aby usunąć izolację, przykryj membranę 25 mililitrami 50-procentowego roztworu formamidu 2XSSPE i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Roztwór przelać do pojemnika na odpady radioaktywne. Dodaj fosforanowy roztwór myjący STS dwa do probówki hybrydyzacyjnej i obracaj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut.Sprawdź membranę za pomocą licznika Geigera, aby potwierdzić brak sygnału przed wykonaniem prehybrydyzacji i hybrydyzacji, jak pokazano wcześniej. Te obrazy żelu mają genomowe DNA drożdży traktowane wodorotlenkiem potasu lub bez niego, co pokazuje, że komórki pozbawione RNH2 zachowują więcej rybonukleotydów w genomie. Wariant M644L polimerazy drugiej zmniejsza zdolność do włączania rybonukleotydów, podczas gdy mutant M644G zawiera więcej rybonukleotydów niż polimeraza typu dzikiego.Alkaliczny żel agarozowy można dodatkowo badać za pomocą analizy southern blot specyficznej dla nici. W tym przykładzie sondy wyżarzają się do powstającej wiodącej nici DNA w genie reporterowym URA3, który został wstawiony w pobliżu ARS306 w dwóch przeciwnych orientacjach. Reprezentatywne wyniki southern blotting przy użyciu powstających sond specyficznych dla nici wiodącej pokazują wzór fragmentacji DNA spowodowany rozszczepieniem zasad w rybonukleotydach i powstających wiodących niciach DNA w szczepie typu dzikiego oraz w szczepach wyrażających warianty polimeraz alfa, delta i epsilon, które są promiskuityczne do inkorporacji rybonukleotydów.Ten wykres pokazuje kwantyfikację sygnału promieniotwórczego przez ułamek całkowitej wartości na każdym pasie od południowego blota. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać, aby zawsze używać świeżo wyizolowanego DNA z komórek twarzy zamkniętej. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się naprawą DNA do ilościowego określenia gęstości i nici, do której rybonukleotydy zostały włączone przez replikacyjne polimerazy DNA.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak hydrolatowane sekwencjonowanie końców lub HydEn-seq, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja rybonukleotydów w genomie. Nie zapominaj, że praca z materiałami radioaktywnymi może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy podjąć środki ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia stołu warsztatowego i sprzętu podczas wykonywania tej procedury.

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badania genetyczne na drożdżach mogą być wykorzystywane do badania funkcji molekularnych i komórkowych ludzkich genów w komórkowym metabolizmie DNA. Opisano metody genetycznej charakterystyki produktu ludzkiego genu WRN, którego defekt występuje w zespole Wernera – chorobie objawiającej się przedwczesnym starzeniem się, w funkcjonalnie konserwowanych szlakach, wykorzystując drożdże jako przystępny system modelowy.

Badania genetyczne białek naprawy DNA u ludzi z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Poziom w stanie stacjonarnym określonych mRNA jest określany przez szybkość syntezy i rozpadu mRNA. Tempo degradacji mRNA w całym genomie lub tempo rozpadu określonych mRNA można zmierzyć, określając okresy półtrwania mRNA. Protokół ten koncentruje się na pomiarze szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae.

Pomiar szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Tutaj opisujemy metodę umożliwiającą jednoczesne ilościowe oznaczanie i mapowanie całego genomu rybonukleotydów w wysoce nienaruszonym DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu, łącząc enzymatyczne rozszczepienie genomowego DNA z jego alkaliczną hydrolizą i późniejszym sekwencjonowaniem 5'-końca.

Jednoczesne mapowanie i oznaczanie ilościowe rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metody wykrywania rybonukleotydów w DNA drożdży i pomiaru ich mutagenezy. Elektroforeza alkaliczna oraz hybrydyzacja Southern blot pozwalają ilościowo ocenić inkorporację i stabilność genomową.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami (Wideo) | JoVE Journal

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Przeglądaj więcej filmów