Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami
26 lipca 2018
Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania, takie jak to, ile rybonukleotydów jest włączonych do powstającej, wiodącej i opóźnionej nici DNA w genomie. Chociaż metoda ta może dostarczyć ilościowych i jakościowych informacji dotyczących gęstości rybonukleaotydów w genomie drożdży, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak genomy ssaków. Elektroforeza w żelu alkalicznym zapewnia półilościowy obraz włączenia rybonukleotydów do całego genomu, a specyficzne dla nici southern blot pozwala na większą czułość i ilościowe oznaczanie w określonym locus genomu.
Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj sześć mikrolitrów jednego molowego wodorotlenku potasu do każdej próbki świeżo przygotowanego genomowego DNA drożdży i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwóch godzinach inkubować próbki na lodzie przez pięć minut. Następnie dodaj do każdej próbki cztery mikrolitry 6-6 alkalicznego buforu ładującego DNA.
Odlać żel alkaliczny składający się z jednego procenta agarozy, 50 milimolowego wodorotlenku sodu i jednego milimolowego EDTA o pH osiem za pomocą grzebienia, który pozwala na załadowanie 24 mikrolitrów próbki DNA na pas. Krótko odkręć probówki z próbkami. Załaduj całe 24 mikrolitry każdej próbki do alkalicznego żelu agarozowego.
Dołącz odpowiedni marker wielkości DNA. Elektroforeza pod napięciem 30 V przez 30 minut. Następnie obniż napięcie do 10 woltów i elektroforuj przez 18 do 20 godzin.
Następnego dnia zneutralizuj żel. Zanurzyć żel w buforze neutralizacyjnym i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 45 minut. Zastąp mieszankę buforu neutralizującego świeżym buforem.
I inkubować przez kolejne 45 minut. Aby zabarwić DNA, namocz zneutralizowany żel w 200 mililitrach wody zawierającej rozcieńczenie od jednego do 10000 barwienia złota sybr w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez dwie godziny. Wizualizacja DNA za pomocą transiluminatora UV.
DNA z żelu alkalicznego zostanie przeniesione do dodatnio naładowanej membrany nylonowej przez działanie kapilarne. Najpierw namocz żel alkaliczny w temperaturze pokojowej przez 15 minut w alkalicznym buforze transferowym. Następnie krótko zwilż nylonową membranę wodą i zanurz ją w alkalicznym buforze transferowym na pięć minut.
Ustaw platformę transferową, odwracając trzy szklane zlewki o pojemności 100 mililitrów w szklanym naczyniu do pieczenia, które jest nieco większe niż rozmiar żelu agarozowego. Umieść szklaną płytkę na szklanych zlewkach. Ułóż dwa duże kawałki trzech bibuł chromatograficznych MMCHR na szklanej płytce.
Wlać alkaliczny bufor transferowy na bibułę chromatograficzną i napełnić szklane naczynie do połowy. Wygładź bąbelki za pomocą pięciomililitrowej szklanej pipety. Na wierzchu ułożyć żel agarozowy.
Ponownie, wygładzanie bąbelków. Otocz wszystkie krawędzie żelu parafilmem. Wlej niewielką ilość alkalicznego buforu transferowego na żel.
Umieść wstępnie nasączoną nylonową membranę na wierzchu żelu i wygładź pęcherzyki. Połóż dwa kawałki bibuły chromatograficznej przycięte do rozmiaru żelu agarozowego. Umieść je na membranie i wygładź wszelkie pęcherzyki.
Umieść duży stos ręczników papierowych na wierzchu kanapki do przenoszenia i ostrożnie umieść szklany talerz na ręcznikach papierowych. Dodaj obciążony przedmiot na górę i pozwól transferowi postępować w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia ostrożnie rozebrać stos transferowy.
Namocz membranę w temperaturze pokojowej w drugim buforze neutralizacyjnym na 15 minut. Usieciuj DNA z naładowaną membraną nylonową za pomocą środka sieciującego UV. Użyj ustawienia automatycznego sieciowania.
Przed rozpoczęciem procedury hybrydyzacji należy przygotować sondę znakowaną radioizotopem zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zwiń zwilżoną membranę do probówki hybrydyzacyjnej i dodaj 25 mililitrów świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego. Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza z rotacją w piecu hybrydyzacyjnym przez jedną do dwóch godzin.
Ostrożnie odlej roztwór i dodaj 25 mililitrów buforu hybrydyzacyjnego plus sondę. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin na zmianę. Następnie wylej roztwór do pojemnika na odpady radioaktywne.
Dodaj fosforanowy roztwór myjący STS jeden do probówki hybrydyzacyjnej i obracaj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W ten sposób wykonaj pięć przemyć po pięć minut każde, z fosforanowym roztworem myjącym STS. Po piątym przepłukaniu fosforanowym roztworem myjącym STS należy przepłukać membranę dwukrotnie, fosforanowym roztworem myjącym STS, dwa razy po 15 minut, za każdym razem w temperaturze 65 stopni Celsjusza z rotacją.
Użyj pęsety, aby usunąć membranę z probówki hybrydyzacyjnej i umieść membranę w otwartej plastikowej osłonie rękawa. Przykryj i wystaw na płytce obrazowej. W razie potrzeby usuń i ponownie zbadaj blot za pomocą innej sondy.
Aby usunąć izolację, przykryj membranę 25 mililitrami 50-procentowego roztworu formamidu 2XSSPE i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Roztwór przelać do pojemnika na odpady radioaktywne. Dodaj fosforanowy roztwór myjący STS dwa do probówki hybrydyzacyjnej i obracaj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Sprawdź membranę za pomocą licznika Geigera, aby potwierdzić brak sygnału przed wykonaniem prehybrydyzacji i hybrydyzacji, jak pokazano wcześniej. Te obrazy żelu mają genomowe DNA drożdży traktowane wodorotlenkiem potasu lub bez niego, co pokazuje, że komórki pozbawione RNH2 zachowują więcej rybonukleotydów w genomie. Wariant M644L polimerazy drugiej zmniejsza zdolność do włączania rybonukleotydów, podczas gdy mutant M644G zawiera więcej rybonukleotydów niż polimeraza typu dzikiego.
Alkaliczny żel agarozowy można dodatkowo badać za pomocą analizy southern blot specyficznej dla nici. W tym przykładzie sondy wyżarzają się do powstającej wiodącej nici DNA w genie reporterowym URA3, który został wstawiony w pobliżu ARS306 w dwóch przeciwnych orientacjach. Reprezentatywne wyniki southern blotting przy użyciu powstających sond specyficznych dla nici wiodącej pokazują wzór fragmentacji DNA spowodowany rozszczepieniem zasad w rybonukleotydach i powstających wiodących niciach DNA w szczepie typu dzikiego oraz w szczepach wyrażających warianty polimeraz alfa, delta i epsilon, które są promiskuityczne do inkorporacji rybonukleotydów.
Ten wykres pokazuje kwantyfikację sygnału promieniotwórczego przez ułamek całkowitej wartości na każdym pasie od południowego blota. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać, aby zawsze używać świeżo wyizolowanego DNA z komórek twarzy zamkniętej. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się naprawą DNA do ilościowego określenia gęstości i nici, do której rybonukleotydy zostały włączone przez replikacyjne polimerazy DNA.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak hydrolatowane sekwencjonowanie końców lub HydEn-seq, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja rybonukleotydów w genomie. Nie zapominaj, że praca z materiałami radioaktywnymi może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy podjąć środki ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia stołu warsztatowego i sprzętu podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia podejścia eksperymentalne do oceny wbudowy rybonukleotydów do DNA podczas replikacji jądrowego DNA eukariotów. Zwraca ono uwagę na potencjalne efekty mutagenne rybonukleotydów w przypadku ich niewłaściwego usunięcia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Replikacja DNA
- Stabilność genomowa
- Mutageneza
Wstęp
- Rybonukleotydy to niekanoniczne nukleotydy występujące w DNA.
- Jeśli nie zostaną usunięte, mogą prowadzić do uszkodzeń DNA.
- Zrozumienie procesu ich wbudowywania jest kluczowe dla zachowania integralności genomu.
- Konieczne są metody ilościowego oznaczania wbudowanych rybonukleotydów.
Cel badania
- Ilościowe określenie wbudowania rybonukleotydów w DNA.
- Ocena mutagennych efektów rybonukleotydów.
- Opracowanie metod stosowalnych w różnych systemach genomicznych.
Zastosowane metody
- Alkaliczna elektroforeza w żelu do analizy półilościowej.
- Specyficzne dla nici southern blotting dla czułego oznaczania ilościowego.
- Zastosowanie traktowania wodorotlenkiem potasu dla próbek DNA.
- Inkubacja w kontrolowanych temperaturach dla uzyskania optymalnych wyników.
Główne wyniki
- Ilościowe dane dotyczące inkorporacji rybonukleotydów do DNA drożdży.
- Porównanie inkorporacji w nici prowadzącej i opóźnionej.
- Wnioski dotyczące potencjału mutagennego rybonukleotydów.
- Możliwość zastosowania metod w genomach ssaków.
Wnioski
- Rybonukleotydy stanowią zagrożenie dla stabilności genomu.
- Opracowane metody są skuteczne w ilościowym określaniu stopnia inkorporacji.
- Wyniki mają znaczenie dla zrozumienia mechanizmów uszkodzeń DNA.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Inkorporacja rybonukleotydów do genomowego DNA stanowi źródło niestabilności, która może zakłócać walidację celów terapeutycznych oraz proces identyfikacji związków wiodących podczas poszukiwania leków. Ilościowe określenie tej inkorporacji umożliwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie źródeł spontanicznej mutagenezy, która może zacierać zależności fenotypowo-genotypowe w modelach przedklinicznych. Możliwość ta zwiększa wiarygodność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków, pozwalając odróżnić rzeczywiste sygnały terapeutyczne od artefaktów wynikających z uszkodzeń DNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala ustalić, czy obserwowane fenotypy wynikają z zamierzonej modulacji celu, czy z uszkodzeń DNA indukowanych przez rybonukleotydy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia specyficzne dla nici ilościowe określenie poziomu ekspresji, co pozwala zredukować ryzyko błędnych hipotez dotyczących funkcji genów w systemach przesiewowych opartych na drożdżach.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie izogennych szczepów drożdży o określonych poziomach rybonukleotydów w celu uzyskania spójnego tła dla przeprowadzanych analiz.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kontrolę jakości genomicznego DNA, aby zmniejszyć zmienność w testach fluktuacyjnych i walidacji genów reporterowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pomiar szybkości mutogenezy indukowanej przez rybonukleotydy w celu oceny stabilności genetycznej systemów istotnych dla przebiegu choroby podczas długotrwałej hodowli.
- Wartość operacyjna: Wsparcie podłużnego monitorowania integralności genomowej w modelach przedklinicznych wykorzystywanych do optymalizacji wiodących związków.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy prac nad odkrywaniem leków, w których walidacja celu wymaga czystego tła genetycznego, szczególnie przy wykorzystaniu modeli drożdżowych do badania szlaków sygnałowych lub przesiewu fenotypowego.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, czy wbudowywanie rybonukleotydów przyczynia się do mutagenezy tła w testach fluktuacyjnych stosowanych do walidacji celu.
- Przesiewanie: Zapewnia spójność odczynników poprzez kwalifikację próbek DNA wykorzystywanych w walidacji konstruktów genetycznych metodą southern blot.
- Analityka: Generuje ilościowe dane specyficzne dla nici, które umożliwiają porównanie wariantów polimerazy lub tła genetycznego w kampaniach identyfikacji wiodących związków.
- Badania translacyjne: Śledzi wskaźniki stabilności genomowej, które informują o dostosowaniu ryzyka podczas przejścia z etapu hit-to-lead.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnie wykorzystywalny punkt kontroli jakości w zakresie integralności genomowego DNA w wielu platformach badawczych opartych na drożdżach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez kwantyfikację znanego źródła spontanicznej mutagenezy w przesiewach genetycznych.
- Wartość operacyjna: Wprowadza standaryzację przygotowania próbek DNA, co poprawia powtarzalność testów fluktuacyjnych oraz Southern blotting.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez kontrolę czynników zakłócających związanych z uszkodzeniami DNA w danych walidacji celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wskazywanie modeli z podwyższonym poziomem rybonukleotydów, które mogą wymagać strategii łagodzenia.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Doświadczenie w pracy z kwasami nukleinowymi, technikami z użyciem sond promieniotwórczych oraz hybrydyzacją typu Southern blot.
- Sprzęt do elektroforezy w żelu alkalicznym, urządzenie do sieciowania UV (UV cross-linker) oraz fosforimager do detekcji sygnału.
- Znormalizowane protokoły traktowania wodorotlenkiem potasu, neutralizacji oraz przenoszenia na membranę w celu zapewnienia spójności między laboratoriami.
- Kwestie adaptacyjne obejmują optymalizację projektu sond dla różnych loci genomowych oraz dostosowanie czasu hydrolizy do zmiennej jakości próbek DNA.
- Ograniczenia praktyczne obejmują półilościowy charakter żeli alkalicznych bez zastosowania Southern blotting oraz zagrożenia związane z materiałami promieniotwórczymi, które wymagają specjalistycznej utylizacji odpadów.
