Wykorzystanie mysich splenocytów do oceny wpływu wzorca molekularnego związanego z patogenem na ekspresję genów zegarowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny immunologii i chronobiologii, takie jak to, w jaki sposób składniki mikrobiologiczne zmieniają zegar molekularny. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania, oceniany jest wpływ różnych składników mikrobiologicznych na zegar molekularny i jest wysoce odtwarzalna. Aby rozpocząć protokół, przygotuj pożywkę hodowlaną, dodając płodową surowicę bydlęcą do RPMI 1640 do końcowego stężenia 10%Przygotuj 10 mililitrów pożywki prowokacyjnej dla każdego z testowanych PAMPS w 50-mililitrowych probówkach, dodając wymienioną pożywkę hodowlaną PAMP.

Spryskaj wcześniej przygotowany pień myszy 70% etanolem i przetrzyj go ręcznikiem papierowym. Połóż mysz na plecach, lekko przechyloną na prawy bok. Następnie odetnij futro nożyczkami do preparowania wzdłuż lewej strony myszy, mniej więcej w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami.

Za pomocą kleszczy chwyć otrzewną i ostrożnie wykonaj nacięcie, nie uszkadzając śledziony. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy i umieść ją w sterylnej 50-mililitrowej probówce zawierającej około 10 mililitrów pożywki hodowlanej na lodzie. Następnie przenieś śledzionę z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej na małą, sterylną szalkę Petriego.

Homogenizuj śledzionę, mieląc ją między oszronioną częścią dwóch sterylnych matowych szkiełek. Po dokładnej homogenizacji odpipetować dwa mililitry pożywki hodowlanej zawierającej splenocyty przez 40-mikronowe sitko do komórek nylonowych do probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj osiem mililitrów zimnej pożywki hodowlanej do każdej z 50-mililitrowych probówek zawierających splenocyty, co daje całkowitą objętość 10 mililitrów na probówkę.

Określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru. Dodaj około 10 razy 10 do szóstych komórek na studzienkę do sześciodołkowych płytek hodowlanych. Po dodaniu komórek dodaj do komórek trzy mililitry pożywki hodowlanej lub trzy mililitry pożywki prowokacyjnej.

Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny. Zeskrob komórki z dna studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dołączonej do mikropipety P1000. Za pomocą tej samej końcówki pipety przenieś pożywkę zawierającą komórki do 15-mililitrowej probówki.

Osadzać komórki w granulkach 167 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i przemyć osad komórkowy pięcioma mililitrami PBS. Po ponownym zagnieżdżeniu komórek w ilości 167 razy g przez pięć minut, usunąć supernatant i dodać 600 mikrolitrów buforu do lizy do osadu komórkowego.

Wyizoluj RNA ze splenocytów za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta i wykonaj opcjonalne trawienie DNA na kolumnie. Zsyntetyzuj cDNA dla każdej z próbek za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 10 mikrolitrów RNA dla każdej z próbek w całkowitej objętości reakcyjnej 20 mikrolitrów.

Przeciągnij mRNA z kilku próbek kontrolnych do probówki o pojemności 0,5 mililitra, aby przygotować cDNA do użycia w krzywej wzorcowej podczas wykonywania ilościowego PCR. Dodaj 10 mikrolitrów 2X głównej mieszanki odwrotnej transkryptazy. Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji dodać 10 mikrolitrów wody do probówki reakcyjnej, która służy jako stężenie wyjściowe w serii rozcieńczeń dla krzywej wzorcowej.

Wykonaj dziesięciokrotną serię rozcieńczeń, dodając 45 mikrolitrów wody do czterech 0,5 mililitrowych probówek oznaczonych 10 do minus jeden, 10 do minus dwa, 10 do minus trzy i 10 do minus cztery. Dodać pięć mikrolitrów początkowego stężenia jeden do drugiej probówki, 10 do minus jeden, za pomocą mikropipetera P20. Wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół, a następnie przenieść pięć mikrolitrów z probówki 10 do minus jeden do probówki oznaczonej od 10 do probówki minus dwie i wymieszać.

Przenieść pięć mikrolitrów za pomocą mikropipety P20 z probówki 10 do minus dwie do probówki oznaczonej od 10 do minus trzy i wymieszać. Na koniec przenieść pięć mikrolitrów za pomocą mikropipetera P20 z probówki 10 do minus trzy do probówki oznaczonej od 10 do minus cztery i wymieszać. Przygotuj reakcję tak, aby zawierała 0,5 mikrolitra testu startera, pięć mikrolitrów głównej mieszanki ekspresji genów, dwa mikrolitry wody i 2,5 mikrolitra cDNA.

Pobrać pipetować próbki RNA na 96-dołkową płytkę qPCR. Inkubuj testy sondy starterowej dla różnych genów zegara molekularnego i uwzględnij test dla kontroli endogennej i załaduj go do maszyny qPCR w celu określenia względnej kwantyfikacji poziomów mRNA. W konfiguracji eksperymentalnej wybierz kwantację, względną krzywą wzorcową i chemię TaqMan.

Następnie zmień objętość reakcji na 10 mikrolitrów. Wprowadź odpowiednie informacje do układu płyty. qPCR przeprowadzono na wyizolowanym RNA w celu oceny względnych poziomów ekspresji genów zegara molekularnego, zegara, Per2, Dbp i Rev-erb alfa.

Po prowokacji PAMP poziomy ekspresji zegara nie różniły się znacząco w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Poziomy ekspresji Per2 były znacznie podwyższone w komórkach prowokowanych LPS i ODN1826 w porównaniu z niekwestionowanymi kontrolami. LPS był jedynym PAMP, który zmienił ekspresję Rev-erb alfa, ponieważ poziomy mRNA były znacznie niższe niż w niekwestionowanych kontrolach.

Istotnie niższe poziomy mRNA zaobserwowano dla Dbp po prowokacji każdym z PAMP w porównaniu z kontrolą. Zgodnie z tą procedurą, cząsteczki inne niż PAMP mogą być wykorzystane do oceny ich wpływu na zegar molekularny w splenocytach.