Name: Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj prosty test optyczny do analizy recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampalnych z nadekspresją białek presynaptycznych. Ta metoda umożliwia badaczom ocenę dynamiki pęcherzyków synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Irmgard Weiss za fachową pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez DFG za pośrednictwem Klastra Doskonałości w zakresie mikroskopii w zakresie nanometrów i fizjologii molekularnej mózgu (CNMPB, B1-7, do T.D.).

Nie przeprowadzono żadnych badań na żywych zwierzętach. Eksperymenty na zwierzętach poddanych eutanazji w celu uzyskania kultur komórkowych zostały zatwierdzone przez lokalne organy ochrony zwierząt (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) pod numerem identyfikacyjnym T10/30. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi protokołami.
1. Pierwotna hodowla komórek hipokampa
<ol>
	<li>Przygotuj zdysocjowaną hodowlę komórkową hipokampa szczura w dniu embrionalnym 1916,17. Umieść komórki na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych pokrytych polietylenoiminą (PEI) w 24-dołkowych szalkach o gęstości 50 000 - 60 000 komórek/basenik. Sprawdź gęstość za pomocą komory zliczania komórek i optyki kontrastu fazowego.</li>
	<li>Hodować neurony przez 3 dni (dzień in vitro (DIV) 3) na 24-dołkowej płytce w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Oceń szkiełka nakrywkowe pod kątem wskaźników zdrowia komórek za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym (np. optyka z kontrastem fazowym przy powiększeniu 10-20x). Sprawdź następujące wskaźniki dobrego zdrowia: wyraźna aureola z kontrastem fazowym, neuryty bez struktur perełkowych oraz brak grupowania somy lub wiązki neurytów.</li>
</ol>
2. Transfekcja
Uwaga: Następujący protokół odnosi się do podwójnej transfekcji dla 3 dołków. Jednak protokół działa najlepiej, gdy przygotowane są ilości wystarczające na 4 studnie.
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml buforu transfekcyjnego (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 15 mM glukozy, 42 mM HEPES) w kolbie Erlenmeyera.
	<ol>
		<li>W kolbie Erlenmeyera rozpuścić 8,0 g NaCl, 0,37 g KCl, 0,095 g Na2HPO4, 1,35 g glukozy i 5,0 g HEPES w 400 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Doprowadzić pH do 6,95 za pomocą 1 M NaOH za pomocą pH-metru.</li>
		<li>Dostosuj objętość wodą destylowaną do 500 ml i sprawdź pH za pomocą pH-metru.</li>
		<li>Przygotować 20 - 30 ml podwielokrotności buforu do transfekcji o następujących wartościach pH, pipetując 1 M NaOH do buforu transfekcyjnego: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7,11, 
		Uwaga: pH buforu do transfekcji ma kluczowe znaczenie dla skuteczności transfekcji.</li>
		<li>Aby sprawdzić, który bufor transfekcji prowadzi do największej liczby transfekowanych komórek, przetestuj każdą wartość pH od 6,96 do 7,11. Stosować metodę transfekcji opisaną w ppkt 2.2 - 2.11 i zwalidowany plazmid wykazujący ekspresję GFP. Określ liczbę transfekowanych komórek na szkiełko nakrywkowe dla każdej wartości pH buforu transfekcji, aby ocenić, który bufor działa najlepiej.</li>
		<li>Porcjować bufor o najwyższej skuteczności transfekcji do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml Zamrażać i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzej wstępnie zredukowaną pożywkę surowicy, pożywkę do hodowli komórkowych i wodę destylowaną do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę do transfekcji w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Pracuj pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylne warunki pracy.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 7,5 μl 2 M chlorku wapnia z 4 μg każdego DNA wolnego od endotoksyn (Synaptophysin-mOrange i mGFP/GFP-Rogdi). Dodaj wodę do uzyskania całkowitej objętości 60 μl w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Do mieszanki dodać 60 μl buforu transfekcyjnego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, dodawaj bufor transfekcyjny kroplami, delikatnie potrząsając mieszanką DNA na wirze.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut. Unikaj potrząsania rurką inkubacyjną w czasie inkubacji, umieszczając probówkę obok okapu z przepływem laminarnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod pokrywą z przepływem laminarnym wyjąć pożywkę do hodowli komórkowych ("pożywkę kondycjonowaną") ze studzienek za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i przechowywać ją w oddzielnym pojemniku w inkubatorze.</li>
	<li>Dodać 500 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdego dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do zakończenia 20-minutowego okresu inkubacji (etap 2.3.3).</li>
	<li>Dodać 30 μl mieszanki do transfekcji do każdego dołka, pipetując kilka kropli. Wyrzuć pozostałość na dnie tubki.</li>
	<li>Po dostarczeniu wszystkich studzienek z mieszanką transfekcyjną, delikatnie potrząśnij płytką 24-dołkową, aby zapewnić rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej w podłożu.</li>
	<li>Inkubować studzienki przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wyjąć i wyrzucić mieszankę do transfekcji i przemyć ją trzykrotnie pożywką do hodowli komórkowych. Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki i inkubować je przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Usunąć 750 μl pożywki i dodać taką samą ilość świeżej pożywki. Powtórz to trzy razy. 
	Uwaga: Etap prania ma kluczowe znaczenie. Utrzymuj czas, w którym w każdej studzience nie ma pożywki (tj. wyjmuj i wymieniaj dobrze po studzience) i delikatnie dodawaj pożywkę myjącą.</li>
	<li>Wyjąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej i dodać 450 μl kondycjonowanej pożywki dobrze przez studzienkę.</li>
	<li>Pozwól neuronom dojrzeć w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do DIV 10.</li>
</ol>
3. Stymulacja i absorpcja Syt1
Uwaga: Następujący protokół stosuje pobór do 3 odwiertów. W przypadku depolaryzacji dowolnej innej liczby studzienek należy odpowiednio dostosować ilości.
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml 10x buforu depolaryzacyjnego (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glukozy, 200 mM HEPES, pH 7,4) w kolbie Erlenmeyera. 
	Uwaga: Bufor depolaryzacyjny może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Jeśli używany jest również roztwór niedepolaryzujący, przygotuj 10-krotny roztwór Tyrode'a składający się z 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glukozy, 200 mM HEPES pH 7,4 w celu porównania recyklingu wywołanego stymulacją z recyklingiem spontanicznym. Po rozcieńczeniu do 1x, przed użyciem dodać 1 μM tetrodotoksyny, aby zablokować wytwarzanie potencjału czynnościowego.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1,87 g NaCl, 2,61 g KCl, 0,1 g MgCl2-6H 20, 0,15 g CaCl2-2H 2O i 3,0 g glukozy-1H2O i 2,38 g HEPES w 50 ml wody destylowanej w kolbie Erlenmeyera. Dostosuj pH za pomocą NaOH i sterylnie przefiltruj roztwór. Rozcieńczyć bufor w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej, aby uzyskać stężenie 1x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (pH 7,4) do utrwalenia po stymulacji.
	<ol>
		<li>Na 500 ml 4% PFA w 1x PBS, rozpuść 20 g paraformaldehydu w 450 ml destylowanego H2O. 
		Uwaga: Podgrzanie roztworu może przyspieszyć jego rozpuszczenie, ale nie należy podgrzewać roztworu powyżej 70 °C, ponieważ PFA może się rozpaść. 
		Uwaga: PFA jest toksyczny, potencjalnie rakotwórczy i teratogenny. Podczas pracy z PFA należy nosić rękawice, pracować pod wyciągiem i unikać połknięcia.</li>
		<li>Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury rynkowej i dodać 50 ml roztworu podstawowego 10x PBS. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH/HCl za pomocą pH-metru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzej 600 μl 1x buforu depolaryzacyjnego i 10 ml pożywki do hodowli komórkowych do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Dodaj 1 μl mysiego przeciwciała anty-Syt1 (klon 604.2) do 1x bufora depolaryzacyjnego i wiruj przez 10 sekund.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z komórek. Dodać 200 μl mieszaniny przeciwciał depolaryzacyjnych do każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć mieszaninę przeciwciał depolaryzacyjnych i przemyj ją trzykrotnie pożywką do hodowli komórkowych. Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka i inkubować przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Usunąć 750 μl pożywki i dodać taką samą ilość świeżej pożywki. Powtórz trzy razy.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych i dodaj 300 μl 4% PFA w 1x PBS. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS. 
	Uwaga: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
4. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml buforu blokującego. 
	Uwaga: Bufor blokujący może być utrzymywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 2,5 g sacharozy i 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 5 ml 10 x PBS roztworu podstawowego. Dodać 1,5 ml 10% roztworu podstawowego detergentu. Mieszać roztwór, aż wszystkie składniki prawidłowo się rozpuszczą i dodawać destylowanyH2O, aż do osiągnięcia końcowej objętości 50 ml. Podwielokrotnić roztwór i zamrozić podwielokrotności do przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało sprzężone z fluoroforem (skierowane przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała Syt1) w 200 μl buforu blokującego w każdym dołku w rozcieńczeniu 1:1000.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić 1x PBS z każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Dodać 200 μl blokującej mieszaniny buforu i przeciwciała do każdego dołka i inkubować przez 60 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: Ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło, wszystkie kroki idące naprzód muszą być wykonywane w ciemności.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki trzy razy przez 5 minut 1 ml 1x PBS.</li>
	<li>Osadź szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą medium do zatapiania.
	<ol>
		<li>Dodać kroplę 7 μl podłoża do zatapiania na szkiełko mikroskopowe. Usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej, podnosząc je strzykawką i chwytając kleszczami. 
		Uwaga: Komórki na powierzchni szkiełka nakrywkowego łatwo ulegają uszkodzeniu, dlatego z kleszczami należy obchodzić się ostrożnie.</li>
		<li>Zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie destylowanej, aby usunąć PBS i ostrożnie wysusz, dotykając jedną krawędzią miękkiej tkanki.</li>
		<li>Odwróć szkiełko nakrywkowe na kroplę podłoża do zatapiania, tak aby powierzchnia zawierająca komórki była skierowana w stronę szkiełka mikroskopowego, osadzając w ten sposób komórki w podłożu zatapiającym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia pod maską na 1 - 2 godziny (przykryj je, aby uniknąć ekspozycji na światło) i przechowuj je w pudełku na szkiełka mikroskopowe w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
5. Analiza mikroskopowa
<ol>
	<li>Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych umieść je pod mikroskopem z obiektywem i aparatem.</li>
	<li>Dostosuj czas ekspozycji dla każdego kanału tak, aby kilka pikseli było prześwietlonych i zapewnić maksymalny rozkład wartości szarości. 
	Uwaga: Chociaż czas naświetlania może się różnić w zależności od kanału, powinien być stały dla jednego kanału, aby zapewnić porównywalność szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Uzyskuj wielokanałowe obrazy dla 10 obszarów zainteresowania (ROI) na szkiełko nakrywkowe. Sprawdź, czy ROI zawiera procesy aksonalne z transfekowanego neuronu, sprawdzając fluorescencję GFP, która powinna być punktowana.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Eksportuj obrazy jako pliki .tif. Załaduj obrazy do OpenView18, klikając Plik | Załaduj plik obrazu.</li>
	<li>Wybierz obraz Synaptophysin-mOrange jako kanał 1, obraz Rogdi-GFP/mGFP jako kanał 2 i obraz fluorescencji Alexa647 jako kanał 3.</li>
	<li>Próg zwrotu z inwestycji.
	<ol>
		<li>Kliknij opcję Analiza | Umieść obszar nad puncta. Wybierz wartości Threshold i Delta intensity tak, aby po oględzinach fluorescencja rozproszona była wykluczona, pozostawiając tylko sygnały punktowe na obrazie kanału 1 (reprezentującego fluorescencję Synaptophysin-mOrange). Zachowaj ten sam próg dla wszystkich obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś te ROI do odpowiedniego kanału 2 (fluorescencja GFP-Rogdi/mGFP) i 3 (fluorescencja Syt1) każdego obszaru szkiełka nakrywkowego, klikając Wykonaj teraz. 
	Uwaga: Zwrot z inwestycji powinien być brany pod uwagę tylko wtedy, gdy komórka jest podwójnie transfekowana. W tej metodzie fluorescencja mOrange- i GFP powinna być wyraźnie widoczna.</li>
	<li>Zapisz dane w edytorze dziennika analizy, klikając opcję Dane dziennika.</li>
	<li>Otwórz edytor dziennika analizy na karcie Windows i skopiuj wartości dla każdego kanału. Wklej wartości dla poszczególnych kanałów do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Określ średnią intensywność fluorescencji kanału Syt1 przy ROI w obu warunkach transfekcji (GFP-Rogdi i mGFP).</li>
	<li>Zastosuj odpowiednie testy statystyczne, takie jak test t-Studenta, aby określić znaczące różnice.</li>
</ol>

<ol><li>Koh, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I%2C+a+Ca2%2B+sensor+for+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release.</a> Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).</li>
<li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Does+Synaptotagmin+Trigger+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).</li>
<li>Perin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Conservation+of+Synaptotagmin+%28p65%29+in+Drosophila+and+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).</li>
<li>Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytotic+Recycling+of+Synaptic+Vesicles+in+Developing+Processes+of+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).</li>
<li>Ko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin-1+performs+neurexin-dependent+and+neurexin-independent+functions+in+synapse+validation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation.</a> The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).</li>
<li>Shinoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+enhances+spontaneous+and+activity-dependent+neurotransmitter+release+at+excitatory+terminals+but+not+at+inhibitory+terminals+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27(2014).</li>
<li>Ivanova, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25652077">Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo.</a> The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).</li>
<li>Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+impairment+of+spontaneous+neurotransmission+modulates+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy.</a> Nature Communications. 8, 1-14 (2017).</li>
<li>Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome+associated+gene+Rogdi+encodes+a+novel+presynaptic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rogdi+Defines+GABAergic+Control+of+a+Wake-promoting+Dopaminergic+Pathway+to+Sustain+Sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila.</a> Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).</li>
<li>Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptic+encephalopathy+and+amelogenesis+imperfecta%3A+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Euopean+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome.</a> Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).</li>
<li>Kraszewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicle+Dynamics+in+Living+Cultured+Hippocampal+Neurons+Visualized+with+CY3-Conjugated+Antibodies+Directed+against+the+Lumenal+Domain+of+Synaptotagmin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin.</a> Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/02/08/262246">Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> bioRxiv. , 262246(2018).</li>
<li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).</li>
<li>Dresbach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regions+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+Bassoon%3A+Significance+for+synaptic+targeting+and+cytomatrix+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+Prenatal+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).</li>
<li>Tsuriel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+sharing+as+a+predominant+determinant+of+synaptic+matrix+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics.</a> PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).</li>
<li>Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Synaptic+Vesicle+Recycling+Using+FM+Dyes+During+Evoked%2C+Spontaneous%2C+and+Miniature+Synaptic+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).</li>
<li>Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Synaptic+Vesicle+Endocytosis+in+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24369372">Visualizing presynaptic function.</a> Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).</li>
<li>Opazo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+Intermixing+of+Synaptic+Vesicle+Components+upon+Vesicle+Recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling.</a> Traffic. 11, 800-812 (2010).</li>
<li>Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).</li>
<li>Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21145004">Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix.</a> Neuron. 68, 907-920 (2010).</li>
<li>Wittenmayer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Neuroligin1+regulates+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).</li>
<li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Remodeling+of+the+Presynaptic+Cytomatrix+upon+Homeostatic+Adaptation+to+Network+Activity+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing.</a> Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).</li>
<li>Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+synaptic+vesicles+in+nerve+endings+monitored+by+recovery+from+photobleaching+of+synaptic+vesicle-associated+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence.</a> Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).</li>
<li>Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+origin+of+synaptic+vesicles+undergoing+evoked+and+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion.</a> Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).</li>
<li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycosylation+Is+Essential+for+Vesicular+Targeting+of+Synaptotagmin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1.</a> Neuron. 41, 85-99 (2004).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+is+dispensable+for+sorting+of+synaptotagmin+1+but+is+critical+for+targeting+of+SV2+and+synaptophysin+to+recycling+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).</li>
<li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pool-specific+modification+of+neurotransmitter+release+by+intravesicular+free+radical+generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation.</a> The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).</li>
<li>Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+pool+of+vesicles+recycles+at+rest+and+drives+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 45, 563-573 (2005).</li>
<li>Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+same+synaptic+vesicles+drive+active+and+spontaneous+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release.</a> Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).</li>
<li>Bacci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+blockade+of+glutamate+receptors+enhances+presynaptic+release+and+downregulates+the+interaction+between+synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated+membrane+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2.</a> Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).</li>
<li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li>
<li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li>
<li>Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/03/172239">Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25.</a> bioRxiv. , 172239(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieją trzy testy rutynowo stosowane do badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV). Pierwsze dwa obejmują zastosowanie: a) fluorescencyjnych barwników styrylowych, takich jak FM1-43 (które wbudowują się w błony, są pobierane do organelli podczas endocytozy i są uwalniane po egzocytozie); oraz b) znakowane fluorescencyjnie rekombinowane białka SV (które w przypadku nadekspresji włączają się do mechanizmu recyklingu białek). Jeśli przyłączone fluorofory zmieniają swoją fluorescencję w zależności od pH, można je wy...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych jest ważne dla określenia, jak zmieniają się właściwości presynaptyczne, czy to podczas plastyczności synaptycznej, czy w odpowiedzi na zaburzenia funkcji synaptycznych. Badanie wychwytu przeciwciał Synaptotagmin-1 (Syt1) stanowi jedną z metod pomiaru ilości recyklingu SV. Syt1 jest białkiem związanym z SV, które działa jako czujnik Ca2 + i jest niezbędne do egzocytotycznego uwalniania neuroprzekaźnika1,2. Jest to białko transbłonowe z C-końcową domeną cytoplazmatyczną na zewnątrz SV i N-końcową domeną luminalną wewnątrz SV3. Podczas egzocytozy domena luminalna Syt1 zostaje wystawiona na działanie ośrodka zewnętrznego. Do tego zewnętrznego podłoża dodajemy przeciwciała skierowane przeciwko domenie cytoplazmatycznej, która ulega internalizacji podczas endocytozy. Przeciwciała te mogą być wstępnie sprzężone z fluoroforami lub wybarwione immunologicznie przeciwciałami drugorzędowymi4,5,6,7. Intensywność fluorescencji powstałego sygnału immunologicznego jest proporcjonalna do ilości recyklingu SV. To podejście można wykorzystać do określenia zarówno konstytutywnego, jak i wywołanego depolaryzacją recyklingu SV6,8.
Testy wychwytu Syt1 mogą być przeprowadzone po transferze genów za pośrednictwem wirusa do praktycznie wszystkich komórek w naczyniu lub po rzadkiej transfekcji małej liczby komórek. Nasza metoda łączy test z rzadką podwójną transfekcją pierwotnych neuronów hipokampa przy użyciu fosforanu wapnia9. Używamy rekombinowanego białka markerowego, o którym wiadomo, że gromadzi się w presynapsach, fluorescencyjnie znakowanej synaptofizyny, aby zlokalizować zakończenia presynaptyczne i nadekspresję naszego interesującego białka, Rogdi. Dzięki temu możemy sprawdzić, czy Rogdi celuje w funkcjonalne synapsy i wpływa na recykling SV. Gen kodujący Rogdi został pierwotnie zidentyfikowany w badaniu przesiewowym dla mutantów Drosophila charakteryzujących się upośledzoną pamięcią10. U ludzi mutacje w genie Rogdi powodują rzadką i wyniszczającą chorobę zwaną zespołem Kohlschüttera-Tönza. Pacjenci cierpią na wady rozwojowe szkliwa zębów, padaczkę farmooporną i opóźnienia psychomotoryczne; Jednak subkomórkowa lokalizacja produktu genu pozostała nieuchwytna11. W związku z tym test wychwytu Syt1 dostarczył kluczowych dowodów na lokalizację Rogdi znakowanego GFP w funkcjonalnych synapsach9.
Ta technika absorpcji ma kilka zalet. Po pierwsze, recykling SV można obserwować zarówno w czasie rzeczywistym, wykonując obrazowanie na żywo7,12, jak i po utrwaleniu6,9 mierząc intensywność fluorescencji etykiety fluorescencyjnej Syt1. Dodatkowo opracowano kilka wariantów przeciwciała Syt1. Istnieją nieoznakowane warianty, które można znakować przeciwciałem drugorzędowym zgodnie ze standardowym protokołem barwienia immunologicznego po utrwaleniu, oraz warianty wstępnie sprzężone z już dołączoną etykietą fluorescencyjną. Wreszcie, fluorescencja oparta na przeciwciałach jest korzystna ze względu na duży wybór dostępnych na rynku barwników wtórnych lub sprzężonych, które można zastosować.
Podczas utrwalania i barwienia immunologicznego neuronów, możliwe jest również barwienie w poszukiwaniu dodatkowych białek i przeprowadzenie analizy kolokalizacji. Może to pomóc w ustaleniu, gdzie się znajdują w odniesieniu do recyklingu SV. Intensywność etykiety fluorescencyjnej jest bezpośrednią miarą ilości recyklingu SV. Ponadto przeciwciała selektywnie znakują struktury zawierające Syt1, co skutkuje wysoką specyficznością i niewielką fluorescencją tła4. Można również stosować różne protokoły stymulacji, takie jak depolaryzacyjne lub protokoły stymulacji elektrycznej9,12,13,14. Jednak podstawowy recykling SV można zmierzyć bez stymulacji kultur neuronalnych15.
Nasza metoda dotyczy konkretnie wychwytu przeciwciał Syt1 w podwójnie transfekowanych neuronach z wtórnym immunoznakowaniem przeciwciał po fiksacji. W naszej dyskusji odnosimy się jednak do wszystkich rutynowo stosowanych wariantów testu, aby dać widzom możliwość dostosowania protokołu do konkretnych potrzeb.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>osioł anty myszy Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24-dołkowa</td> rurka <td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck</td><td>1 083 421 000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td><td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application</td><td>Darmowe oprogramowanie, zobacz komentarze</td><td></td><td>napisane przez Noam E. Ziv, Technion &ndash; Izraelski Instytut Technologiczny, Hajfa, Izrael</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur ochronny PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Numer seryjny 40649111</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>105311</td><td>myszy monoklonalne; klon 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1 086 031 000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Na aktywnych presynaptycznych zakończeniach nerwowych, pęcherzyki synaptyczne przechodzą cykle egzo- i endocytozy. Podczas recyklingu domeny świetlne białek transbłonowych SV zostają odsłonięte na powierzchni komórki. Jednym z tych białek jest Synaptotagmin-1 (Syt1). Przeciwciało skierowane przeciwko domenie luminalnej Syt1, po dodaniu do pożywki hodowlanej, jest pobierane podczas cyklu egzoendocytotycznego. Wychwyt ten jest proporcjonalny do ilości recyklingu SV i można go określić ilościowo za pomocą immunofluorescencji. W tym przypadku łączymy wychwyt przeciwciał Syt1 z podwójną transfekcją hodowanych neuronów hipokampa. Pozwala nam to (1) zlokalizować miejsca presynaptyczne na podstawie ekspresji rekombinowanego markera presynaptycznego Synaptophysin, (2) określić ich funkcjonalność za pomocą wychwytu Syt1 oraz (3) scharakteryzować celowanie i efekty białka będącego przedmiotem zainteresowania, GFP-Rogdi.

Oczekiwanym wynikiem tego podejścia jest zlokalizowanie około 50 neuronów podwójnie przetransfekowanych na szkiełko podstawowe przy gęstości 50 000 neuronów na dołek. Przewiduje się, że akson każdego neuronu wykaże liczne punkty o wysokiej intensywności (hotspots) akumulacji oznakowanej fluorescencyjnie Synaptofizyny, co wskazuje na skupiska SVs. W funkcjonalnych miejscach presynaptycznych sygnał rekombinowanej Synaptofizyny kolokalizuje z punktową fluorescencją Syt1. Dzięki podwójnej tra...

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo prosta, wymaga jedynie standardowego sprzętu i korzysta z podstawowej zalety przeciwciał, jaką jest ich specyficzność. Protokół został pierwotnie wprowadzony przez Michela Matteoli i współpracowników i okazał się bardzo skuteczny. Użyłem go do sprawdzenia, czy pewne białko cordocti jest zlokalizowane w aktywnych synapsach.Rozpocznij tę procedurę od hodowli pierwotnych komórek hipokampa na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce przez trzy dni, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podgrzej pożywkę o zredukowanej surowicy, pożywkę do hodowli komórkowych i wodę destylowaną do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Pracując pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylne warunki pracy, przygotuj mieszankę transfekcyjną w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej.Najpierw wymieszaj 7,5 mikrolitra dwumolowego chlorku wapnia z czterema mikrogramami każdego DNA wolnego od endotoksyn. Dodaj wodę, aby osiągnąć całkowitą objętość 60 mikrolitrów w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Teraz dodaj 60 mikrolitrów buforu transfekcyjnego do mieszanki.Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy dodawać bufor transfekcyjny kroplami, delikatnie potrząsając mieszaniną DNA na wirze. Powstałą mieszaninę transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Unikaj potrząsania probówką w czasie inkubacji.Pod pokrywą z przepływem laminarnym wyjąć pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, przechowywać ją w osobnym pojemniku i natychmiast dodać 500 mikrolitrów pożywki o obniżonej surowicy do każdej studzienki. Przechowywać kondycjonowaną pożywkę w inkubatorze. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aż do zakończenia 20-minutowego okresu inkubacji mieszanki transfekcyjnej.Następnie dodaj 30 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki, pipetując kilka kropli. Wyrzuć pozostałość na dnie tubki. Po dostarczeniu wszystkich studzienek z mieszanką do transfekcji, delikatnie potrząśnij płytką 24-dołkową, aby zapewnić rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej w podłożu.Teraz inkubuj studnie przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po inkubacji usunąć i wyrzucić mieszankę transfekcyjną, a następnie trzykrotnie przemyć komórki pożywką do hodowli komórkowych. Etap mycia ma kluczowe znaczenie.Zminimalizuj czas, w którym każda studzienka nie ma pożywki, usuwając i wymieniając studnię po studni. Pamiętaj też, aby delikatnie dodać podłoże. Aby umyć komórki, dodaj jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki i inkubuj je przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.Następnie usuń 750 mikrolitrów pożywki i dodaj taką samą ilość świeżego podłoża. Po trzykrotnym powtórzeniu tego procesu należy usunąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej i dodać 450 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki dobrze po studzience. Teraz pozwól neuronom dojrzeć w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 do DIV 10.Podgrzej 600 mikrolitrów buforu depolaryzacyjnego 1X i 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Dodaj jeden mikrolitr mysiego przeciwciała anty-Syt1 do bufora depolaryzacyjnego 1X i wiruj przez 10 sekund. Po wyjęciu i odrzuceniu pożywki do hodowli komórkowych z komórek, dodaj 200 mikrolitrów mieszanki przeciwciał depolaryzacyjnych do każdej studzienki.Inkubować płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 w inkubatorze. Usuń i wyrzuć mieszaninę przeciwciał depolaryzacyjnych i umyj komórki trzykrotnie pożywką do hodowli komórek. Dodaj jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki i inkubuj przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.Następnie usuń 750 mikrolitrów pożywki i dodaj taką samą ilość świeżego podłoża. Powtórz ten proces trzy razy. Następnie usuń i wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj 300 mikrolitrów 4% PFA w 1X PBS.Na koniec inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie myć trzy razy przez pięć minut, każdy z 1X PBS. Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało sprzężone z fluoroforem w 200 mikrolitrach buforu blokującego dla każdej studzienki w rozcieńczeniu od jednego do 1 000. Usuń i wyrzuć 1X PBS z każdej studzienki zawierającej szkiełka nakrywkowe z hodowanymi neuronami.Dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał blokujących bufor do każdej studzienki i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyj komórki trzy razy przez pięć minut jednym mililitrem 1X PBS. Następnie dodaj siedmiomikrolitrową kroplę pożywki do osadzania na szkiełku mikroskopu.Usuń szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej, podnosząc je kaniulą i chwytając kleszczami. Zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie destylowanej, aby usunąć PBS, i ostrożnie wysusz, dotykając jedną krawędzią miękkiej tkanki. Odwróć szkiełko nakrywkowe na kroplę pożywki tak, aby powierzchnia, na której znajdują się komórki, była skierowana w stronę szkiełka mikroskopowego, osadzając w ten sposób komórki w podłożu do zatapiania.Pozostaw szkiełka do wyschnięcia pod maską na jedną do dwóch godzin, przykrywając je, aby uniknąć ekspozycji na światło. Przechowuj wysuszone szkiełka w pudełku na szkiełka mikroskopowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po znakowaniu immunologicznym przeciwciała Syt1 przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie, zakres wychwytu Syt1 jest ostatecznie określany ilościowo za pomocą sygnału immunologicznego.Immunofluorescencja punktowa wskazuje miejsca wychwytu Syt1 w polu widzenia. Miejsca te zawierają zatem pęcherzyki synaptyczne, które poddały się recyklingowi podczas eksperymentu. Fluorescencja Synaptophysin-mOrange wskazuje na nagromadzenie pęcherzyków synaptycznych w aksonie transfekowanego neuronu.Fluorescencja GFP-Rogdi wskazuje na nagromadzenie Rogdi w aksonie transfekowanego neuronu. Ta część eksperymentu ujawnia rozległą kolokalizację GFP-Rogdi i Synaptophysin-mOrange, co sugeruje, że GFP-Rogdi gromadzi się w miejscach presynaptycznych w aksonie. Nakładka ujawnia, które z koakumulacji GFP-Rogdi i Synaptophysin-mOrange kolokalizują się z miejscami wychwytu przeciwciał Syt1.Miejsca oznaczone strzałkami reprezentują nagromadzenie rekombinowanej Rogdi i rekombinowanej synaptofizyny w funkcjonalnych synapsach. Protokół przedstawia technicznie prosty sposób określenia zakresu recyklingu pozostałości synaptycznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w naukach molekularnych i komórkowych, takie jak to, gdzie presynaptyczne zakończenia nerwowe są rozmieszczone w aksonie określonego neuronu i czy na tych końcach gromadzi się rekombinowane lub endogenne białko będące przedmiotem zainteresowania.Po opracowaniu technika ta była wykorzystywana na wiele sposobów do monitorowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w zakończeniach presynaptycznych. Na przykład można go wykorzystać do określenia recyklingu pęcherzyków synaptycznych w neuronach po nadekspresji na białkach adaptacyjnych, a także w neuronach uzyskanych od zwierząt lub neuronów pochodzących z komórek macierzystych.

an-optical-assay-for-synaptic-vesicle-recycling-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.

Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM

Ten film demonstruje procedurę przygotowania hodowanych neuronów do analizy optycznej przetworzonych pęcherzyków synaptycznych. Proces ten obejmuje znakowanie fluorescencyjne białek pęcherzyków synaptycznych i barwienie immunologiczne w celu oznakowania i wizualizacji pęcherzyków pochodzących z recyklingu w neuronach.

Przygotowanie hodowanych neuronów do analizy optycznej przetworzonych pęcherzyków synaptycznych

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Tworzenie presynaps to dynamiczny proces, w tym akumulacja białek synaptycznych w odpowiedniej kolejności. W tej metodzie tworzenie presynaps jest wywoływane przez koraliki sprzężone z białkiem organizatora presynapsy na arkuszach aksonalnych hodowli "kuli neuronalnej", dzięki czemu akumulacja białek synaptycznych jest łatwa do analizy podczas tworzenia presynapsy.

Test tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli "kuli neuronalnej"

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Poznaj prosty test optyczny do analizy recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampalnych z nadekspresją białek presynaptycznych. Ta metoda umożliwia badaczom ocenę dynamiki pęcherzyków synaptycznych.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Przeglądaj więcej filmów