Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami
31 sierpnia 2018
Mszyca Aphis nerii kolonizuje dobrze chronione rośliny z rodziny psowatych (Apocyanaceae) i dostarcza licznych możliwości badania interakcji między roślinami a owadami. W tym miejscu przedstawiamy szereg protokołów dotyczących utrzymania kultur roślin i mszyc oraz generowania i analizy danych molekularnych i -omicznych dla A. nerii.
Ta metoda opisuje ogólne etapy hodowli mszyc i etapy analizy genetycznej mszyc. Metody te można zastosować do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące ewolucji i ekologii mszyc oraz mechanizmów molekularnych leżących u podstaw biologii mszyc. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją ogólnie stosować do większości gatunków mszyc i wykonywać przy stosunkowo niskich kosztach.
Zacznij od wypełnienia standardowej tacki na sadzonki glebą z mieszanką do kiełkowania, uważając, aby gleba sięgała do górnej części studzienek. Kiedy wszystkie studzienki zostaną wypełnione, zrób głęboki na trzy centymetry otwór w glebie każdej studni i umieść jedno ziarno w każdym dołku. Podlewaj komórki, aż gleba pokrywająca nasiona zostanie nasycona i umieść tacę w szklarni z codziennym lub co drugi dzień podlewaniem, aby utrzymać umiarkowany poziom wilgotności gleby.
Kiedy sadzonki wyrosną z pierwszego zestawu pełnych liści, wypełnij czterocalowe okrągłe doniczki ziemią doniczkową, do około pięciu centymetrów poniżej ich krawędzi. Stwórz całość w glebie wystarczająco głęboko, aby sięgnęła dna doniczki i delikatnie zgarnij dojrzałe sadzonki ręcznie, aby umieścić je głęboko w otworach w nowych doniczkach. Następnie przykryj sadzonki ziemią i podlewaj sadzonki codziennie lub co drugi dzień, aby utrzymać umiarkowany poziom wilgotności gleby.
Gdy rośliny wyrosną z co najmniej trzech do czterech zestawów pełnych liści i osiągną co najmniej dziesięć centymetrów wysokości, ręcznie sprawdź rośliny pod kątem niepożądanych szkodników i użyj pipety do ust, aby ostrożnie przenieść pojedynczą dorosłej mszycę zebraną z pola reprodukcyjnego na liść pierwszej rośliny, aby utworzyć linię izoklonalną. Po przeniesieniu wszystkich mszyc bezpiecznie przykryj rośliny specjalnie wykonaną klatką na kubki i umieść rośliny zaatakowane przez mszyce w komorze o kontrolowanym środowisku. Aby utrzymać populacje stada, użyj pipety doustnej, aby bezpiecznie przenieść jedną do trzech nimf w drugim lub trzecim stadium rozwojowym oraz jedną dorosłą mszycę do nowej rośliny co tydzień.
I przykryj każdą roślinę nową klatką na kubki do hodowli, jak pokazano. W celu ekstrakcji DNA z pojedynczej dorosłej mszycy umieść mszycę w pobliżu dna sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej ciekły azot i zmiel mszycę tłuczkiem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy do probówki mikrowirówki i kontynuuj mielenie zmiażdżonej mszycy, aż próbka będzie widocznie rozdrobniona.
Umyj tłuczek dodatkowymi 100 mikrolitrami buforu do lizy i inkubuj zmieloną mszycę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pod koniec inkubacji dodać 14 mikrolitrów octanu potasu aemulor do probówki i odwrócić do mieszania. Po 30 minutach na lodzie zbierz resztki komórkowe przez odwirowanie i przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej bez naruszania osadu.
Dodaj 200 mikrolitrów zimnego 100-procentowego etanolu klasy cząsteczkowej do supernatantu i odwróć probówkę do wymieszania. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej zebrać wytrącone DNA przez odwirowanie i usunąć etanol za pomocą pipety. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach zimnego 70-procentowego etanolu klasy cząsteczkowej z trzepaniem w celu ponownego przepłukania wirówką.
I ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach świeżego, zimnego 100-procentowego etanolu klasy cząsteczkowej. Po trzecim odwirowaniu umieść probówkę poziomo na kawałku bibuły do suszenia na powietrzu przez pięć do dziesięciu minut. I ponownie zawieś osad DNA w 80 mikrolitrach niskiego tris edta.
Następnie oznacz ilościowo zawieszone DNA w spektrofotometrze i przechowuj pozostałą próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zmiażdżeniu do pięciu dorosłych mszyc w ciekłym azocie, jak pokazano, przenieść próbkę do dygestorium i dodać 800 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu do probówki z próbką. Homogenizować próbkę za pomocą tłuczka i inkubować homogenat przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj 160 mikrolitrów chloroformu do próbki, a następnie wykonaj 15 sekund energicznego wstrząsania ręcznego. Następnie inkubuj próbkę przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej i odwiruj, aby zebrać wyekstrahowane RNA. Aby wytrącić RNA, przenieś fazę wodną do nowej probówki mikrowirówkowej wolnej od RNS bez naruszania fazy pośredniej i dodaj 400 mikrolitrów izopropanolu do RNA.
Po dziesięciominutowej inkubacji w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza zebrać wytrącony RNA przez odwirowanie. Następnie przemyj próbkę dwa razy jednym mililitrem 75-procentowego etanolu w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu, do próbki z powolnym wirowaniem i wirowaniem w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń fenolowych. Po drugim praniu, przeważnie susz granulkę na powietrzu przez pięć do dziesięciu minut na sterylnej ławce i rozpuść osad RNA w 30 mikrolitrach ultra czystej wody z delikatnym pipetowaniem przed dziesięcio- do 15-minutową inkubacją w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza.
Nasiona potrzebują około dwóch do czterech tygodni, w zależności od pory roku, aby urosnąć wystarczająco duże, aby można je było przesadzić. Przesadzone sadzonki potrzebują kolejnych dwóch do czterech tygodni, aby urosnąć do optymalnego rozmiaru dla hodowli mszyc. Dorosłe osobniki wyróżniają się ciemną udą i mogą być nieuskrzydlone lub uskrzydlone.
Rozwijające się poduszki skrzydeł stają się widoczne, gdy nimfy osiągną trzecie stadium rozwojowe. Pojedynczy dorosły osobnik może uzyskać około 100 do 200 nanogramów na mikrolitr DNA i od 150 do 300 nanogramów na mikrolitr RNA. Następnie można obliczyć względną ekspresję genu kandydującego w różnych warunkach leczenia.
Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby nie zanieczyszczać swoich stad izoklonalnych. Pamiętaj też, że jakość twoich mszyc w dużym stopniu zależy od jakości twoich roślin. Po tej procedurze można przeprowadzić inne techniki ekstrakcji i sekwencjonowania, aby odpowiedzieć na pytanie o mechanizmy molekularne leżące u podstaw biologii mszyc.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Mszyca Aphis nerii kolonizuje silnie broniące się rośliny z rodziny wilczomela (Apocyanaceae), co stwarza możliwości badania interakcji między roślinami a owadami. Niniejszy artykuł przedstawia protokoły hodowli roślin i mszyc, a także generowania i analizowania danych molekularnych dla A. nerii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Interakcje roślina-owad
- Biologia mszyc
- Ekologia i ewolucja
Wstęp
- Aphis nerii jest organizmem modelowym w badaniach nad mszycami.
- Zrozumienie mechanizmów obronnych roślin i adaptacji mszyc jest kluczowe.
- Protokoły mogą zostać dostosowane do różnych gatunków mszyc.
- Niskokosztowe metody zwiększają dostępność dla badaczy.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowych protokołów hodowli mszyc.
- Ułatwienie analiz genetycznych mszyc.
- Zbadanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw biologii mszyc.
Zastosowane metody
- Wypełnianie tacek do siewek podłożem do kiełkowania.
- Sianie nasion i utrzymywanie wilgotności gleby.
- Wykorzystanie warunków szklarniowych dla optymalnego wzrostu.
- Przeprowadzanie analiz genetycznych hodowanych mszyc.
Główne wyniki
- Skuteczne utrzymanie kultur A. nerii.
- Protokoły możliwe do zastosowania u różnych gatunków mszyc.
- Wgląd w role ekologiczne mszyc.
- Podstawa dla przyszłych badań nad biologią mszyc.
Wnioski
- Opisane metody są skuteczne w badaniach nad mszycami.
- Badania te mogą przyczynić się do zrozumienia dynamiki relacji między roślinami a owadami.
- Protokoły można dostosować do szerszych zastosowań w ekologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Solidne utrzymanie kultur Aphis nerii oraz ilościowa analiza ekspresji genów umożliwiają zespołom biofarmaceutycznym badanie molekularnych interakcji między roślinami a owadami w systemach niestandardowych. Protokoły te wspierają wczesne etapy odkrywania, łącząc kontekst ekologiczny z odczytami molekularnymi, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukcji ryzyka mechanistycznego. Podejście to ułatwia tworzenie skalowalnych i powtarzalnych procesów w badaniach translacyjnych nad adaptacją do gospodarza oraz oddziaływaniem genów i środowiska.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji genów w interakcjach roślina-owad w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera minimalizację ryzyka biologicznego poprzez powiązanie fenotypów ekologicznych z mechanizmami molekularnymi.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w organizmach niemodelowych, które nie posiadają genomów referencyjnych.
- Zapewnia platformę do badań porównawczych pomiędzy różnymi genotypami i w różnych warunkach środowiskowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Ustanawia zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych analiz molekularnych.
- Standaryzuje protokoły hodowli i ekstrakcji w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Generuje ilościowe dane dotyczące ekspresji genów na potrzeby optymalizacji analiz i przygotowania do przesiewania.
- Umożliwia wiarygodną ocenę interakcji gen-środowisko w kontrolowanych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia wyniki molekularne z fenotypami istotnymi ekologicznie w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko poprzez integrację danych organizmalnych i molekularnych.
- Zapewnia ramy dla odkrywania biomarkerów w badaniach nad adaptacją roślin do owadów.
- Usprawnia predykcyjne ograniczanie ryzyka w przypadku celów pod wpływem zmiennych środowiskowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje proces od wczesnego etapu odkryć po opracowanie analiz, wspierając identyfikację związków wiodących oraz badania translacyjne w systemach roślinno-owadzie.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych u organizmów niebędących modelami.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki ekspresji genów do analizy porównawczej.
- Analityka: Zapewnia pomiary molekularne i fenotypowe wspierające statystyczną ocenę warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy kontekst ekologiczny z mechanizmami molekularnymi w celu zachowania ciągłości przedklinicznej.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje adaptowalne protokoły dla różnych gatunków mszyc i projektów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy hodowli i ekstrakcji w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez integrację danych ekologicznych i molekularnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów na etapie odkrywania.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli mszyc, ekstrakcji molekularnej oraz ilościowej analizie ekspresji genów.
- Wymaga dostępu do komór klimatycznych, aparatury do biologii molekularnej oraz platform analitycznych.
- Wymaga standaryzacji protokołów między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności eksperymentów.
- Możliwość adaptacji do różnych gatunków mszyc i systemów roślin gospodarzy przy niewielkich modyfikacjach.
- Zależność od jakości materiału roślinnego i stad mszyc w celu zapewnienia wiarygodnych wyników analiz molekularnych.
