Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Metoda ta może być stosowana jako narzędzie diagnostyczne raka do analizy krążącego DNA guza. Technika ta bada wiele zmian genetycznych w regionach mutacji klastrowych w jednej reakcji. Pomaga to w oszczędzaniu cennych próbek pacjentów.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat obciążenia guza jego profilem mutacji. Teraz można go również zastosować do analizy molekularnej jako alternatywę dla qPCR w celu uzyskania bezwzględnej kwantyfikacji docelowych sekwencji kwasów nukleinowych. Zbierz próbki krwi do siedmiomililitrowych probówek EDTA.

Do zebrania około czterech mililitrów osocza zaleca się użycie dwóch probówek. Odwiruj próbki krwi przez 10 minut przy 820-krotności grawitacji w ciągu trzech godzin od pobrania krwi, aby oddzielić czerwone krwinki, białe krwinki i osocze. Czas między pobraniem próbki a odwirowaniem ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości DNA wolnego od limfocytów T, niezanieczyszczonego DNA uwolnionym z białych krwinek.

Po odwirowaniu należy użyć pipety serologicznej do zebrania supernatantu bez dotykania warstwy białych krwinek. Zwykle odzyskuje się około dwóch mililitrów osocza na probówkę EDTA. Po przeniesieniu plazm do dwóch mililitrowych probówek, odwiruj podwielokrotności podwielokrotności grawitacji 16 000 razy przez 10 minut w temperaturze 15 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek.

Ostrożnie zbierz osocze, nie naruszając osadu i przenieś do dwóch mililitrowych probówek kriogenicznych. Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu, gdy będzie potrzebna. Zacznij od dodania 400 mikrolitrów proteinazy K do 50-mililitrowej probówki.

Następnie dodaj cztery mililitry osocza i 3,2 mililitra buforu do lizy ACL zawierającego jeden mikrogram nośnego RNA z zestawu do ekstrakcji. Zamknij probówkę i mieszaj przez wirowanie przez 30 sekund, aby uzyskać jednorodny roztwór. Następnie inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po inkubacji dodaj 7,2 mililitra buforu ACB do lizatu, aby zoptymalizować wiązanie krążących kwasów nukleinowych z błoną krzemionkową. Mieszaj przez wirowanie przez 15 do 30 sekund. Następnie inkubuj probówkę na lodzie przez pięć minut.

Przymocuj kolumnę i przedłużacz o pojemności 20 mililitrów do pompy próżniowej. Zamknij niewykorzystane części, aby umożliwić zasysanie próżniowe. Po krótkim odwirowaniu probówki, ostrożnie wprowadzić mieszaninę do przedłużacza probówki.

Następnie włącz pompę próżniową i pozwól, aby lizat został całkowicie wciągnięty przez kolumny. Wyjmij i wyrzuć przedłużacz rurki. Następnie nałóż 600 mikrolitrów buforu ACW1 na kolumnę.

Gdy bufor ACW1 zostanie przeciągnięty przez kolumnę, dodaj 750 mikrolitrów buforu ACW2, a na koniec 750 mikrolitrów 96 do 100% etanolu. Następnie umieść kolumnę w czystej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wiruj z pełną prędkością przez trzy minuty, aby wyeliminować etanol. Po umieszczeniu kolumny w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej, otwórz pokrywkę, a następnie inkubuj w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby całkowicie wysuszyć membranę.

Po inkubacji umieścić kolumnę w czystej 1,5 mililitrowej probówce o niskim stopniu wiązania. Ostrożnie nałóż 36 mikrolitrów wody wolnej od RNaz z 0,04% azydkiem sodu. Następnie zamknij pokrywkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.

Ponownie wirować z pełną prędkością przez jedną minutę, aby wymyć kwasy nukleinowe. Następnie przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. Rozpocznij od rozmrożenia i wyrównania składników reakcji do temperatury pokojowej w czystym kapturze PCR.

Następnie przygotuj 20-krotną mieszankę starterów i sond w wodzie destylowanej bez RNazy i Dnazy z każdym starterem o stężeniu 18 mikromolowym i każdą sondą przy stężeniu pięciu mikromolowych. Dla wszystkich indywidualnych reakcji PCR należy przygotować mieszaninę próbek, łącząc 10 mikrolitrów dwukrotnego ddPCR Supermix, jednego mikrolitra 20-krotnego mieszania starterów i sond oraz do 10 nanogramów próbki DNA w 20 mikrolitrach wody destylowanej. Dokładnie zmieszać mieszaninę reakcyjną, aby zapewnić jednorodność.

I krótko odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki przed dozowaniem. Włóż wkład ddPCR do uchwytu i załaduj 20 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej próbki do środkowych dołków wkładu w celu wytworzenia kropel. Dodaj 70 mikrolitrów oleju z generatora kropel do studzienek dennych.

Włóż wkład z uszczelką do generatora kropel. Kropelki będą wytwarzane w górnych dołkach wkładu. Powoli i delikatnie odessać 40 mikrolitrów kropelek z wkładów i dozować do 96-dołkowej płytki PCR.

Uszczelnij końcową płytkę PCR folią aluminiową za pomocą uszczelniacza do płytek natychmiast po przeniesieniu kropel, aby uniknąć parowania. Krótko odwirować płytkę, aby zebrać zawartość na dnie studzienek. Uruchom konwencjonalną amplifikację PCR na termocyklerze.

Po zakończeniu cyklu należy na krótko odwirować płytkę, aby zebrać zawartość na dnie studzienek. Po amplifikacji PCR użyj czytnika kropel, aby policzyć krople dodatnie i ujemne PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane podczas etapów optymalizacji testu ddPCR typu drop-off.

Ten obraz przedstawia wykrywanie zmutowanego DNA i DNA typu dzikiego w reakcji zawierającej 100% zmutowanego DNA, 5% zmutowanego DNA i 100% zmutowanego DNA. Na tym obrazie przedstawiono przykłady próbek osocza analizowanych za pomocą testów ddPCR z kroplowaniem KRAS i EGFR, które wykazały wykrycie pojedynczego nukleotydu i wielokrotnych podstawień w eksonie drugim KRAS oraz delecji w eksonie EGFR 19. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby postępować ostrożnie na każdym kroku, zwracając szczególną uwagę na wytwarzanie kropel, co jest krytycznym krokiem tej metody.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom i klinicystom w dziedzinie badań nad rakiem do optymalizacji analizy mutacji nowotworowych za pomocą płynnej biopsji.