Name: Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę drop-off ddPCR do wykrywania mutacji w ctDNA z próbek krwi. Technika umożliwia jednoczesną analizę wielu zmian genetycznych w obszarach hotspotów, oszczędzając cenny materiał pacjenta i zwiększając przepustowość badań diagnostycznych onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Institut Curie SiRIC (grant INCa- DGOS-4654). Autorzy pragną również podziękować Caroline Hego za jej wkład w powstanie filmu.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Kilku autorów jest nazwanych wynalazcami dwóch zgłoszeń patentowych (EP17305920.5, EP18305277.8) związanych z wykrywaniem ctDNA.

Aby zaprojektować skuteczny test ddPCR typu drop-off, optymalizacja ma kluczowe znaczenie i należy uważnie przestrzegać protokołu. Każda kombinacja starterów i sond ma unikalną skuteczność reakcji PCR. W związku z tym indywidualny test musi zostać dokładnie zwalidowany na próbkach kontrolnych, zanim zostanie użyty na cennych próbkach testowych. Optymalizacja i walidacja są ważne dla certyfikacji wykrywania sygnału szczytowego oraz oceny swoistości i czułości. Jak opisano w protokole, wszystkie mutacje zlokalizowane w reg...

Zgłoszono tysiące mutacji somatycznych związanych z rozwojem raka1. Wśród nich kilka to predykcyjne markery skuteczności terapii celowanej 2,3, a genetyczne badania przesiewowe tych mutacji są obecnie rutynową praktyką kliniczną. Technologia kropelkowego cyfrowego PCR (ddPCR) może być używana do monitorowania obecności lub braku mutacji z wysoką dokładnością wykrywania i jest wysoce kompatybilna z nieinwazyjnymi płynnymi biopsjami4,5. Jednak obecne testy ddPCR są przede wszystkim przeznaczone do wykrywania mutacji znanych a priori. To poważnie ogranicza stosowanie ddPCR jako narzędzia do odkrywania, gdy mutacja jest nieznana. Rzeczywiście, w konwencjonalnym projekcie ddPCR, sonda hydrolizy rozpoznająca allel typu dzikiego (sonda WT) konkuruje ze specyficzną sondą rozpoznającą zmutowany allel (sonda MUT) (<silna klasa = "xfig">Figura 1A). Sonda o wyższym powinowactwie hybrydyzuje z matrycą i uwalnia swój fluorofor, wskazując na charakter odpowiedniego allelu. Dane fluorescencyjne uzyskane dla każdej kropli można zwizualizować na wykresie punktowym reprezentującym fluorescencję emitowaną przez sondy WT i MUT w różnych wymiarach. Schematyczne przedstawienie typowego wyniku konwencjonalnego testu ddPCR przedstawiono w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. W tym przykładzie niebieska chmura odpowiada kropelkom zawierającym allele WT zidentyfikowane przez sondę WT, podczas gdy czerwona chmura odpowiada kropelkom, w których allel MUT został amplifikowany i zidentyfikowany przez sondę MUT. W zależności od ilości DNA załadowanego w reakcji mogą pojawić się podwójnie dodatnie kropelki zawierające zarówno amplikony WT, jak i MUT (zielona chmura). Jasnoszara chmura odpowiada pustym kropelkom.
Ponieważ większość platform pozwala na wykrycie ograniczonej liczby fluoroforów (zwykle 2, ale do 5), przepustowość konwencjonalnego ddPCR jest ograniczona. W związku z tym celowanie w regiony z wieloma sąsiadującymi mutacjami wymaga zaprojektowania technicznie trudnych testów multipleksowych ddPCR lub zastosowania wielu reakcji ukierunkowanych równolegle na każdą mutację. Strategia drop-off ddPCR pokonuje to ograniczenie, ponieważ może potencjalnie wykryć wszelkie zmiany genetyczne w regionie docelowym za pomocą unikalnej pary sond hydrolizy WT. Pierwsza sonda (Sonda 1) obejmuje sekwencję niezmienną, przylegającą do obszaru docelowego, a druga sonda (Sonda 2) jest komplementarna do sekwencji WT regionu docelowego, w którym spodziewane są mutacje (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Podczas gdy pierwsza sonda określa ilościowo całkowitą ilość amplifikowalnych cząsteczek w reakcji, druga sonda rozróżnia allele WT i MUT przez nieoptymalną hybrydyzację do zmutowanych sekwencji. Sonda 2 może zidentyfikować wiele typów mutacji w regionie docelowym (substytucje pojedynczych lub wielokrotnych nukleotydów, delecja itp.)6. Podobnie jak w przypadku konwencjonalnego ddPCR, jasnoszara chmura odpowiada kropelkom niezawierającym cząsteczek DNA. Należy przypomnieć, że w tego typu testach optymalna separacja chmur WT i MUT zależy od ilości DNA załadowanego w reakcji, ponieważ kropelek zawierających zarówno allele docelowe WT, jak i MUT nie można odróżnić od kropel zawierających tylko formę WT. Dlatego ten test wymaga, aby większość kropel zawierała nie więcej niż jedną kopię docelowego genu.

<table><tbody><tr><td>Probówka K2EDTA (kod koloru: lawenda)</td><td>Probówki BD</td><td>367863</td><td>EDTA służą do uzyskania próbki krwi pełnej lub osocza EDTA</td></tr><tr><td>Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp (protokół ręczny)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Do izolacji swobodnie krążącego DNA z ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Krążące DNA (protokół automatyczny)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Do izolacji swobodnie krążącego DNA z ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>System QIAsymphony SP</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>w pełni zintegrowany i zautomatyzowany system do oczyszczania cfDNA, DNA lub RNA</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Do jednoczesnego oczyszczania do 24 cfDNA</td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Fluorometr kubitowy to fluorometr stacjonarny do ilościowego oznaczania DNA</td></tr><tr><td>QX100 lub czytnik QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 lub 186-4003, odpowiednio:</td><td>Czytnik mierzy intensywność fluorescencji każdej kropli i wykrywa rozmiar i kształt, gdy kropelki przechodzą przez detektor</td></tr><tr><td>Generator kropel QX100 lub QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 lub 186-4002, odpowiednio,</td><td>Przyrząd używany do generowania kropel</td></tr><tr><td>Termocykler C1000</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Modułowa platforma termocyklera, zawiera obudowę termocyklera C1000 Touch, 96-dołkowy moduł szybkiej reakcji</td></tr><tr><td>Zgrzewarka do płyt</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&handel; Zgrzewarka do płytek</td></tr><tr><td>PCR Uchwyt na kartridże DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Ustawia i utrzymuje wkład DG8 w przyrządzie do wytwarzania kropel</td></tr><tr><td>Wkłady i uszczelki generatora kropel</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Wkład mikroprzepływowy DG8 służy do mieszania próbki i oleju w celu wytworzenia kropel; Uszczelki DG8 uszczelniają wkład, aby zapobiec parowaniu i wywierają ciśnienie wymagane do tworzenia kropel</td></tr><tr><td>PCR supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR supermix do sond (bez dUTP)</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96-dołkowe płytki półspódniczkowe</td></tr><tr><td>Uszczelka foliowa</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Folia przebijalna zgrzewana</td></tr><tr><td>ddPCR Czytnik kropel Oil</td><td>Bio-Rad</td><td>Olej 186-3004</td><td>używany w odczyt</td></tr><tr><td>Olej do generowania kropel do sond</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>olej do generowania kropelek</td></tr><tr><td>Probówka DNA loBind 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Probówki Eppendorf LoBind maksymalizują odzysk próbki poprzez znaczne ograniczenie wiązania próbki z powierzchnią</td></tr><tr><td>Zestaw wzorcowy Multiplex I cfDNA</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Wzorce referencyjne cfDNA Multiplex I są wysoce scharakteryzowanymi, biologicznie istotnymi materiałami referencyjnymi używanymi do oceny wydajności testów cfDNA, które wykrywają mutacje somatyczne</td></tr><tr><td>ZESTAW TESTOWY QUBIT DSDNA HS, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Test HS jest wysoce selektywny dla dwuniciowego DNA (dsDNA) nad RNA i został zaprojektowany tak, aby był dokładny dla początkowych stężeń próbki od 10 pg / &micro; L do 100 ng/&mikro; L</td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Probówki do testów kubitowych mają 500 i mikro; L cienkościenne rurki polipropylenowe do użytku z fluorometrem Qubit</td></tr></tbody></table>

cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej (ddPCR) to bardzo czuła metoda ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oparta na frakcjonowaniu próbki na tysiące nanowymiarowych indywidualnych reakcji typu woda w oleju. Ostatnio ddPCR stał się jednym z najdokładniejszych i najbardziej czułych narzędzi do wykrywania krążącego DNA nowotworu (ctDNA). Jednym z głównych ograniczeń standardowej techniki ddPCR jest ograniczona liczba mutacji, które można przebadać na reakcję, ponieważ wymagane są specyficzne sondy hydrolizy rozpoznające każdą możliwą wersję alleli. Alternatywna metodologia, ddPCR typu drop-off, zwiększa przepustowość, ponieważ wymaga tylko jednej pary sond do wykrycia i ilościowego określenia potencjalnie wszystkich zmian genetycznych w regionie docelowym. Drop-off ddPCR wykazuje porównywalną czułość do konwencjonalnych testów ddPCR, z tą zaletą, że wykrywa większą liczbę mutacji w jednej reakcji. Jest opłacalny, pozwala zachować cenny materiał próbki, a także może być używany jako narzędzie do odkrywania, gdy mutacje nie są znane a priori.

W badaniu koncepcyjnym, z wykorzystaniem strategii drop-off ddPCR, zbadano mutacje w eksonie 2 genu KRAS (kodony 12 i 13) oraz delecje w eksonie 19 genu EGFR w tkankach FFPE oraz próbkach osocza pobranych od pacjentów z nowotworami6.
Sonda typu drop-off dla KRAS badała region o długości 16 bp obejmujący liczne mutacje w eksonie 2 genu KRAS , w którym znajduje się ponad...

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Metoda ta może być stosowana jako narzędzie diagnostyczne raka do analizy krążącego DNA guza. Technika ta bada wiele zmian genetycznych w regionach mutacji klastrowych w jednej reakcji. Pomaga to w oszczędzaniu cennych próbek pacjentów.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat obciążenia guza jego profilem mutacji. Teraz można go również zastosować do analizy molekularnej jako alternatywę dla qPCR w celu uzyskania bezwzględnej kwantyfikacji docelowych sekwencji kwasów nukleinowych. Zbierz próbki krwi do siedmiomililitrowych probówek EDTA.Do zebrania około czterech mililitrów osocza zaleca się użycie dwóch probówek. Odwiruj próbki krwi przez 10 minut przy 820-krotności grawitacji w ciągu trzech godzin od pobrania krwi, aby oddzielić czerwone krwinki, białe krwinki i osocze. Czas między pobraniem próbki a odwirowaniem ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości DNA wolnego od limfocytów T, niezanieczyszczonego DNA uwolnionym z białych krwinek.Po odwirowaniu należy użyć pipety serologicznej do zebrania supernatantu bez dotykania warstwy białych krwinek. Zwykle odzyskuje się około dwóch mililitrów osocza na probówkę EDTA. Po przeniesieniu plazm do dwóch mililitrowych probó

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

Ten film pokazuje użyteczność cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów w próbkach DNA. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na komory, które działają jako niezależne reakcje PCR, a wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych ze amplifikowanych celów w komorach służy do obliczenia częstotliwości wariantu allelu w próbce.

Cyfrowy PCR oparty na chip-in-a-tube do ilościowego oznaczania wariantów pojedynczych nukleotydów

Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Ten artykuł przedstawia zastosowanie metody wykrywania niskiej częstotliwości opartej na sekwencjonowaniu Sangera w chłoniaku angioimmunoblastycznym. Zapewnij podstawę do zastosowania tej metody do innych chorób.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera w celu wykrycia mutacji somatycznej o niskiej częstotliwości

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Poznaj metodę drop-off ddPCR do wykrywania mutacji w ctDNA z próbek krwi. Technika umożliwia jednoczesną analizę wielu zmian genetycznych w obszarach hotspotów, oszczędzając cenny materiał pacjenta i zwiększając przepustowość badań diagnostycznych onkologicznych.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów (Wideo) | JoVE Journal

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Przeglądaj więcej filmów