Name: Wykorzystanie mysich splenocytów do oceny wpływu wzorca molekularnego związanego z patogenem na ekspresję genów zegarowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu wzorców molekularnych związanych z patogenem na ekspresję genów zegarowych w mysich splenocytach. Technika ta jest łatwa do wykonania i wysoko powtarzalna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Dziekanatu Kolegium Sztuki i Nauk na Uniwersytecie w Hartford.

Podczas badania, opieka nad zwierzętami i leczenie były zgodne z polityką National Institutes of Health, były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez University of Hartford Animal Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Porywanie zwierząt
UWAGA: W badaniu wykorzystano dwudziestotygodniowe samce myszy B6129SF2/J.
<ol>
	<li>Porwać myszy do 12-godzinnego cyklu światła (standardowe białe światło nad głową)/12-godzinnego cyklu ciemności przez 2 tygodnie przed eksperymentem. 
	UWAGA: Tutaj czas zeitgeber (ZT) 0 odpowiada włączonym światłom, a ZT12 wyłączonym światłom, przy jednoczesnym utrzymaniu wszystkich innych czynników środowiskowych (tj. żywności, wody i temperatury pokojowej) na stałym poziomie 21.</li>
</ol>
2. Przygotowanie instrumentów, pożywki hodowlanej i pożywki prowokacyjnej
<ol>
	<li>Kleszcze do autoklawu i nożyczki preparacyjne. Owiń pary matowych szkiełek mikroskopowych folią aluminiową i autoklawem.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do RPMI 1640 do końcowego stężenia 10%. Przygotować 10 ml pożywki prowokacyjnej w probówkach o pojemności 50 ml, dodając następujące PAMP do pożywki hodowlanej (RPMI z 10% FBS); LPS (5 μg/ml), ODN1826 (5 μg/ml), Listeria monocytogenes (10,8 HKLM/ml) lub inny PAMP w sugerowanym stężeniu.</li>
	<li>Ogrzać pożywkę hodowlaną i pożywkę prowokacyjną do temperatury 37 °C w łaźni wodnej i przechowywać około 70 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,2) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki hodowlanej za pomocą pipety 10 ml i przystawki do pipetowania do probówki o pojemności 50 ml i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Dodaj około 30 ml 70% etanolu do zlewki o pojemności 100 ml i umieść w niej końce nożyczek preparacyjnych i kleszczyków, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy do izolacji RNA, dodając 10 μl β-merkaptoetanolu (pod wyciągiem) do każdego 1 ml buforu RLT w probówce o pojemności 50 ml. Przygotuj tylko taką ilość, jaka będzie potrzebna (600 μl na próbkę, która składa się z około 1 x 106 komórek). 
	UWAGA: Buffer RLT jest składnikiem zestawu do ekstrakcji RNA, który wspomaga wiązanie RNA z membraną krzemionkową.</li>
</ol>
3. Izolacja i wyzwanie splenocytów
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji w określonym czasie za pomocą narkozy, trzymając je w oryginalnej klatce i dodając CO2 do klatki z natężeniem przepływu 3 l / min. Kontynuuj dostarczanie CO2 przez 1 minutę po ustaniu oddychania.</li>
	<li>Potwierdź zgon przez zwichnięcie szyjki macicy, umieszczając kciuk i palec wskazujący po obu stronach szyi u podstawy czaszki. Alternatywnie, naciśnij pręt u podstawy czaszki, jednocześnie szybko pociągając (drugą ręką) podstawę ogona lub kończyny tylne, aby spowodować oddzielenie kręgów szyjnych od czaszki22.</li>
	<li>Spryskaj pień myszy 70% etanolem i wytrzyj ręcznikiem papierowym. Połóż mysz na plecach i lekko przechyl na prawą stronę. Odetnij futro za pomocą nożyczek preparacyjnych wzdłuż lewej strony myszy, mniej więcej w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć otrzewną i ostrożnie wykonaj nacięcie, aby nie uszkodzić śledziony. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy i umieść w sterylnej probówce o pojemności 50 ml zawierającej około 10 ml pożywki hodowlanej na lodzie. Powtórz dla pozostałych zwierząt. 
	UWAGA: Śledziona ma kolor fasoli i jest dłuższa i bardziej płaska niż nerka.</li>
	<li>Przenieść jedną śledzionę z 2 ml pożywki hodowlanej na małą sterylną szalkę Petriego.
	<ol>
		<li>Homogenizuj śledzionę, mieląc ją między oszronioną częścią dwóch sterylnych matowych szkiełek. Jeśli to możliwe, trzymaj problem i komórki w pożywce podczas procesu homogenizacji.</li>
		<li>Po dokładnej homogenizacji odpipetować 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej splenocyty przez sitko do komórek nylonowych o średnicy 40 μm do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Powtórz powyższe kroki dla pozostałych śledzion, używając nowych par szkiełek matowych, probówek o pojemności 50 ml z pożywką hodowlaną i sitek komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 8 ml zimnej pożywki hodowlanej do każdej z 50 ml probówek zawierających splenocyty, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml / probówkę. Określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dodaj około 1 x 106 komórek/dołka do 6-dołkowych płytek hodowlanych. Dodaj komórki do liczby studzienek, które odpowiadają liczbie różnych PAMP używanych w eksperymencie i dołącz studzienkę kontrolną. Dodać 3 ml pożywki hodowlanej lub 3 ml pożywki prowokacyjnej do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 3 godziny.</li>
	<li>Zeskrob komórki z dna studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl dołączonej do mikropipety P1000. Przenieść pożywkę zawierającą komórki za pomocą tej samej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 167 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i przemyć osad komórkowy 5 ml PBS.</li>
	<li>Osadzać komórki po raz drugi w temperaturze 167 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i dodać 600 μl buforu do lizy komórek w celu lizy komórek. Następnie przejdź do izolacji RNA.</li>
</ol>
4. Izolacja RNA i synteza cDNA
<ol>
	<li>Wyizoluj RNA ze splenocytów za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta i przeprowadź "opcjonalne" trawienie DNA na kolumnie.</li>
	<li>Przed syntezą cDNA należy określić stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego, aby sprawdzić, czy stężenie mieści się w optymalnym zakresie RNA (do 2 μg) zestawu do syntezy cDNA.</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA dla każdej z próbek za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć 10 μl RNA dla każdej z próbek w całkowitej objętości reakcyjnej 20 μl. Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji (przebieg termocyklera) dodać 20 μl H2Odo każdej reakcji.</li>
	<li>Skonstruuj standardowe zakrzywienie za pomocą mikropipety P10 lub P20, aby zebrać mRNA z kilku próbek kontrolnych (np. 5 μl z 2 próbek, co daje łącznie 10 μl) w probówce o pojemności 0,5 ml w celu przygotowania cDNA.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μL 2x główna mieszanka odwrotnej transkryptazy.</li>
		<li>Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji dodać 10 μlH2Odo probówki reakcyjnej, która posłuży jako stężenie początkowe ("1") w szeregu rozcieńczeń dla krzywej wzorcowej.</li>
		<li>Wykonać 10-krotną serię rozcieńczeń (1 do 10-4), dodając 45 μl wody za pomocą mikropipety P100 lub P200 do czterech probówek o pojemności 0,5 ml oznaczonych jako 10-1, 10-2, 10-3 i 10-4.
		<ol>
			<li>Dodać 5 μl początkowego stężenia "1" do pierwszej probówki (10-1) za pomocą mikropipetatora P20, wymieszać przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść 5 μl z probówki 10-1 do probówki oznaczonej jako 10-2 i wymieszać.</li>
			<li>Przenieść 5 μl za pomocą mikropipety P20 z probówki 10-2 do probówki oznaczonej 10-3 i wymieszać. Przenieść 5 μl za pomocą mikropipety P20 z probówki 10-3 do probówki oznaczonej 10-4 i wymieszać.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR)
<ol>
	<li>Określ względną ilościowość poziomów mRNA metodą qPCR. W konfiguracji eksperymentalnej wybierz "Kwantyfikacja - Względna krzywa standardowa" i "TaqMan" chemia. Zmienić objętość reakcji na 10 μl. Wprowadzić odpowiednie informacje do układu płytki (np. gen docelowy, krzywa wzorcowa, reporter itp.).</li>
	<li>Przygotować reakcję tak, aby zawierała 0,5 μl testu starter/sonda, 5 μl głównej mieszanki ekspresji genów, 2 μlH2Oi 2,5 μl cDNA (10–100 ng).
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszaninę wzorcową, mnożąc każdy z poprzednich odczynników (z wyjątkiem cDNA) przez liczbę reakcji, upewniając się, że uwzględniono te z krzywej wzorcowej, kontrole ujemne, przeprowadzając każdą reakcję w dwóch egzemplarzach i 2 dodatkowe reakcje, które będą uwzględniać zmienność pipetowania.</li>
		<li>Odpipetować 7,5 μl przygotowanej mieszanki wzorcowej do wcześniej ustalonych studzienek na 96-dołkowej płytce reakcyjnej za pomocą mikropipety lub pipety wielokanałowej. Odpipetować 2,5 μl cDNA do odpowiedniej studzienki dla niewiadomych i wzorców, a 2,5 μlH2Odo studzienek kontroli ujemnej.</li>
		<li>Uwzględnij testy starterów/sond dla różnych genów zegara molekularnego, a także uwzględnij test dla kontroli endogennej (np. β-aktyny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu określenia względnych wartości ekspresji należy obliczyć średnią ilość względną dla każdej kontrpróby, a następnie dla każdej próbki podzielić średnią ilość względną dla genu docelowego przez średnią ilość względną dla β-aktyny.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej wprowadź dane do programu w ramach opcji statystyki kolumnowej. Wybierz jednoczynnikową ANOVA z testem post hoc Dunnetta, aby ocenić różnice między średnimi wartościami ekspresji genów zegarowych po prowokacji PAMP w porównaniu z kontrolą.</li>
</ol>

<ol><li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators%3A+lessons+from+diverse+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li>
<li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22483041">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).</li>
<li>Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+shock+induces+circadian+gene+expression+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells.</a> Cell. 93, 929-937 (1998).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+Central+and+Peripheral+Circadian+Oscillators+in+Transgenic+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+circadian+rhythms+in+mammalian+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms.</a> Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).</li>
<li>Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Clock+Proteins+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Circadian Clock Proteins and Immunity.</a> Immunity. 40, 178-186 (2014).</li>
<li>Keller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+clock+in+macrophages+controls+inflammatory+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+expression+of+clock+genes+in+mouse+macrophages%2C+dendritic+cells%2C+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells.</a> Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pattern-recognition+receptors+in+innate+immunity+update+on+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Publ.+Gr%22%5BJournal%5D)">The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors.</a> Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).</li>
<li>Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+responses+to+endotoxin+treatment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Circadian responses to endotoxin treatment in mice.</a> J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).</li>
<li>Okada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+LPS+Causes+Transient+Suppression+of+Biological+Clock+Genes+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats.</a> J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).</li>
<li>Haimovich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+endotoxin+synchronizes+and+suppresses+clock+gene+expression+in+human+peripheral+blood+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes.</a> Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).</li>
<li>Curtis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+innate+immunity+in+macrophages+by+miR-155+targeting+Bmal1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Circadian+Clock+Controls+Toll-like+Receptor+9-Mediated+Innate+and+Adaptive+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity.</a> Immunity. , (2012).</li>
<li>Gibbs, J. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22184247">The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines.</a> PNAS. 109, 582-587 (2012).</li>
<li>Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3654533/">Circadian rhythm abnormalities.</a> Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).</li>
<li>Bovbjerg, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+disruption+and+cancer%3A+sleep+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation.</a> Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).</li>
<li>Fu, L., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock%3A+pacemaker+and+tumour+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).</li>
<li>Germain, A., Kupfer, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18680211">CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION.</a> Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5158/basic-mouse-care-and-maintenance">Basic Mouse Care and Maintenance.</a> JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition.</a> AVMA. , (2013).</li>
<li>Silver, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li>
<li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844017321199">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579(2018).</li>
<li>Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https//phenome.jax.org">https//phenome.jax.org</a> (2018).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W ramach tego protokołu spektrofotometr mikroobjętościowy może być używany do ilościowego określania i oceny czystości RNA używanego do określania ekspresji genów. Kwasy nukleinowe absorbują światło UV przy 260 nm, białka zazwyczaj pochłaniają światło przy 280 nm, podczas gdy inne potencjalne zanieczyszczenia używane podczas procedury ekstrakcji RNA (np. fenol) są wykrywalne przy 230 nm. W związku z tym, oceniając stosunek absorbancji (A) przy 260/280 nm (RNA do białka) i 260/230 nm (RNA do zanieczyszczeń niebia...

Główny zegar u ssaków, który zarządza 24-godzinnymi oscylacjami dla prawie wszystkich aspektów fizjologii i zachowania, znajduje się w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) podwzgórza1,2. Oprócz regulowania procesów biologicznych na poziomie organizmu, zegar główny synchronizuje również obwodowe zegary komórkowe w całym ciele3,4,5. Podczas gdy maszyneria zegara molekularnego składa się z co najmniej trzech zazębiających się pętli transkrypcyjno-translacyjnych sprzężenia zwrotnego, rdzeń składa się z genów okresu (Per1-3), kryptochromu (Cry1-2), Bmal1 i zegara6,7. Oprócz utrzymania dokładnego taktowania rdzeniowego zegara molekularnego, niektóre pomocnicze produkty genów zegara (np. Rev-erbα i Dbp) regulują również ekspresję genów niezegarowych, tj. genów kontrolowanych zegarem (CCG)6,7.
Funkcjonalne zegary molekularne zostały opisane w różnych tkankach immunologicznych (np. śledzionie i węzłach chłonnych)8 i komórkach (np. limfocytach B, komórkach dendrytycznych, makrofagach)8,9. Komórki te wykrywają i reagują na wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), konserwatywne składniki mikrobiologiczne, za pośrednictwem wrodzonych receptorów rozpoznawania immunologicznego, takich jak receptory Toll-podobne (TLR)10. Do tej pory opisano 13 funkcjonalnych TLR, które rozpoznają składniki mikrobiologiczne, takie jak składniki ściany komórkowej bakterii, białko wiciowe i mikrobiologiczne kwasy nukleinowe10. Wykazano, że PAMP, lipopolisacharyd (LPS), składnik ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych rozpoznawany przez TLR4, zmienia rytmy okołodobowe zarówno na poziomie organizmu, jak i molekularnym. Na przykład, prowokacja in vivo LPS indukowała opóźnienia fazowe podobne do fototycznych, mierzone aktywnością u myszy11 i doprowadziły do zmniejszonej ekspresji genu zegara w SCN i wątrobie, jak określono odpowiednio przez hybrydyzację in situ i ilościowy PCR u szczurów12. Po prowokacji in vivo z LPS, analiza ludzkich leukocytów krwi obwodowej13 i podskórnej tkanki tłuszczowej14 ujawniła zmienioną ekspresję kilku genów zegarowych, mierzoną za pomocą qPCR. Wreszcie, wyzwania ex vivo LPS dotyczące ludzkich makrofagów i mysich makrofagów otrzewnowych również doprowadziły do zmienionej ekspresji zegara, mierzonej za pomocą qPCR14.
Tutaj opisujemy protokół do oceny wpływu PAMPs LPS, ODN1826 (syntetycznych oligonukleotydów zawierających niemetylowane motywy CpG) i zabijanych termicznie Listeria monocytogenes (HKLM), rozpoznawanych odpowiednio przez TLR4, TLR9 i TLR2, na ekspresję genu zegara molekularnego w mysich splenocytach. Protokół obejmuje splenektomię myszy, izolację i prowokację splenocytów, ekstrakcję RNA, syntezę cDNA i qPCR w celu oceny ekspresji kilku genów zegarowych. Protokół ten pozwala na szybkie pozyskanie dużej liczby komórek odpornościowych przy bardzo niewielkiej manipulacji zwierzęcej lub komórkowej, które następnie można poddać próbie ex vivo za pomocą różnych PAMP. Wykazano, że zegar molekularny moduluje różne aspekty odpowiedzi immunologicznej8,15,16, dlatego zakłócenie zegara molekularnego najprawdopodobniej zakłóciłoby prawidłową zależną od czasu zmienność odpowiedzi immunologicznej. Ponadto, ponieważ zakłócenia rytmu okołodobowego mogą prowadzić do poważnych patologii17,18,19,20, może być interesujące dla badaczy, aby rzucić wyzwanie splenocytom za pomocą szerokiej gamy cząsteczek i ocenić ich wpływ na zegar.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka matowe</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 lub 74106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaz bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Testy ekspresji genów B-aktyna</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>Testy ekspresji genów TaqMan Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Testy ekspresji genów Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Testy ekspresji genów Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Testy ekspresji genów Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Maszyna StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 ml)</td><td>Oprogramowanie</td> do analizy statystycznej ThermoFisher <td>4346907</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mysich splenocytów do oceny wpływu wzorca molekularnego związanego z patogenem na ekspresję genów zegarowych

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Od zachowania po ekspresję genów, rytmy okołodobowe regulują prawie wszystkie aspekty fizjologii. W tym miejscu przedstawiamy metodologię badania mysich splenocytów za pomocą wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP), lipopolisacharydów (LPS), ODN1826 i zabitych termicznie Listeria monocytogenes oraz badamy ich wpływ na molekularny zegar okołodobowy. Wcześniej badania koncentrowały się na badaniu wpływu LPS na zegar molekularny przy użyciu różnych podejść in vivo i ex vivo z różnych modeli (np. myszy, szczura i człowieka). Protokół ten opisuje izolację i prowokację splenocytów, a także metodologię oceny ekspresji genów zegarowych po prowokacji za pomocą ilościowego PCR. Podejście to można wykorzystać do oceny nie tylko wpływu składników mikrobiologicznych na zegar molekularny, ale także innych cząsteczek, które mogą zmieniać ekspresję zegara. Podejście to może być wykorzystane do zbadania molekularnego mechanizmu interakcji receptora podobnego do PAMP-Toll wpływa na ekspresję zegara.

Myszy uśmiercono w ZT13, wyizolowano splenocyty i poddano je stymulacji ex vivo za pomocą PAMP: LPS, ODN1826 lub HKLM. Po 3 h wyizolowano RNA i wykorzystano qPCR do oceny względnych poziomów ekspresji genów zegara molekularnego Clock, Per2, Dbp, oraz Rev-erbα w porównaniu do komórek kontrolnych niestymulowanych. Po stymulacji PAMP poziomy ekspresji Clock nie różniły się istotnie od ekspresji w komórkach kontrolnych (<strong class="xf...

Ten protokół opisuje technikę wykorzystującą mysie splenocyty do odkrywania wzorców molekularnych związanych z patogenami, które zmieniają ekspresję genów zegara molekularnego.

Wykorzystanie mysich splenocytów do oceny wpływu wzorca molekularnego związanego z patogenem na ekspresję genów zegarowych

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny immunologii i chronobiologii, takie jak to, w jaki sposób składniki mikrobiologiczne zmieniają zegar molekularny. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania, oceniany jest wpływ różnych składników mikrobiologicznych na zegar molekularny i jest wysoce odtwarzalna. Aby rozpocząć protokół, przygotuj pożywkę hodowlaną, dodając płodową surowicę bydlęcą do RPMI 1640 do końcowego stężenia 10%Przygotuj 10 mililitrów pożywki prowokacyjnej dla każdego z testowanych PAMPS w 50-mililitrowych probówkach, dodając wymienioną pożywkę hodowlaną PAMP.Spryskaj wcześniej przygotowany pień myszy 70% etanolem i przetrzyj go ręcznikiem papierowym. Połóż mysz na plecach, lekko przechyloną na prawy bok. Następnie odetnij futro nożyczkami do preparowania wzdłuż lewej strony myszy, mniej więcej w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami.Za pomocą kleszczy chwyć otrzewną i ostrożnie wykonaj nacięcie, nie uszkadzając śledziony. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy i umieść ją w sterylnej 50-mililitrowej probówce zawierającej około 10 mililitrów pożywki hodowlanej na lodzie. Następnie przenieś śledzionę z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej na małą, sterylną szalkę Petriego.Homogenizuj śledzionę, mieląc ją między oszronioną częścią dwóch sterylnych matowych szkiełek. Po dokładnej homogenizacji odpipetować dwa mililitry pożywki hodowlanej zawierającej splenocyty przez 40-mikronowe sitko do komórek nylonowych do probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj osiem mililitrów zimnej pożywki hodowlanej do każdej z 50-mililitrowych probówek zawierających splenocyty, co daje całkowitą objętość 10 mililitrów na probówkę.Określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru. Dodaj około 10 razy 10 do szóstych komórek na studzienkę do sześciodołkowych płytek hodowlanych. Po dodaniu komórek dodaj do komórek trzy mililitry pożywki hodowlanej lub trzy mililitry pożywki prowokacyjnej.Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny. Zeskrob komórki z dna studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dołączonej do mikropipety P1000. Za pomocą tej samej końcówki pipety przenieś pożywkę zawierającą komórki do 15-mililitrowej probówki.Osadzać komórki w granulkach 167 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i przemyć osad komórkowy pięcioma mililitrami PBS. Po ponownym zagnieżdżeniu komórek w ilości 167 razy g przez pięć minut, usunąć supernatant i dodać 600 mikrolitrów buforu do lizy do osadu komórkowego.Wyizoluj RNA ze splenocytów za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta i wykonaj opcjonalne trawienie DNA na kolumnie. Zsyntetyzuj cDNA dla każdej z próbek za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 10 mikrolitrów RNA dla każdej z próbek w całkowitej objętości reakcyjnej 20 mikrolitrów.Przeciągnij mRNA z kilku próbek kontrolnych do probówki o pojemności 0,5 mililitra, aby przygotować cDNA do użycia w krzywej wzorcowej podczas wykonywania ilościowego PCR. Dodaj 10 mikrolitrów 2X głównej mieszanki odwrotnej transkryptazy. Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji dodać 10 mikrolitrów wody do probówki reakcyjnej, która służy jako stężenie wyjściowe w serii rozcieńczeń dla krzywej wzorcowej.Wykonaj dziesięciokrotną serię rozcieńczeń, dodając 45 mikrolitrów wody do czterech 0,5 mililitrowych probówek oznaczonych 10 do minus jeden, 10 do minus dwa, 10 do minus trzy i 10 do minus cztery. Dodać pięć mikrolitrów początkowego stężenia jeden do drugiej probówki, 10 do minus jeden, za pomocą mikropipetera P20. Wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół, a następnie przenieść pięć mikrolitrów z probówki 10 do minus jeden do probówki oznaczonej od 10 do probówki minus dwie i wymieszać.Przenieść pięć mikrolitrów za pomocą mikropipety P20 z probówki 10 do minus dwie do probówki oznaczonej od 10 do minus trzy i wymieszać. Na koniec przenieść pięć mikrolitrów za pomocą mikropipetera P20 z probówki 10 do minus trzy do probówki oznaczonej od 10 do minus cztery i wymieszać. Przygotuj reakcję tak, aby zawierała 0,5 mikrolitra testu startera, pięć mikrolitrów głównej mieszanki ekspresji genów, dwa mikrolitry wody i 2,5 mikrolitra cDNA.Pobrać pipetować próbki RNA na 96-dołkową płytkę qPCR. Inkubuj testy sondy starterowej dla różnych genów zegara molekularnego i uwzględnij test dla kontroli endogennej i załaduj go do maszyny qPCR w celu określenia względnej kwantyfikacji poziomów mRNA. W konfiguracji eksperymentalnej wybierz kwantację, względną krzywą wzorcową i chemię TaqMan.Następnie zmień objętość reakcji na 10 mikrolitrów. Wprowadź odpowiednie informacje do układu płyty. qPCR przeprowadzono na wyizolowanym RNA w celu oceny względnych poziomów ekspresji genów zegara molekularnego, zegara, Per2, Dbp i Rev-erb alfa.Po prowokacji PAMP poziomy ekspresji zegara nie różniły się znacząco w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Poziomy ekspresji Per2 były znacznie podwyższone w komórkach prowokowanych LPS i ODN1826 w porównaniu z niekwestionowanymi kontrolami. LPS był jedynym PAMP, który zmienił ekspresję Rev-erb alfa, ponieważ poziomy mRNA były znacznie niższe niż w niekwestionowanych kontrolach.Istotnie niższe poziomy mRNA zaobserwowano dla Dbp po prowokacji każdym z PAMP w porównaniu z kontrolą. Zgodnie z tą procedurą, cząsteczki inne niż PAMP mogą być wykorzystane do oceny ich wpływu na zegar molekularny w splenocytach.

the-use-mouse-splenocytes-to-assess-pathogen-associated-molecular

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Źródło: Madenspacher, J. H. i Fessler, M. B. Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje proces ilościowego określania obciążenia bakteryjnego śledziony u zakażonej myszy w celu oceny stopnia zakażenia. Zhomogenizowana śledziona jest rozcieńczana seryjnie i pokryta płytami, aby określić całkowite obciążenie bakteriami. Uzyskane dane dostarczają informacji o interakcjach...

Ocena obciążenia bakteryjnym śledziony myszy w badaniach infekcji

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Ten protokół opisuje kwantyfikację wielu celów cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych mysich splenocytów przy użyciu platformy testów immunologicznych opartych na multipleksie i cytometru przepływowego.

Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Ta nowo opracowana technologia oparta na fluorescencji umożliwia długoterminowe monitorowanie transkrypcji genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.

Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę obrazowania konfokalnego, aby zobrazować lokalizację in situ komórek wydzielających cytokinę Interferon gamma w mysich wtórnych narządach limfatycznych. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację innych cytokin w różnych tkankach.

Obrazowanie wytwarzania interferonu gamma in situ w śledzionie myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Poznaj metodę oceny wpływu wzorców molekularnych związanych z patogenem na ekspresję genów zegarowych w mysich splenocytach. Technika ta jest łatwa do wykonania i wysoko powtarzalna.

Wykorzystanie mysich splenocytów do oceny wpływu wzorca molekularnego związanego z patogenem na ekspresję genów zegarowych

Przeglądaj więcej filmów