Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Głównym celem tego eksperymentu jest opisanie laparoskopowej procedury transferu zarodków u królika jako modelu. Główną zaletą tej techniki jest to, że działa ona w celu transferu zarodków przy użyciu łatwej, minimalnie inwazyjnej techniki. Co więcej, opisany tutaj skuteczny protokół kriokonserwacji zarodków działa również w celu długoterminowego przechowywania zarodków królików, zapewniając elastyczne czasowo możliwości logistyczne i możliwość transportu próbki.

Jak wiemy, technologie wspomaganego rozrodu są poddawane ciągłej ocenie w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z nimi ryzyka. W związku z tym, przy użyciu obu technik, królik może być wykorzystany jako idealny zwierzęcy model rozrodu człowieka, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak wpływ manipulacji zarodkami in vitro na potomstwo. Wizualna demonstracja tych kwestii ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy transferu zarodków są trudne do nauczenia, ponieważ muszą być wykonane z dużą precyzją, aby zapewnić sukces techniki.

W celu witryfikacji zarodków zanurzyć na dwie minuty w roztworze równoważącym, a następnie jednominutową inkubację w roztworze witryfikacyjnym. Pod koniec inkubacji załaduj zarodki do plastikowej minisłomki o pojemności 125 mikrolitrów i połącz zamknięty koniec minisłomki z odpowiednim mikrodozownikiem o pojemności jednego mililitra. Zassać podłoże bazowe do jednej trzeciej długości słomki, a następnie wprowadzić mały pęcherzyk powietrza.

Następnie użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zaaspirować zarodki w 40 mikrolitrach roztworu witryfikacyjnego, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza i wystarczającą ilość podłoża podstawowego, aby przesunąć pierwszą frakcję płynną do bawełny mini-słomki. Następnie zamknij otwarty koniec mini-słomki korkiem słomkowym, zanurz mini-słomkę bezpośrednio w ciekłym azocie, aby uzyskać witryfikację, i przechowuj mini-słomkę w ciekłym azocie dewara. Aby rozmrozić zarodki do transferu, umieść minisłomkę poziomo 10 centymetrów od pary ciekłego azotu na 20 do 30 sekund.

Gdy proces krystalizacji rozpocznie się wewnątrz mini-słomki, zanurz mini-słomkę w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza na 10 do 15 sekund. Natychmiast wyjmij minisłomkę i bawełniane zatyczki i użyj sprzężonego mikrodozownika, aby usunąć zawartość minisłomki do płytki zawierającej podłoże podstawowe o temperaturze 25 stopni Celsjusza uzupełnione 0,33-molowym roztworem sacharozy, w którym zarodki muszą pozostać przez pięć minut. Następnie przenieś zarodki na płytkę ze świeżą pożywką bazową na kolejną pięciominutową inkubację.

Na tyle dni przed wiekiem zarodków, które mają być przeniesione, należy obserwować jędrność i kolor sromów dostępnych dojrzałych płciowo samic królików w wieku 4,5 miesiąca i wywołać owulację u zwierząt receptywnych za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia domięśniowego jednego mikrograma octanu busereliny, niezależnie od masy ciała. W dniu transferu wypłucz świeże lub rozmrożone zarodki w pożywce o temperaturze 37 stopni Celsjusza pod mikroskopem stereoskopowym i podłącz odpowiednio skonfigurowany cewnik zewnątrzoponowy o rozmiarze 17 do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Odessać jeden centymetr podłoża bazowego do cewnika, a następnie wprowadzić mały pęcherzyk powietrza.

Następnie odessać od pięciu do siedmiu zarodków i 10 mikrolitrów pożywki podstawowej, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza i ostatni centymetr pożywki podstawowej. Po załadowaniu zarodków umieść znieczulonego królika biorcę w klatce na etapie rozgrzewki i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, zgol sierść z brzusznej części brzucha, oczyść obszar operacyjny mydłem glukonianu chlorheksydyny i usuń wszelkie pozostałe włosy.

Przykryj obszar sterylną serwetą z otworem na obszar operacyjny i włóż jeden endoskopowy trokar na pięć centymetrów do jamy brzusznej, dwa centymetry doogonowo do wyrostka zyfoidalnego i użyj mechanicznego insulatatora regulującego ciśnienie, aby nadmuchać jamę otrzewnej. Przełóż kamerę endoskopową przez endoskopowy trokar i włóż igłę zewnątrzoponową o rozmiarze 17 do okolicy pachwinowej, dwa do trzech centymetrów od lejka. Wprowadzić załadowany cewnik przez igłę zewnątrzoponową do jamy brzusznej i wprowadzić jeden do dwóch centymetrów cewnika zewnątrzoponowego przez lejek w bańce.

Delikatnie wciśnij tłok cewnika, aby uwolnić zarodki do jajowodu. Oba pęcherzyki powietrza muszą wydostać się z cewnika. Usuń cewnik zaraz po uwolnieniu zarodków, a następnie odessaj i uwolnij pozostałą pożywkę, aby potwierdzić brak zarodków.

Po potwierdzeniu udanego transferu zarodków należy usunąć igłę zewnątrzoponową i kamerę endoskopową, a następnie uwolnić dwutlenek węgla z jamy brzusznej przez endoskopowy trokar. Oczyścić nacięcie trokaru roztworem chlorheksydyny i zamknąć ranę mikronizowanym aluminiowym opatrunkiem z tworzywa sztucznego. Następnie należy potraktować zwierzę odpowiednimi antybiotykami i środkami przeciwbólowymi i monitorować zwierzę aż do pełnego wyzdrowienia.

Minimalnie inwazyjny laparoskopowy transfer zarodków plasuje królika wśród najlepszych modeli zwierzęcych do badań reprodukcyjnych, z wysokim odsetkiem przenoszonych świeżych zarodków, w wyniku których powstaje młode. Warto zauważyć, że wyższe wartości osiąga się, gdy transfer świeżych zarodków jest wykonywany z zarodkami we wczesnym lub zwartym stadium moruli. Podobne wyniki obserwuje się po wczesnym i zbitym transferze szkliwionej moruli króliczej, szczególnie w przypadku zwartych moruli, co potwierdza skuteczność i niezawodność tej techniki w przenoszeniu świeżych zarodków w szklikle u królików.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak warunkowe technologie wspomagającego rozrodu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób dodanie gęstości może wywołać efekt przeciwbólowy w późniejszym życiu. Po niedawnym rozwoju, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie rozrodu do zbadania tego efektu u ludzi w oparciu o bliski dystans filogenetyczny między królikiem a człowiekiem. W ten sposób technika ta może zapewnić wyniki, które można łatwo przenieść do medycyny klinicznej u ludzi, a także u innych gatunków ssaków.

Nie zapominaj, że nasza metoda oferuje pewne korzyści higieniczne i ekonomiczne, zgodne z koncepcją trzech R: dobrostanu zwierząt, Wymiany, Redukcji i Udoskonalenia, mając na celu poprawę traktowania zwierząt doświadczalnych przez ludzi.