5 października 2018
Ten protokół demonstruje kontrolowane zarodkowanie kawitacji w fantomach żelowych, poprzez jednoczesną ekspozycję zarówno na pulsacyjne światło laserowe bliskiej podczerwieni, jak i skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU). Aktywność kawitacyjna może być następnie wykorzystana do poprawy obrazowania i/lub zastosowań terapeutycznych HIFU.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w polu ultradźwięków o wysokiej intensywności, takie jak to, czy można wykorzystać laserową kawitację jądrkową ultradźwięków do prowadzenia, a także do poprawy leczenia raka HIFU. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki połączeniu nanocząstek, HIFU i oświetlenia laserowego, może ona samodzielnie przezwyciężyć ograniczenia każdej z tych modalności. Wyprodukuj fantomy, aby zademonstrować metodę zarodkowania.
Zacznij od zdejonizowanej, odgazowanej wody o temperaturze pokojowej w szklanej zlewce. Ponadto przygotować 40% wagowo roztwór akryloamidu/bis-akryloamidu. Dodaj roztwór do wody, a następnie bufor i nadsiarczan amonu.
Umieść zlewkę w komorze próżniowej umieszczonej na mieszadle magnetycznym. Dodaj do zlewki mieszadło magnetyczne z PTFE o długości 40 milimetrów i mieszaj ze średnią prędkością. Powoli dodawać albuminę surowicy bydlęcej w proszku.
Po zakończeniu zamknij komorę próżniową i uruchom pompę próżniową. Utrzymuj próżnię docelową i kontynuuj mieszanie przez 60 minut. Następnie zwolnij próżnię i kontynuuj pracę z roztworem.
Dodaj nanocząstki do fantomów, które ich wymagają. W przypadku wszystkich fantomów dodaj katalizator. Po pięciu minutach mieszania wlej roztwór do poszczególnych foremek i odczekaj 20 minut.
Jest to przykład fantomu, który jest ustawiany i wyjmowany z formy. Jest gotowy do użycia w eksperymencie. Po ustawieniu fantomów przechowuj wyjęte z formy fantomy w hermetycznym pojemniku.
Aby utworzyć fantom wyrównujący, należy rozpocząć od rozwiązania fantomowego. Umieść zlewkę i mieszadło w komorze próżniowej na mieszadle magnetycznym. Rozpocznij mieszanie ze średnią prędkością i przepompuj komorę do docelowej próżni.
Po pobraniu roztworu wlej 25 mililitrów do formy i dodaj katalizator. Odczekaj 20 minut przed umieszczeniem jednomilimetrowego kulistego metalowego celu w środku fantomu. Następnie wlej kolejne 25 mililitrów roztworu fantomowego do formy.
Dodaj katalizator i odczekaj kolejne 20 minut. Po ustawieniu fantom wyrównujący jest gotowy do użycia lub przechowywania w hermetycznym pojemniku. Przygotuj konfigurację do eksperymentu.
W tym celu należy zaopatrzyć się w akrylowy zbiornik na wodę o pojemności 4,5 litra zdejonizowanej, odgazowanej wody. Na jednym końcu zbiornika umieść tłumik akustyczny. Następnie zwróć uwagę na przetwornik ultradźwiękowy o wysokiej intensywności.
Zamontuj go i jego współosiowy hydrofon szerokopasmowy na trójosiowym stoliku mikrometrycznym. Całkowicie zanurz przetwornik i hydrofon w zbiorniku, aby były skierowane w stronę absorbera. Podłącz przetwornik do obwodu dopasowania impedancji, który pozwoli na sterowanie trzecią harmoniczną.
Obwód ten jest podłączony bezpośrednio do wyjścia wzmacniacza mocy RF, który ma cyfrowy generator funkcyjny jako wejście. Generator funkcyjny jest programowany zdalnie. Po kalibracji uzyskaj fantom wyrównywania, aby kontynuować konfigurację.
Fantom powinien znajdować się w uchwycie wydrukowanym w 3D i być zamontowany na zautomatyzowanym stoliku 3D. Ustaw fantom tak, aby cel magnetyczny znajdował się w przybliżonym piku ogniskowym przetwornika. Teraz podłącz hydrofon bezpośrednio do karty akwizycji danych.
Użyj przetwornika i hydrofonu, aby echolokować impulsowo cel wyrównania. Wyślij trzymikrosekundową, 10-cyklową serię i wyświetl wykryty sygnał w czasie rzeczywistym na komputerze. Dostosuj stopień mikrometryczny przetwornika, aby zmienić czas lotu i amplitudę sygnału.
System jest wyrównywany, gdy czas lotu wynosi 85 mikrosekund, a amplituda sygnału jest maksymalizowana. Następnie podłącz hydrofon szerokopasmowy bezpośrednio do pięciomegahercowego filtra górnoprzepustowego. Wyślij sygnał przez przedwzmacniacz o natężeniu 40 decybeli, a następnie na kartę akwizycji danych.
Teraz skonfiguruj oświetlenie laserowe dla próbki. Zsynchronizuj laser impulsowy o długości fali 532 nm z generatorem funkcyjnym za pomocą cyfrowego generatora impulsów opóźniających TTL. Użyj lasera do pompowania optycznego oscylatora parametrycznego.
Połącz jego wyjście w fantomie z dwumilimetrową wiązką światłowodów. W zbiorniku zamontuj to włókno na stoliku mikrometrycznym. Umieść światłowód przed fantomem pod kątem 45 stopni od osi akustycznej.
Do wyrównania użyj światła widzialnego. Ustaw wiązkę tak, aby cel wyrównania znajdował się w środku 15-milimetrowej plamki laserowej. Na koniec umieść mikroskop cyfrowy i źródło białego światła po przeciwnych stronach zbiornika na wodę.
Zamontuj mikroskop na stoliku mikrometrycznym. Ustaw go tak, aby cel wyrównania był ostry w jego polu view. Upewnij się, że na miejscu znajduje się właściwy fantom.
W takim przypadku odpowiedni fantom tkankowy zastępuje fantom wyrównujący. Dostosuj długość fali lasera do rezonansu plazmonowego powierzchni nanocząstki. W komputerze sterującym ustaw przetwornik tak, aby wytwarzał 10-cyklową serię i ustawiał fluencję lasera.
Celuj w ogniskowy szczyt skoncentrowanego impulsu ultradźwiękowego o wysokiej intensywności na głębokość 10 milimetrów i w 13 unikalnych miejscach w kierunku pionowym w odstępach pięciu milimetrów. Upewnij się, że fantom tkanki jest na swoim miejscu w zbiorniku. Następnie za pomocą oprogramowania ustaw parametry fluencji i ekspozycji na falę ciągłą.
Użyj mikroskopu, aby zarejestrować powstawanie zmian termicznych, ponieważ skoncentrowane ultradźwięki o wysokim natężeniu z wybranym szczytowym podciśnieniem są kierowane w jedno miejsce. Dane te to napięcie detektora w funkcji czasu dla krótkiej, skoncentrowanej ekspozycji na ultradźwięki o wysokiej intensywności dla różnych fantomów w różnych warunkach. W tych zestawach danych fantomy były również wystawione na działanie oświetlenia laserowego.
Jednak jeden fantom nie miał nanoprętów, a jeden fantom miał. W tych zestawach danych oba fantomy miały nanopręty, ale jeden był wystawiony na działanie światła laserowego, a drugi nie. Pokazuje to, że emisje szerokopasmowe są wykrywane tylko wtedy, gdy obecne są nanocząstki, ekspozycja na ultradźwięki i oświetlenie laserowe.
Ten film mikroskopowy przedstawia przykład powstawania zmian termicznych i kawitacyjnych w fantomie żelowym z nanoprętami wystawionymi na działanie zogniskowanych ultradźwięków o wysokiej intensywności i oświetlenia laserowego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o noszeniu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej podczas obchodzenia się z chemikaliami i upewnieniu się, że podczas korzystania z lasera stosowana jest odpowiednia ochrona oczu. Po opracowaniu, technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się terapią ultradźwiękową o wysokiej intensywności do zbadania możliwości wykorzystania nanocząstek ukierunkowanych molekularnie do poprawy leczenia raka poprzez ukierunkowane i szybkie ablacje termiczne.
Niniejszy protokół demonstruje kontrolowaną nukleację kawitacji w fantomach żelowych poprzez jednoczesną ekspozycję na impulsowe światło laserowe w bliskiej podczerwieni oraz wysoko intensywne ultradźwięki skupione (HIFU). Metoda ta może usprawnić obrazowanie oraz zastosowania terapeutyczne HIFU, szczególnie w leczeniu nowotworów.
Niniejsza metoda rozwiązuje kluczowy problem w terapii nowotworów opartej na HIFU: osiągnięcie precyzyjnego, zlokalizowanego dostarczania energii przy jednoczesnym pokonaniu ograniczeń wynikających ze stosowania wyłącznie ultradźwięków lub laserów. Poprzez umożliwienie kontrolowanego zarodkowania kawitacji za pomocą plazmonicznych nanocząsteczek złota, podejście to zwiększa zarówno precyzję obrazowania prowadzącego, jak i skuteczność ablacji termicznej. Ta strategia dwumodalna zwiększa pewność przewidywania zaangażowania celu oraz pozwala na redukcję ryzyka mechanistycznego w translacyjnych procesach onkologicznych.
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w przypadku terapii wymagających precyzyjnej spatiotemporalnej kontroli dostarczania energii.