Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mechaniki jądrowej. Na przykład, jaka jest siła potrzebna do odkształcenia jądra w komórce? Jaki jest wkład składników komórkowych i jądrowych w odporność jądrową na odkształcenia?

A może sprzężenie jądrowe ze strukturami komórkowymi różni się w zależności od typu komórki? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na zastosowanie siły sondującej w celu deformacji integrującego się nukleocytoszkieletu w żywej komórce przylegającej. Chociaż metoda ta została wykorzystana do uzyskania wglądu w właściwości mechaniczne jądra w komórkach NIH-3T3, można ją również zastosować do dowolnego typu komórek przylegających, takich jak sondowanie właściwości mechanicznych jądra w komórkach progerialnych Hutchinsona-Gilforda.

Aby rozpocząć tę procedurę, pokryj 35-milimetrowe szklane naczynie dnem 5 mikrogramami na mililitr fibronektyny. Następnie hoduj komórki fibroblastów NIH 3T3 w DMEM uzupełnione 10% surowicą bydlęcą dawcy i 1% penicyliną-streptomycyną na powlekanej misce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do pożądanego zbiegu. Bezpośrednio przed eksperymentem przemyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie jednorazowo przemyj je kompletną pożywką wzrostową.

Następnie dodaj trzy mililitry kompletnej pożywki wzrostowej do naczynia ze szklanym dnem. W tej procedurze włącz mikrowtryskiwacz. Za pomocą zakraplacza olejku immersyjnego nałóż kroplę olejku immersyjnego na soczewkę obiektywu.

Następnie dociśnij mocno naczynie do uchwytu na naczynia i załaduj uchwyt na naczynie na scenę. Należy pamiętać, że komórki powinny być utrzymywane w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cały czas trwania eksperymentu. Następnie dostosuj wysokość obiektywu, aby ustawić ostrość komórek.

Przesuń stolik mikroskopu, aby znaleźć interesującą Cię komórkę. Za pomocą mikromanipulatora przesuń uchwyt pipety do najwyższej pozycji. Następnie załaduj mikropipetę z końcówką o średnicy 0,5 mikrometra na uchwyt pipety.

Następnie podnieś płaszczyznę ogniskowej obiektywu powyżej płaszczyzny A i górną część celi do płaszczyzny B, regulując precyzyjną kontrolę. Następnie ustaw mikromanipulator w pozycji zgrubnej kontroli. Powoli zejdź mikropipetę do płaszczyzny B, obserwując sylwetkę mikropipety, aż mikropipeta znajdzie się w pełnej ostrości.

Gdy końcówka mikropipety znajdzie się w ognisku, ustaw mikromanipulator na precyzyjną kontrolę. Następnie opuść obiektyw do płaszczyzny równikowej komórki i obniż mikropipetę do około 15 mikrometrów powyżej. Ustaw ciśnienie kompensacji na mikrowtryskiwaczu na żądane ciśnienie.

Poczekaj kilka sekund, aż ciśnienie się ustabilizuje. Ważne jest, aby sprawdzić, czy końcówka pipety nie jest złamana lub zatkana, w przeciwnym razie pomiar siły byłby niedokładny. Upewnij się, że mikropipeta nie jest zatkana, korzystając z ustawienia czyszczenia na panelu mikromanipulatora i upewnij się, że pęcherzyki powietrza wydostają się z końcówki mikropipety.

Następnie włóż końcówkę mikropipety do ogniwa, aż lekko dotknie powierzchni jądra. Uszczelnienie należy utworzyć między końcówką mikropipety a membraną jądrową, odłączając rurkę doprowadzającą ciśnienie od systemu mikroiniekcji, otwierając w ten sposób koniec mikropipety na atmosferę. Ten krok wytwarza podciśnienie równe ciśnieniu kompensacyjnemu na powierzchni jądrowej.

Następnie otwórz oprogramowanie do zbierania obrazów. Skonfiguruj akwizycję AVI dla wideo lub akwizycję ND dla obrazów w oprogramowaniu do zbierania obrazów. Następnie przełącz się na odpowiedni kanał obrazowania fluorescencyjnego i rozpocznij obrazowanie.

Odsunąć końcówkę mikropipety od korpusu komórki, aż jądro odłączy się od mikropipety. Ten rysunek pokazuje wymuszanie jądra mysich fibroblastów NIH 3T3. Gdy końcówka mikropipety przesuwa się w prawo, jądro odkształca się i ostatecznie odłącza się od końcówki mikropipety.

Obserwuje się, że odkształcenie długości jądra wzrasta wraz ze wzrostem siły ssania. Przednia krawędź jądra tworzy występ jądrowy, a krawędź spływu jest przemieszczona z pierwotnego położenia. Długość występu jest znacznie większa niż przemieszczenie krawędzi spływu, co sugeruje ścisłą integrację między jądrem a otaczającą cytoplazmą.

Skale czasowe są krótkie dla rozluźnienia przedniej krawędzi jądrowej i tylnej krawędzi jądrowej. Sonda siły bezpośredniej została wykorzystana do określenia udziału struktur wewnątrzjądrowych i cytoszkieletowych w odporności jądra na odkształcenia. Obrazy fluorescencyjne ukazywały nakładanie się jądra przed i po we wskazanym stanie.

Chociaż nie stwierdzono istotnych różnic w deformacji lub translacji jądrowej po rozerwaniu F-aktyny lub rozerwaniu mikrotubul, zmniejszenie ekspresji menten poprzez knockdown oparty na siRNA spowodowało znacznie większą translację i deformację jądra. Sugeruje to, że włókna pośrednie menten w fibroblastach są głównym elementem cytoszkieletu, który pomógł jądru oprzeć się lokalnej sile. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przyłożyć kontrolowaną i znaną siłę do jądra w żywej przylegającej komórce.