Name: Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metody utrzymywania kultur mszyc i analizy ekspresji genów u Aphis nerii. Protokoły te umożliwiają badanie interakcji roślinowo-owadzich oraz mechanizmów molekularnych biologii mszyc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Michelle Moon (Vanderbilt University) za pomoc w fotografii. Vanderbilt University zapewnił wsparcie dla PA, a SSLB jest wspierany przez DGE-1445197.

<ol><li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum.%3A+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological%2C+developmental+and+evolutionary+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> BioEssays. 28, 747-755 (2006).</li>
<li>Dixon, A. F. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDixon%2C+AFG+%22Aphid+Ecology%3A+An+Optimization+Approach%22">Aphid Ecology: An Optimization Approach</a>. , Springer. Netherlands. (1985).</li>
<li>Consortium, T. I. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Sequence+of+the+Pea+Aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biology. , 1000313(2010).</li>
<li>Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphids%3A+A+Model+for+Polyphenism+and+Epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+International%22%5BJournal%5D)">Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics.</a> Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).</li>
<li>Wenger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequence+of+the+soybean+aphid%2C+Aphis+glycines%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochememistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines.</a> Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).</li>
<li>Aphidbase. Genouest.org. , Available from: 
 <a target="_blank" href="bipaa.genouest.org/is/aphidbase/">bipaa.genouest.org/is/aphidbase/</a> (2018).</li>
<li>Li, Z. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+adaption+analysis+of+the+cotton+aphid+%28Aphis+gossypii%29+in+different+phenotypes+by+transcriptome+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison.</a> PLoS ONE. 8, 83180(2013).</li>
<li>Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomic+analyses+revealed+divergences+of+two+agriculturally+important+aphid+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+characterization+of+the+pine+aphid+Cinara+pinitabulaeformis+Zhang+et+Zhang+transcriptome+and+analysis+of+genes+relevant+to+pesticides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides.</a> PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).</li>
<li>Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profile+and+differential+fitness+in+a+specialist+milkweed+insect+across+host+plants+varying+in+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity.</a> Molecular Ecology. , (2017).</li>
<li>Dixon, A. F. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDixon%2C+AFG+%22Insect+Herbivore-Host+Dynamics%22">Insect Herbivore-Host Dynamics</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).</li>
<li>Goggin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-aphid+interactions%3A+molecular+and+ecological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).</li>
<li>Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+phloem-feeding+insects+face+the+challenge+of+phloem-located+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).</li>
<li>Webster, B. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-3032.2011.00791.x">The role of olfaction in aphid host location.</a> Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).</li>
<li>Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+cardenolides%3A+chemical+ecology+and+coevolution+of+specialized+plant-herbivore+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions.</a> New Phytologist. 194, 28-45 (2012).</li>
<li>Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coping+with+toxic+plant+compounds-+the+insect%27s+perspective+on+iridoid+glycosides+and+cardenolides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides.</a> Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).</li>
<li>Opitz, S. E. W., Müller, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-009-0018-6">Plant chemistry and insect sequestration.</a> Chemoecology. 19, 117-154 (2009).</li>
<li>Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/eea.12659">Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).</li>
<li>Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+glycosides+in+the+oleander+aphid%2C+Aphis+nerii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii.</a> Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).</li>
<li>Harrison, J. S., Mondor, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+invasive+aphid+%27superclone%27%3A+extremely+low+genetic+diversity+in+oleander+aphid+%28Aphis+nerii%29+populations+in+the+southern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States.</a> PLoS ONE. 6, 17524(2011).</li>
<li>Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+trade-offs+in+plants+mediate+the+strength+of+trophic+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades.</a> Science. 327, 1642-1644 (2010).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2010).</li>
<li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-Seq+data+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li>
<li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+transcript+sequence+reconstruction+from+RNA-seq+using+the+Trinity+platform+for+reference+generation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis.</a> Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).</li>
<li>Transdecoder. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://transdecoder.sf.net">http://transdecoder.sf.net</a> (2018).</li>
<li>Finn, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pfam+protein+families+database%3A+towards+a+more+sustainable+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Pfam protein families database: towards a more sustainable future.</a> Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).</li>
<li>The UniProt Consortium. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14681372">UniProt: the universal protein knowledgebase.</a> Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCBI+BLAST%3A+a+better+web+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NCBI BLAST: a better web interface.</a> Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).</li>
<li>Hmmer.org. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://hmmer.org">http://hmmer.org</a> (2018).</li>
<li>Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD-HIT%3A+accelerated+for+clustering+the+next+generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).</li>
<li>Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BUSCO%3A+assessing+genome+assembly+and+annotation+completeness+with+single-copy+orthologs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs.</a> Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 31(2014).</li>
<li>Rieu, I., Powers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+RT-PCR%3A+design%2C+calculations%2C+and+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics.</a> Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).</li>
<li>Malcolm, S. B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01240581">Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid.</a> Chemoecology. 1, 12-21 (1990).</li>
<li>Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.0307-6946.2004.00635.x">Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations.</a> Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).</li>
<li>Zehnder, C. B., Hunter, M. D. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2311.2007.00853.x">A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid.</a> Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).</li>
<li>Hartbauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+defense+of+Aphis+nerii+and+Uroleucon+hypochoeridis+%28Homoptera%2C+Aphididae%29+against+natural+enemies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies.</a> PLoS ONE. 5, 10417(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Od dawna wiadomo, że aposematyka A. nerii może dostarczyć wglądu we wzorce i mechanizmy odporności na obronę roślin, a w szczególności sekwestrację chemiczną18,37. W ostatnim czasie pojawiło się wiele zasobów genomicznych dla A. nerii10, oferując nowe możliwości w zakresie ekologicznych i funkcjonalnych badań genomicznych, które wykorzystują A. nerii jako model. Przedstawiamy podstawowe protokoły w hodowli mszyc ...

Mszyce to małe, półmetaboliczne owady, które kolonizują różne rodziny roślin na całym świecie. Wyróżniają się kilkoma cechami, w szczególności złożonymi cyklami życiowymi obejmującymi cykliczną partenogenezę i dyskretne polifenizmy oraz obowiązkowymi symbiozami żywieniowymi z endosymbiontami bakteryjnymi lub drożdżowymi, które dostarczają składników odżywczych, których brakuje w ich diecie soków roślinnych1. Podczas gdy większość mszyc jest specjalistami od roślin żywicielskich, niektóre gatunki ogólne są ważnymi szkodnikami upraw, powodując znaczne szkody ekonomiczne dla upraw, bezpośrednio lub za pośrednictwem patogenów i wirusów, które wektorują2. Publikacja pierwszego genomu mszyc w 2010 r., mszycy grochowej Acyrthosiphon pisum3, stanowiła ważny kamień milowy w badaniach nad biologią mszyc, ponieważ dostarczyła zasobów genomicznych do odpowiedzi na pytania dotyczące adaptacji owadów do roślinożernego stylu życia, w tym tych, które mogą prowadzić do lepszych strategii zwalczania4. Od tego czasu zgromadzono dodatkowe zasoby genomiczne wraz z publikacją opisanego genomu mszycy sojowej Aphis glycines5 oraz publicznie dostępnych zasobów całego genomu dla innego gatunku mszyc trójdzielnych (Myzus cerasi (mszyca czeremchowa), Myzus persicae (mszyca brzoskwiniowo-ziemniaczana), Rhopalosiphum padi (mszyca czeremchowo-owsiana)6. Cenne zasoby transkryptomiczne de novo są również dostępne dla wielu innych gatunków mszyc (np. Aphis gossypii (mszyca bawełniana)7, Sitobion avenae (mszyca zbożowa)8, Cinara pinitabulaeformis (mszyca sosnowa)9, Aphis nerii (mszyca mleczna)10).
Mszyce również wniosły trwały wkład w nasze zrozumienie interakcji między roślinami a owadami oraz ekologii życia na roślinach11. Jednym z obszarów, w którym mszyce wniosły szczególnie ważny wkład, jest nasze zrozumienie ekologii chemicznej interakcji między roślinami żywicielskimi. Owady roślinożerne wykazują różnorodne adaptacje do pokonywania mechanizmów obronnych roślin, a niektóre nawet dokooptowują obronę roślin dla własnej korzyści12,13,14. Na przykład mszyca mleczno-oleandrowa, Aphis nerii, jest jasnożółtą, inwazyjną mszycą występującą w regionach umiarkowanych i tropikalnych na całym świecie, która kolonizuje rośliny z rodziny trojeściowatych (Apocynaceae). Rośliny z rodziny Apocynaceae wyewoluowały różne chemiczne mechanizmy obronne, w tym mleczny lateks i glikozydy nasercowe znane jako kardenolidy, które wiążą nośnik kationów Na,K-ATPazę i są skutecznymi środkami odstraszającymi roślinożerców15,16. Specjaliści od trojeści wyrażają różne sposoby odporności na kardenolidy, a niektórzy selektywnie lub biernie gromadzą lub modyfikują kardenolidy w swoich tkankach jako środek odstraszający drapieżniki lub dla innych korzyści17. Uważa się, że A. nerii sekwestruje kardenolidy w ten sposób, chociaż mechanizmy i korzyści funkcjonalne pozostają niejasne10,18.
Biorąc pod uwagę dostępne zasoby genomiczne, A. nerii dostarcza doskonałego modelu eksperymentalnego do badania molekularnych i genetycznych mechanizmów związanych z interakcjami chemo-ekologicznymi między toksycznymi roślinami żywicielskimi a ich wyspecjalizowanymi roślinożercami. Warto zauważyć, że podczas gdy niektóre z najwcześniejszych badań nad A. nerii koncentrowały się na sekwestracji kardenolidów19, od tego czasu badania A. nerii dostarczyły wglądu w szeroki zestaw pytań ewolucyjnych i ekologicznych, w tym strukturę genetyczną owadów inwazyjnych20 oraz wzajemne oddziaływanie między oddolną i odgórną regulacją gęstości roślinożerców21. A. nerii jest zatem dobrym kandydatem jako model eksperymentalny dla szczególnie szerokiego zestawu badań nad interakcjami między owadami a roślinami. Kluczowe znaczenie dla powodzenia każdego badania z udziałem A. nerii ma staranna hodowla populacji mszyc, która obejmuje hodowlę roślin, od których zależą mszyce, a także wydajne generowanie wysokiej jakości danych -omicznych. Naszym celem jest przeprowadzenie czytelnika przez jedno i drugie. Poniżej przedstawiono metody wytwarzania i utrzymywania kultur roślin i mszyc w szklarni i laboratorium, ekstrakcji DNA i RNA, analizy mikrosatelitarnej, składania i adnotacji transkryptomu de novo, analizy różnicowej ekspresji transkryptomu oraz weryfikacji qPCR genów o zróżnicowanej ekspresji. Chociaż metody te są napisane dla A. nerii, ogólne metody hodowli, ekstrakcji i analizy mogą obejmować różne gatunki mszyc.

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard Mieszanka do kiełkowania</td><td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2 "x 4" Okrągły standardowy garnek</td><td>Anderson Pots</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Polimeraza DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>Indeks nadrzędny&reg; III Zestaw do syntezy pierwszej nici</td><td>ThermoFisher Scientific 18080051</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Mszyce są doskonałymi modelami eksperymentalnymi dla różnych zagadnień biologicznych, począwszy od ewolucji symbioz i rozwoju polifenizmów, a skończywszy na pytaniach dotyczących interakcji owadów z ich roślinami żywicielskimi. Zasoby genomiczne są dostępne dla kilku gatunków mszyc, a dzięki postępom w sekwencjonowaniu nowej generacji badania transkryptomiczne są rozszerzane na organizmy niemodelowe, które nie mają genomów. Co więcej, kultury mszyc mogą być zbierane z pola i hodowane w laboratorium w celu wykorzystania w eksperymentach organizmowych i molekularnych, aby wypełnić lukę między badaniami ekologicznymi i genetycznymi. Wreszcie, wiele mszyc może być hodowanych w laboratorium na preferowanych roślinach żywicielskich w nieustannych, partenogennych cyklach życiowych, co pozwala na porównania genotypów rozmnażających się bezpłciowo. Aphis nerii, mszyca mleczno-oleandrowa, stanowi jeden z takich modeli do badania interakcji owadów z toksycznymi roślinami przy użyciu eksperymentów zarówno organizmowych, jak i molekularnych. Przedstawiono i omówiono tutaj metody wytwarzania i utrzymywania kultur roślin i mszyc w szklarni i laboratorium, ekstrakcje DNA i RNA, analizę mikrosatelitarną, składanie i adnotację transkryptomu de novo, analizę różnicową ekspresji transkryptomu oraz weryfikację qPCR genów o zróżnicowanej ekspresji.

Hodowle roślin: Nasiona będą rosły od około dwóch do czterech tygodni, w zależności od pory roku, aż osiągną wielkość umożliwiającą przesadzenie (Rysunek 1A). Przesadzone siewki będą rosły przez kolejne dwa do czterech tygodni, aby osiągnąć rozmiar optymalny dla hodowli mszyc (Rysunek 1B).
Hodowle mszyc: </stron...

Mszyca Aphis nerii kolonizuje dobrze chronione rośliny z rodziny psowatych (Apocyanaceae) i dostarcza licznych możliwości badania interakcji między roślinami a owadami. W tym miejscu przedstawiamy szereg protokołów dotyczących utrzymania kultur roślin i mszyc oraz generowania i analizy danych molekularnych i -omicznych dla A. nerii.

Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Ta metoda opisuje ogólne etapy hodowli mszyc i etapy analizy genetycznej mszyc. Metody te można zastosować do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące ewolucji i ekologii mszyc oraz mechanizmów molekularnych leżących u podstaw biologii mszyc. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją ogólnie stosować do większości gatunków mszyc i wykonywać przy stosunkowo niskich kosztach.Zacznij od wypełnienia standardowej tacki na sadzonki glebą z mieszanką do kiełkowania, uważając, aby gleba sięgała do górnej części studzienek. Kiedy wszystkie studzienki zostaną wypełnione, zrób głęboki na trzy centymetry otwór w glebie każdej studni i umieść jedno ziarno w każdym dołku. Podlewaj komórki, aż gleba pokrywająca nasiona zostanie nasycona i umieść tacę w szklarni z codziennym lub co drugi dzień podlewaniem, aby utrzymać umiarkowany poziom wilgotności gleby.Kiedy sadzonki wyrosną z pierwszego zestawu pełnych liści, wypełnij czterocalowe okrągłe doniczki ziemią doniczkową, do około pięciu centymetrów poniżej ich krawędzi. Stwórz całość w glebie wystarczająco głęboko, aby sięgnęła dna doniczki i delikatnie zgarnij dojrzałe sadzonki ręcznie, aby umieścić je głęboko w otworach w nowych doniczkach. Następnie przykryj sadzonki ziemią i podlewaj sadzonki codziennie lub co drugi dzień, aby utrzymać umiarkowany poziom wilgotności gleby.Gdy rośliny wyrosną z co najmniej trzech do czterech zestawów pełnych liści i osiągną co najmniej dziesięć centymetrów wysokości, ręcznie sprawdź rośliny pod kątem niepożądanych szkodników i użyj pipety do ust, aby ostrożnie przenieść pojedynczą dorosłej mszycę zebraną z pola reprodukcyjnego na liść pierwszej rośliny, aby utworzyć linię izoklonalną. Po przeniesieniu wszystkich mszyc bezpiecznie przykryj rośliny specjalnie wykonaną klatką na kubki i umieść rośliny zaatakowane przez mszyce w komorze o kontrolowanym środowisku. Aby utrzymać populacje stada, użyj pipety doustnej, aby bezpiecznie przenieść jedną do trzech nimf w drugim lub trzecim stadium rozwojowym oraz jedną dorosłą mszycę do nowej rośliny co tydzień.I przykryj każdą roślinę nową klatką na kubki do hodowli, jak pokazano. W celu ekstrakcji DNA z pojedynczej dorosłej mszycy umieść mszycę w pobliżu dna sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej ciekły azot i zmiel mszycę tłuczkiem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy do probówki mikrowirówki i kontynuuj mielenie zmiażdżonej mszycy, aż próbka będzie widocznie rozdrobniona.Umyj tłuczek dodatkowymi 100 mikrolitrami buforu do lizy i inkubuj zmieloną mszycę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pod koniec inkubacji dodać 14 mikrolitrów octanu potasu aemulor do probówki i odwrócić do mieszania. Po 30 minutach na lodzie zbierz resztki komórkowe przez odwirowanie i przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej bez naruszania osadu.Dodaj 200 mikrolitrów zimnego 100-procentowego etanolu klasy cząsteczkowej do supernatantu i odwróć probówkę do wymieszania. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej zebrać wytrącone DNA przez odwirowanie i usunąć etanol za pomocą pipety. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach zimnego 70-procentowego etanolu klasy cząsteczkowej z trzepaniem w celu ponownego przepłukania wirówką.I ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach świeżego, zimnego 100-procentowego etanolu klasy cząsteczkowej. Po trzecim odwirowaniu umieść probówkę poziomo na kawałku bibuły do suszenia na powietrzu przez pięć do dziesięciu minut. I ponownie zawieś osad DNA w 80 mikrolitrach niskiego tris edta.Następnie oznacz ilościowo zawieszone DNA w spektrofotometrze i przechowuj pozostałą próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zmiażdżeniu do pięciu dorosłych mszyc w ciekłym azocie, jak pokazano, przenieść próbkę do dygestorium i dodać 800 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu do probówki z próbką. Homogenizować próbkę za pomocą tłuczka i inkubować homogenat przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 160 mikrolitrów chloroformu do próbki, a następnie wykonaj 15 sekund energicznego wstrząsania ręcznego. Następnie inkubuj próbkę przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej i odwiruj, aby zebrać wyekstrahowane RNA. Aby wytrącić RNA, przenieś fazę wodną do nowej probówki mikrowirówkowej wolnej od RNS bez naruszania fazy pośredniej i dodaj 400 mikrolitrów izopropanolu do RNA.Po dziesięciominutowej inkubacji w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza zebrać wytrącony RNA przez odwirowanie. Następnie przemyj próbkę dwa razy jednym mililitrem 75-procentowego etanolu w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu, do próbki z powolnym wirowaniem i wirowaniem w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń fenolowych. Po drugim praniu, przeważnie susz granulkę na powietrzu przez pięć do dziesięciu minut na sterylnej ławce i rozpuść osad RNA w 30 mikrolitrach ultra czystej wody z delikatnym pipetowaniem przed dziesięcio- do 15-minutową inkubacją w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza.Nasiona potrzebują około dwóch do czterech tygodni, w zależności od pory roku, aby urosnąć wystarczająco duże, aby można je było przesadzić. Przesadzone sadzonki potrzebują kolejnych dwóch do czterech tygodni, aby urosnąć do optymalnego rozmiaru dla hodowli mszyc. Dorosłe osobniki wyróżniają się ciemną udą i mogą być nieuskrzydlone lub uskrzydlone.Rozwijające się poduszki skrzydeł stają się widoczne, gdy nimfy osiągną trzecie stadium rozwojowe. Pojedynczy dorosły osobnik może uzyskać około 100 do 200 nanogramów na mikrolitr DNA i od 150 do 300 nanogramów na mikrolitr RNA. Następnie można obliczyć względną ekspresję genu kandydującego w różnych warunkach leczenia.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby nie zanieczyszczać swoich stad izoklonalnych. Pamiętaj też, że jakość twoich mszyc w dużym stopniu zależy od jakości twoich roślin. Po tej procedurze można przeprowadzić inne techniki ekstrakcji i sekwencjonowania, aby odpowiedzieć na pytanie o mechanizmy molekularne leżące u podstaw biologii mszyc.

maintaining-biological-cultures-measuring-gene-expression-aphis-nerii

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Źródło: Rufián, J. S. i in. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje metodę analizy ekspresji genów u patogennych bakterii roślinnych na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystując fluorescencyjnie oznaczony czynnik transkrypcyjny. Obrazowanie konfokalne ujawnia heterogeniczność ekspresji genów zjadliwości, podkreślając funkcjonalną różnorodność w populacji bakterii klonalnych.

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach z patogenów ekstrahowanych roślinnie

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji Mycobacterium bovis u larw woskowej większej, Galleria mellonella. Bioluminescencyjny szczep Mycobacterium bovis BCG jest wstrzykiwany do hemolimfy larwy w celu wywołania infekcji, a bioluminescencja jest mierzona w określonych odstępach czasu w celu zbadania postępu infekcji.

Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej u larw owadów

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten protokół przedstawia prostą metodę analizy sygnałów wapniowych w roślinach, generowanych przez karmienie owadów pluskwiaków, takich jak mszyce. Arabidopsis thaliana przekształcony za pomocą biosensora wapnia GCaMP3 GFP pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym in vivo z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Rejestrowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych Arabidopsis podczas żerowania owadów za pomocą biosensora fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Przedstawiona metoda tworzy naturalną tkankę roślinną uszkodzoną przez roślinożerców poprzez zastosowanie larw Manduca sexta do oderwanych liści ziemniaka. Tkanka roślinna jest badana pod kątem ekspresji sześciu homologów czynników transkrypcyjnych biorących udział we wczesnych reakcjach na roślinożerność owadów.

Testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym Manduca sexta

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Ten artykuł przedstawia podstawowe metody standaryzacji ważnych czynników, takich jak gęstość, dostępność paszy, źródło nawodnienia i kontrola środowiska dla długoterminowej hodowli laboratoryjnych jadalnego świerszcza, Gryllus bimaculatus.

Utrzymanie laboratoryjnych kultur Gryllus bimaculatus, wszechstronnego modelu prostoskrzydłego do hodowli owadów i fizjologii bezkręgowców

Poznaj metody utrzymywania kultur mszyc i analizy ekspresji genów u Aphis nerii. Protokoły te umożliwiają badanie interakcji roślinowo-owadzich oraz mechanizmów molekularnych biologii mszyc.

Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami (Wideo) | JoVE Journal

Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami

Przeglądaj więcej filmów