Name: Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę genotypowania larw Danio rerio przez obcinanie płetw ogonowych już po 72 godzinach od zapłodnienia. Technika ta umożliwia wczesną identyfikację genotypów w badaniach nad modelami genetycznych chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Sieci Modeli i Mechanizmów Chorób Rzadkich (RDMM) (finansowanej przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Genome Canada). CK jest wspierany przez stypendium UROP (University of Ottawa). DLJ jest wspierany przez stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship. IAP jest wspierany przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR) w ramach stypendium podoktorskiego. Autorzy dziękują Amerykańskiemu Towarzystwu Genetycznemu za udzielenie zgody na publikację tego protokołu i wykorzystanie adaptacji rysunku uzupełniającego 5 z Pena i wsp.

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone i są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami dostarczonymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami i komitety ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj powierzchnię preparacyjną, przyklejając 9-centymetrową pokrywkę szalki Petriego taśmą autoklawową do jej wewnętrznej powierzchni. Umieść go pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Umieścić 3 - 5 dni po zapłodnieniu (dpf) larwy danio pręgowanego na szalce Petriego i znieczulić w ̃1,5 mM trikainy w 1x pożywce zarodkowej E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4, pH 7,2).</li>
	<li>Odetnij koniec końcówki pipety P1000 nożyczkami lub żyletką do średnicy 2 mm, aby pomieścić larwę o natężeniu 3 dpf przy minimalnym naprężeniu.</li>
</ol>
2. Obcinanie płetw larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Pobrać znieczuloną larwę za pomocą zmodyfikowanej mikropipety P1000 i umieścić larwę danio pręgowanego na umieszczonej taśmie autoklawu na pokrywie szalki Petriego.</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu trikainy otaczającego larwę za pomocą mikropipety. Obszar powinien być tak suchy, jak to możliwe, aby z powodzeniem przeciąć i podnieść płetwę, ale nadal mokry, aby zapewnić przetrwanie.</li>
	<li>Za pomocą mikroskalpela przeciąć płetwę ogonową pod mikroskopem stereoskopowym, jak wskazano w Rysunek 1, zgodnie z opisem w Wilkinson et al16. Podczas nacięcia należy wywierać stały nacisk w dół w miejscu przerwy pigmentowej płetwy ogonowej, dystalnie do granicy krążenia krwi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Delikatnie dociśnij, aby uniknąć uszkodzenia struny grzbietowej.</li>
	<li>Wizualizuj podzieloną na sekcje płetwę pod mikroskopem i umieść element na czubku ostrza mikroskalpela (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Umieść mikroskalpel zawierający płetwę na powierzchni małego kawałka bibuły filtracyjnej. 
	UWAGA: Ze względu na obecność melanocytów w przeciętej tkance, ten krok umożliwia wizualizację płetwy jako małej czarnej plamki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek i pęsety (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C) przenieś bibułę filtracyjną zawierającą płetwę na 96-dołkową płytkę PCR, zawierającą 25 μl 50 mM roztworu NaOH na studzienkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Przygotuj 96-dołkową płytkę z płaskim dnem, numerując studzienkę zgodnie z etykietą płytki do PCR. Używając zmodyfikowanej pipety P1000 wypełnionej 200 μl świeżej pożywki 1x E3 z zarodków, ostrożnie zebrać larwy danio pręgowanego, delikatnie uciskając. Dozuj larwę do 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, w tym samym numerze dołka, co płytka PCR (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Upewnij się, że bibuła filtracyjna jest dobrze zanurzona w roztworze (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2F). Wyczyść ostrze mikroscapelu i pęsetę między każdym cięciem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, zanurzając je w 70% roztworze EtOH. Wytrzyj ostrze czystą chusteczką papierową/chusteczką.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.1 - 2.7, aż wszystkie zarodki zostaną przycięte.</li>
	<li>Larwy należy przechowywać na 96-dołkowej płytce w temperaturze 28 °C do czasu zidentyfikowania genotypów. 
	UWAGA: Pożywka zarodkowa nie musi być zmieniana, ponieważ protokół można łatwo wykonać w czasie krótszym niż 2 dni. Jeśli potrzeba więcej czasu, zalecana jest wymiana nośnika.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja genomowego DNA
<ol>
	<li>Uszczelnij 96-dołkową płytkę PCR i odwiruj próbki przy 1 000 x g przez 1 minutę, aby upewnić się, że wszystkie bibuły filtracyjne są zanurzone w roztworze NaOH.</li>
	<li>W celu lizy tkanek należy podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie schładzać do 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 6 μl 500 mM Tris-HCl, pH 8,0. Wir.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę o sile 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyć 1,5 μl supernatantu DNA na reakcję PCR.</li>
	<li>Przygotować PCR w celu genotypu larw, jak pokazano w tabeli 1-2. 
	UWAGA: Ten protokół został przetestowany pod kątem dwóch zastosowań: multipleksowych reakcji PCR ujawniających genotyp przy użyciu żeli agarozowych9, oraz testu topnienia heterodupleksu (HMA) ujawniającego genotypy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE)17.</li>
</ol>
4. Alternatywna ekstrakcja genomowa przy użyciu żywicy chelatującej
<ol>
	<li>Wykonaj krok 2.5, dodając bibułę filtracyjną z przyciętą płetwą do 96-dołkowej płytki PCR, zawierającej 30 μl 5% żywicy chelatującej (kopolimer styren-diwinylobenzen zawierający sparowane jony iminodioctanu). 
	UWAGA: Ten rodzaj żywicy jest powszechnie stosowany do lizy tkanek i przygotowania DNA gotowego do PCR w szybki i skuteczny sposób18.</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.6 - 2.8, jak wskazano</li>.
	<li>Zamknij 96-dołkową płytkę do PCR i krótko odwiruj próbki, aby upewnić się, że cała bibuła filtracyjna jest zanurzona w żywicy chelatującej.</li>
	<li>W celu lizy tkanek podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie schładzać do 4 °C przez 10 minut 
	UWAGA: Ten etap umożliwia lizę, a następnie wiązanie kulek żywicy polarnej ze składnikami komórkowymi, podczas gdy DNA i RNA pozostają w roztworze.</li>
	<li>Krótko odwirować próbki, aby osadzać kulki żywicy i uzyskać DNA w zawiesinie.</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.5 - 3.6, aby zakończyć procedurę genotypowania.</li>
</ol>
5. Aplikacja 1: Multiplex PCR, a następnie analiza żelu agarozowego
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z Tabelą 1, ustaw reakcję multipleksową PCR, aby umożliwić rozróżnienie między homozygotycznymi mutantami, heterozygotami i larwami WT. Użyj 96-dołkowego termocyklera do przeprowadzenia reakcji PCR w warunkach cyklicznych opisanych w tabeli 3. 
	UWAGA: Reakcje PCR można również przeprowadzić w dowolnym innym konwencjonalnym termocyklerze PCR. Ten przykład opisuje strategię PCR stosowaną przez Penę i wsp.9 do identyfikacji zmutowanych alleli insercji aldh7a1 WT i 5-bp w tej samej reakcji multipleksowej.</li>
	<li>Przygotować 1% żel agarozowy w buforze boranu sodu, zabarwiony 1x GelRed. 
	UWAGA: 20x buz boranu sodu składa się z 40 ml 10 M NaOH, 1800 ml ddH2O, pH dostosowanego do 8,5 za pomocą 76 g kwasu borowego, a następnie uzupełnionego do 2 l końcowej objętości za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Uruchom żel w 1x buforze boranu sodu na 15 minut przy 250 V. Aby ułatwić proces, jeśli to możliwe, należy użyć systemu żelowego, który jest kompatybilny z pipetami wielokanałowymi, aby zapewnić większą przepustowość poprzez skrócenie czasu ładowania próbek.</li>
	<li>Zobrazuj żel w świetle ultrafioletowym (UV), aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów.</li>
</ol>
6. Aplikacja 2: Test topnienia heterodupleksu
<ol>
	<li>Przygotuj żele PAGE 12% za pomocą płytki dystansowej 1,5 mm i grzebieni na 15 próbek. Przygotuj dwa żele PAGE przy użyciu 12,21 ml ddH2O, 2,52 ml 10x Tris/Boran/EDTA (TBE), 10 ml 30% akrylamidu, 250 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS) i 20 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Użyj 1x bufor TBE (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M kwas borowy i 0,002 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) jako bufor bieżący.</li>
	<li>Podgrzewać produkty PCR w temperaturze 94 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Schłodzić probówki na lodzie lub w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Załadować 10 μl na próbkę PCR i 8 μl markera masy cząsteczkowej.</li>
	<li>Uruchom PAGE przy napięciu 150 V w 1x TBE za pomocą pionowego systemu elektroforezy przez 1 godzinę lub do momentu, gdy znacznik masy cząsteczkowej prawie dotrze do linii stopy szklanej płytki.</li>
	<li>Zobrazuj żel w świetle UV, aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410(2013).</li>
<li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li>
<li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28888969">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li>
<li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li>
<li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li>
<li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420(2014).</li>
<li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li>
<li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W ciągu ostatnich lat narzędzia do edycji genów zostały wykorzystane do precyzyjnego wprowadzania mutacji i transgenów u danio pręgowanego 5,6,7,8. Podczas modelowania chorób u danio pręgowanego często obserwuje się wczesne fenotypy larwalne lub młodociane 9,12,13,14.</sup...

Danio rerio (Danio rerio) to organizm kręgowców szeroko stosowany jako model do badania chorób, jak również do przedklinicznych testów hipotez terapeutycznych1,2,3. Zwierzęta te mają krótki czas generacji, są łatwe w obsłudze, wykazują wysoki wskaźnik reprodukcji, niski koszt i są łatwo podatne na manipulacje genetyczne poprzez mikroiniekcję DNA do zarodków4. Poprzez rosnący rozwój nowatorskich technologii transgenicznych i edycji genów, takich jak nukleazy palców cynkowych (ZFN)5, NAL podobne do efektorów (TALENs)6,7, oraz system Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) system8, danio pręgowany ma szansę znacznie poprawić zrozumienie kilku stanów patologicznych. Technologie te zostały wykorzystane do stworzenia ukierunkowanych nokautów zarówno w komórkach somatycznych, jak i rozrodczych u danio pręgowanego, skutecznie rozmnażając genetycznie zmodyfikowane zwierzęta8. Najnowsze przykłady w literaturze obejmują pomyślny rozwój modeli genetycznych padaczki i zaburzeń metabolicznych u danio pręgowanego3,9,10,11,12.
Dzięki postępowi w edycji genomu danio pręgowanego, szybkie i niezawodne genotypowanie stało się niezaprzeczalnym krokiem ograniczającym szybkość. Identyfikacja specyficznych mutacji DNA sąsiadujących z przewidywanym miejscem docelowym edycji genomu jest niezbędnym etapem protokołu. Tradycyjnie, techniki genotypowania poprzez obcinanie płetw są zwykle wykonywane tylko u młodych lub dorosłych danio pręgowanego. Jednak czas spędzony na hodowli danio pręgowanego do dorosłości (>2 miesiące) znacznie opóźnia postęp w badaniach. W wielu przypadkach dorosłość nie może zostać osiągnięta z powodu nokautu niezbędnych genów (np. w modelowaniu choroby) lub mutacji związanych ze wzmocnieniem funkcji, co prowadzi do szkodliwych skutków fenotypowych. Ponadto niektóre testy wymagają łączenia larw, takich jak ekstrakcja RNA lub metabolitów, a zatem wymagają wcześniejszej identyfikacji genotypów, co może być trudne, gdy dostępne są tylko techniki genotypowania post hoc. Powyższe przykłady podkreślają znaczenie technik genotypowania larw, które są jednocześnie precyzyjne i umożliwiają pełną regenerację i prawidłowy rozwój larw. Genotypowanie danio pręgowanego we wczesnym stadium nie wydaje się być obecnie szeroko stosowane; Znajduje to odzwierciedlenie w ostatnich publikacjach modeli chorób, w których genotypy larw są identyfikowane za pomocą genotypowania pośmiertnego, a nie genotypowania przed wykonaniem eksperymentu<klasa SUP="xref">12,<klasa SUP="xref">13,<klasa SUP="Xref">14. W artykule przedstawiono strategię obcinania płetw larw, mającą na celu ulepszenie wcześniej ustalonych procedur genotypowania.
W przeszłości strategie wykorzystujące trawienie proteinazy K do genotypowania żywych larw danio pręgowanego prowadziły do zmiennej wydajności reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)15. Chociaż niedawno opublikowana technika mikroskopowej biopsji ogona dostarczyła bardziej obiecujących wyników16, my i inne grupy nie byliśmy w stanie odtworzyć wysokiej wydajności i odzyskiwania DNA zgłoszonego przez autorów. Poważnym niepowodzeniem protokołu opisanego przez Wilkinsona i wsp.16 może być transferem tkanki ogona do probówki PCR. Ze względu na mikroskopijne rozmiary trudno jest upewnić się, że płetwa została prawidłowo pobrana i dozowana przez pipetowanie. Aby rozwiązać tę barierę, opracowaliśmy ulepszony protokół genotypowania dużej liczby żywych larw danio pręgowanego z prawie 100% skutecznością9. Za pomocą mikroskalpela usuwa się końcówkę ogona płetwy i umieszcza na kawałku bibuły filtracyjnej. Kawałek bibuły filtracyjnej zawierający tkankę można łatwo zobrazować i prawidłowo umieścić w probówce PCR. Następnie przeprowadza się ekstrakcję genomowego DNA, a następnie amplifikację PCR regionu będącego przedmiotem zainteresowania w celu genotypowania próbki. Do zalet tej metody należy wysoka skuteczność PCR, niski odsetek wyników fałszywie dodatnich i niska śmiertelność. Dodatkowo przy użyciu tego protokołu możliwe jest genotypowanie dużej liczby zarodków. Opisany tu protokół pozwala na obcinanie płetw setkom larw w ciągu 2 - 3 godzin przy użyciu tego podejścia oraz prawidłową identyfikację zgenotypowanych ryb i regenerację ogona w ciągu dwóch dni.

<table><tbody><tr><td>szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>World Precyzyjne instrumenty</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan trikainy/etylu metanosulfonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa PCR płyta</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% forma sodowa Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>System Sub-Cell Model 192</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>30 % roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td> chusteczki papierowe <td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>(chusteczki jednorazowe Kimwipes&reg;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus marker masy cząsteczkowej&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz&nbsp;</td><td>System Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 (wysokoprzepustowy system żelu agarozowego)</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>pionowy system elektroforezy żelowej Mini-PROTEAN Tetra Cell&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1658004</tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa ekstrakcja dna i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Danio rerio) (Danio rerio) posiada ortologi dla 84% genów, o których wiadomo, że są związane z chorobami ludzkimi. Ponadto zwierzęta te mają krótki czas pokoleniowy, są łatwe w obsłudze, wykazują wysoki wskaźnik reprodukcji, niski koszt i są łatwo podatne na manipulacje genetyczne poprzez mikroiniekcję DNA do zarodków. Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie narzędzi do edycji genów umożliwiają precyzyjne wprowadzanie mutacji i transgenów u danio pręgowanego. Modelowanie chorób u danio pręgowanego często prowadzi do fenotypów larw i przedwczesnej śmierci, co może być trudne do zinterpretowania, jeśli genotypy są nieznane. Ta wczesna identyfikacja genotypów jest również potrzebna w eksperymentach wymagających łączenia próbek, takich jak badania ekspresji genów lub spektrometrii mas. Jednak szeroko zakrojone badania przesiewowe genotypu są ograniczone tradycyjnymi metodami, które w większości laboratoriów wykonuje się tylko na dorosłych danio pręgowanych lub larwach pośmiertnych. Rozwiązaliśmy ten problem, dostosowując metodę izolacji genomowego DNA gotowego do PCR z żywych larw danio pręgowanego, co można osiągnąć już po 72 godzinach od zapłodnienia (hpf). Ta efektywna czasowo i kosztowo technika, ulepszona w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu genotypowania, umożliwia identyfikację genotypów na podstawie mikroskopowych biopsji płetw. Płetwy szybko się regenerują w miarę rozwoju larw. Naukowcy są następnie w stanie wybrać i wyhodować pożądane genotypy do dorosłości, wykorzystując tę wysokoprzepustową procedurę genotypowania opartą na PCR.

Wydajność protokołu wykazano poprzez genotypowanie potomstwa z krzyżówki heterozygotycznej (aldh7a1+/ot100, przedstawionej tutaj jako aldh7a1+/-) (Rycina 3A-C)9. Mutacyjny allel aldh7a1ot100 posiada insercję 5 par zasad (bp) w pierwszym eksonie kodującym genu aldh7a1 u danio pręgowanego, co prowadzi do przesunięcia ramki odczytu i u...

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny. Na przykład wykorzystanie danio pręgowanego do generowania genetycznych modeli chorób. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wczesną identyfikację genotypów przy użyciu prostej metody wysokoprzepustowej.Chociaż metoda ta może umożliwić szeroko zakrojone badania z wykorzystaniem modeli padaczki genetycznej danio pręgowanego, może być również stosowana do innych modeli chorób genetycznych i wszelkiego rodzaju badań nad mutacjami. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ przecięcie płetwy larwalnej musi być precyzyjnie wykonane w szczelinie pigmentowej ogona. Przed przystąpieniem do obcinania płetw larw danio pręgowanego należy przygotować powierzchnię preparacyjną.Przyklej kawałek taśmy autoklawu do wewnętrznej powierzchni dziewięciocentymetrowej pokrywki szalki Petriego i umieść pokrywkę pod mikroskopem stereoskopowym. Przygotuj końcówkę pipety P1000 do umieszczenia larwy o trzech dpf przy minimalnym naprężeniu, odcinając koniec końcówki pipety do średnicy dwóch milimetrów. Umieść larwy danio pręgowanego trzy do pięciu dni po zapłodnieniu lub dpf na szalce Petriego i znieczulenie w 1,5 milimolowej trikainy w pożywce 1x E3 Embryo.Za pomocą zmodyfikowanej mikropipety P1000 podnieś i znieczul larwy danio pręgowanego, a następnie umieść je na umieszczonej taśmie autoklawu na pokrywie szalki Petriego. Usuń nadmiar roztworu tricainy otaczającego larwę. Obszar powinien być tak suchy, jak to możliwe, aby z powodzeniem przeciąć i podnieść płetwę, ale nadal mokry, aby zapewnić przetrwanie.Aby uniknąć krwawienia i zapewnić przetrwanie larwy podczas obcinania płetw, przecięcie musi nastąpić w szczelinie pigmentowej. Dystalnie do granicy krążenia krwi, jak pokazano na tym obrazie. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj mikroskalpela, aby przeciąć płetwę ogonową.Podczas nacięcia należy wywierać stały, ale delikatny nacisk w dół, aby uniknąć uszkodzenia struny grzbietowej. Wizualizuj podzieloną na sekcje płetwy pod mikroskopem i umieść element na czubku ostrza mikroskalpela. Umieść mikroskalpel zawierający płetwę na powierzchni małego kawałka bibuły filtracyjnej.Ze względu na obecność melanocytów w przeciętej tkance płetwa pojawia się jako mała plamka. Aby zapewnić pomyślną ekstrakcję DNA, ważne jest, aby przed kontynuowaniem protokołu na bibułę filtracyjną obserwować czarną kropkę oznaczającą położenie płetwy. Za pomocą nożyczek i pęsety przenieś bibułę filtracyjną zawierającą płetwę do dołka 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 25 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu wodorotlenku sodu.Następnie przygotuj płaską płytkę do 96-dołkowej hodowli tkankowej, numerując studzienki zgodnie z etykietą płytki PCR. Za pomocą zmodyfikowanej pipety P1000, wypełnionej 200 mikrolitrami świeżej pożywki zarodkowej e3, ostrożnie zebrać larwy danio pręgowanego, delikatnie naciskając. Dozować larwę do płytki 96-dołkowej w tym samym numerze dołka, co płytka PCR.Upewnij się, że bibuła filtracyjna zawierająca płetwę jest dobrze zanurzona w roztworze. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między każdym cięciem, wyczyść ostrze mikroskalpela i pęsety, zanurzając je w 70% roztworze etanolu. Wytrzyj ostrze czystą chusteczką papierową lub chusteczką.Po przycięciu wszystkich larw przechowuj larwy na 96-dołkowej płytce w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż do zidentyfikowania ich genotypów. Procedurę tę należy rozpocząć od uszczelnienia 96-dołkowej płytki PCR zawierającej kawałki żeber i odwirowania próbek w temperaturze 1000 razy G przez jedną minutę. Aby upewnić się, że wszystkie bibuły filtracyjne są zanurzone w roztworze wodorotlenku sodu.W celu lizy tkanek podgrzej próbki w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie schładzamy do czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj sześć mikrolitrów 500 milimolowych tris-HCL pH8,0 do każdej próbki.Odwiruj próbki. Krótko odwirować płytkę w temperaturze 1500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Aby wyekstrahować genomowe DNA za pomocą tej metody, przytnij płetwę, jak pokazano wcześniej, ale dodaj bibułę filtracyjną z przyciętą płetwą do dołka 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 30 mikrolitrów 5% żywicy chelatującej.Po odcięciu wszystkich kawałków żeber uszczelnij 96-dołkową płytkę do PCR i krótko odwiruj próbki, aby upewnić się, że wszystkie bibuły filtracyjne są zanurzone w żywicy chelatującej. Podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie schładzać do czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Krótko odwirować próbki, aby osadzać kulki żywicy i uzyskać DNA w zawiesinie.Test multipleksowy PCR umożliwi rozróżnienie między homozygotycznymi mutantami, heterozygotami i larwami typu dzikiego. Ustaw reakcję PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykonaj reakcje PCR w 96-dołkowym termocyklerze.Przygotuj 1% żel agarozowy w buforze boranu sodu, zabarwiony 1x żelem na czerwono. Aby ułatwić ten proces, jeśli to możliwe, należy użyć systemu żelowego, który jest kompatybilny z pipetami wielokanałowymi, aby zapewnić większą przepustowość poprzez skrócenie czasu ładowania próbek. Uruchom żel w 1x bufor boranu sodu o napięciu 250 woltów przez 15 minut.Zobrazuj żel w świetle ultrafioletowym, aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów. Rozpocznij ten test od przygotowania dwóch 12% żeli poliakrylamidowych przy użyciu 1,5-milimetrowej płytki dystansowej i 15 grzebieni do próbek, jak opisano w protokole tekstowym. Użyj pionowego systemu elektroforezy i 1x bufora TBE jako bufora bieżącego.Po wykonaniu PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym, produkty PCR należy podgrzewać w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schładzać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Załaduj 10 mikrolitrów na próbkę PCR i osiem mikrolitrów markera masy cząsteczkowej. Uruchom żel pod napięciem 150 woltów przez godzinę lub do momentu, gdy znacznik masy cząsteczkowej prawie dotrze do linii stopy szklanej płytki.Zobrazuj żel w świetle ultrafioletowym, aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów. Protokół ten został wykorzystany do genotypu potomstwa heterozygotycznej krzyżówki, w której zmutowane jelito kręte ma insercję 5 par zasad w eksonie pierwszej powłoki genu aldh7a1. Oczekiwanym wynikiem amplifikacji PCR zarówno dzikich, jak i zmutowanych jelit krętych jest amplikon 434 BP.Pasmo 293 BP powstaje w wyniku amplifikacji zmutowanego jelita krętego, a pasmo 195 BP uzyskuje się dla jelita krętego typu dzikiego. Analiza reakcji PCR na 1% żelu boranowo-sodowym z 1% agarozą zidentyfikowała genotypy typu dzikiego na pasach drugim i szóstym, genotypy heterozygotyczne na pasach trzecim, czwartym i piątym oraz homozygotyczny zmutowany genotyp na pasie pierwszym. Różne mutacje zostały zgenotypowane za pomocą testu topnienia heterodupleksowego.Zmutowane jelita kręte plpbpot101 i plpbpot102 genu plpbp pozwalają na przesunięcie ramki i wczesny kodon stop. Po denaturacji i wyżarzaniu, fragmenty PCR dla zwierząt heterozygotycznych zawierałyby heterodupleksowe i homodupleksowe DNA, które można łatwo oddzielić i uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Złożone heterozygotyczne zmutowane genotypy zidentyfikowano na pasach drugim, czwartym i ósmym, heterozygotyczne genotypy na pasach trzecim, szóstym, siódmym, dziewiątym i dziesiątym, a genotyp dziki na pasie piątym.Po opanowaniu, obcinanie płetw 96 larw za pomocą tej techniki można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak gromadzenie larw danio pręgowanego o tym samym genotypie w celu ekstrakcji tkanek, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak badanie biomarkerów i modele choroby. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie modeli padaczki metabolicznej w celu zbadania fizjologii ścieżki choroby u danio pręgowanego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo genotypować trzydniowe larwy danio pręgowanego poprzez mikrodysekcję płetwy ogonowej.

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten artykuł opisuje ekstrakcję DNA z klipsa do ogona danio pręgowanego. Protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę analizy genotypów danio pręgowanego.

Ekstrakcja DNA z klipsa ogonowego: metoda stosowana w genotypowaniu danio pręgowanego

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i produkcji szablonu do układania zarodków danio pręgowanego, a następnie szczegółową procedurę użycia takiego szablonu do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce.

Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Poznaj wysokoprzepustową metodę genotypowania larw Danio rerio przez obcinanie płetw ogonowych już po 72 godzinach od zapłodnienia. Technika ta umożliwia wczesną identyfikację genotypów w badaniach nad modelami genetycznych chorób.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Przeglądaj więcej filmów