Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny. Na przykład wykorzystanie danio pręgowanego do generowania genetycznych modeli chorób. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wczesną identyfikację genotypów przy użyciu prostej metody wysokoprzepustowej.

Chociaż metoda ta może umożliwić szeroko zakrojone badania z wykorzystaniem modeli padaczki genetycznej danio pręgowanego, może być również stosowana do innych modeli chorób genetycznych i wszelkiego rodzaju badań nad mutacjami. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ przecięcie płetwy larwalnej musi być precyzyjnie wykonane w szczelinie pigmentowej ogona. Przed przystąpieniem do obcinania płetw larw danio pręgowanego należy przygotować powierzchnię preparacyjną.

Przyklej kawałek taśmy autoklawu do wewnętrznej powierzchni dziewięciocentymetrowej pokrywki szalki Petriego i umieść pokrywkę pod mikroskopem stereoskopowym. Przygotuj końcówkę pipety P1000 do umieszczenia larwy o trzech dpf przy minimalnym naprężeniu, odcinając koniec końcówki pipety do średnicy dwóch milimetrów. Umieść larwy danio pręgowanego trzy do pięciu dni po zapłodnieniu lub dpf na szalce Petriego i znieczulenie w 1,5 milimolowej trikainy w pożywce 1x E3 Embryo

Za pomocą zmodyfikowanej mikropipety P1000 podnieś i znieczul larwy danio pręgowanego, a następnie umieść je na umieszczonej taśmie autoklawu na pokrywie szalki Petriego. Usuń nadmiar roztworu tricainy otaczającego larwę. Obszar powinien być tak suchy, jak to możliwe, aby z powodzeniem przeciąć i podnieść płetwę, ale nadal mokry, aby zapewnić przetrwanie.

Aby uniknąć krwawienia i zapewnić przetrwanie larwy podczas obcinania płetw, przecięcie musi nastąpić w szczelinie pigmentowej. Dystalnie do granicy krążenia krwi, jak pokazano na tym obrazie. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj mikroskalpela, aby przeciąć płetwę ogonową.

Podczas nacięcia należy wywierać stały, ale delikatny nacisk w dół, aby uniknąć uszkodzenia struny grzbietowej. Wizualizuj podzieloną na sekcje płetwy pod mikroskopem i umieść element na czubku ostrza mikroskalpela. Umieść mikroskalpel zawierający płetwę na powierzchni małego kawałka bibuły filtracyjnej.

Ze względu na obecność melanocytów w przeciętej tkance płetwa pojawia się jako mała plamka. Aby zapewnić pomyślną ekstrakcję DNA, ważne jest, aby przed kontynuowaniem protokołu na bibułę filtracyjną obserwować czarną kropkę oznaczającą położenie płetwy. Za pomocą nożyczek i pęsety przenieś bibułę filtracyjną zawierającą płetwę do dołka 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 25 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu wodorotlenku sodu.

Następnie przygotuj płaską płytkę do 96-dołkowej hodowli tkankowej, numerując studzienki zgodnie z etykietą płytki PCR. Za pomocą zmodyfikowanej pipety P1000, wypełnionej 200 mikrolitrami świeżej pożywki zarodkowej e3, ostrożnie zebrać larwy danio pręgowanego, delikatnie naciskając. Dozować larwę do płytki 96-dołkowej w tym samym numerze dołka, co płytka PCR.

Upewnij się, że bibuła filtracyjna zawierająca płetwę jest dobrze zanurzona w roztworze. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między każdym cięciem, wyczyść ostrze mikroskalpela i pęsety, zanurzając je w 70% roztworze etanolu. Wytrzyj ostrze czystą chusteczką papierową lub chusteczką.

Po przycięciu wszystkich larw przechowuj larwy na 96-dołkowej płytce w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż do zidentyfikowania ich genotypów. Procedurę tę należy rozpocząć od uszczelnienia 96-dołkowej płytki PCR zawierającej kawałki żeber i odwirowania próbek w temperaturze 1000 razy G przez jedną minutę. Aby upewnić się, że wszystkie bibuły filtracyjne są zanurzone w roztworze wodorotlenku sodu.

W celu lizy tkanek podgrzej próbki w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie schładzamy do czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj sześć mikrolitrów 500 milimolowych tris-HCL pH8,0 do każdej próbki.

Odwiruj próbki. Krótko odwirować płytkę w temperaturze 1500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Aby wyekstrahować genomowe DNA za pomocą tej metody, przytnij płetwę, jak pokazano wcześniej, ale dodaj bibułę filtracyjną z przyciętą płetwą do dołka 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 30 mikrolitrów 5% żywicy chelatującej.

Po odcięciu wszystkich kawałków żeber uszczelnij 96-dołkową płytkę do PCR i krótko odwiruj próbki, aby upewnić się, że wszystkie bibuły filtracyjne są zanurzone w żywicy chelatującej. Podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie schładzać do czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Krótko odwirować próbki, aby osadzać kulki żywicy i uzyskać DNA w zawiesinie.

Test multipleksowy PCR umożliwi rozróżnienie między homozygotycznymi mutantami, heterozygotami i larwami typu dzikiego. Ustaw reakcję PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykonaj reakcje PCR w 96-dołkowym termocyklerze.

Przygotuj 1% żel agarozowy w buforze boranu sodu, zabarwiony 1x żelem na czerwono. Aby ułatwić ten proces, jeśli to możliwe, należy użyć systemu żelowego, który jest kompatybilny z pipetami wielokanałowymi, aby zapewnić większą przepustowość poprzez skrócenie czasu ładowania próbek. Uruchom żel w 1x bufor boranu sodu o napięciu 250 woltów przez 15 minut.

Zobrazuj żel w świetle ultrafioletowym, aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów. Rozpocznij ten test od przygotowania dwóch 12% żeli poliakrylamidowych przy użyciu 1,5-milimetrowej płytki dystansowej i 15 grzebieni do próbek, jak opisano w protokole tekstowym. Użyj pionowego systemu elektroforezy i 1x bufora TBE jako bufora bieżącego.

Po wykonaniu PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym, produkty PCR należy podgrzewać w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schładzać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Załaduj 10 mikrolitrów na próbkę PCR i osiem mikrolitrów markera masy cząsteczkowej. Uruchom żel pod napięciem 150 woltów przez godzinę lub do momentu, gdy znacznik masy cząsteczkowej prawie dotrze do linii stopy szklanej płytki.

Zobrazuj żel w świetle ultrafioletowym, aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów. Protokół ten został wykorzystany do genotypu potomstwa heterozygotycznej krzyżówki, w której zmutowane jelito kręte ma insercję 5 par zasad w eksonie pierwszej powłoki genu aldh7a1. Oczekiwanym wynikiem amplifikacji PCR zarówno dzikich, jak i zmutowanych jelit krętych jest amplikon 434 BP.

Pasmo 293 BP powstaje w wyniku amplifikacji zmutowanego jelita krętego, a pasmo 195 BP uzyskuje się dla jelita krętego typu dzikiego. Analiza reakcji PCR na 1% żelu boranowo-sodowym z 1% agarozą zidentyfikowała genotypy typu dzikiego na pasach drugim i szóstym, genotypy heterozygotyczne na pasach trzecim, czwartym i piątym oraz homozygotyczny zmutowany genotyp na pasie pierwszym. Różne mutacje zostały zgenotypowane za pomocą testu topnienia heterodupleksowego.

Zmutowane jelita kręte plpbpot101 i plpbpot102 genu plpbp pozwalają na przesunięcie ramki i wczesny kodon stop. Po denaturacji i wyżarzaniu, fragmenty PCR dla zwierząt heterozygotycznych zawierałyby heterodupleksowe i homodupleksowe DNA, które można łatwo oddzielić i uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Złożone heterozygotyczne zmutowane genotypy zidentyfikowano na pasach drugim, czwartym i ósmym, heterozygotyczne genotypy na pasach trzecim, szóstym, siódmym, dziewiątym i dziesiątym, a genotyp dziki na pasie piątym.

Po opanowaniu, obcinanie płetw 96 larw za pomocą tej techniki można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak gromadzenie larw danio pręgowanego o tym samym genotypie w celu ekstrakcji tkanek, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak badanie biomarkerów i modele choroby. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie modeli padaczki metabolicznej w celu zbadania fizjologii ścieżki choroby u danio pręgowanego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo genotypować trzydniowe larwy danio pręgowanego poprzez mikrodysekcję płetwy ogonowej.