Name: Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj małoinwazyjną laparoskopową transferację zarodków i witryfikację u królików. Ta metoda umożliwia długoterminowe przechowywanie embriogonów i stanowi idealny model do badań nad ludzką reprodukcją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności Hiszpanii (AGL2017-85162-C2-1-R) oraz Programu Badawczego Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Angielska wersja tekstu poprawiona przez N. Macowan English Language Service

Wszystkie procedury eksperymentalne zastosowane w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE EEC dotyczącą eksperymentów na zwierzętach oraz zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Politècnica de València w Hiszpanii (kod badawczy: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC oraz JSV posiadają certyfikaty autoryzacyjne wydane przez administrację rządową Walencji uprawniające do przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach. XGD jest upoważniony do nadzoru in situ nad dobrostanem i opieką nad zwierzętami podczas eksperymentu.
1. Transfer embrionów
<ol>
	<li>Przygotowanie samic biorców
	<ol>
		<li>Należy używać wyłącznie samic dojrzałych płciowo (&gt; 4,5 miesiąca).</li>
		<li>Na tydzień przed ET należy przystosować samice do reżimu 16 h światła/8 h ciemności, aby zainicjować wzrost mieszków płciowych i zwiększyć receptywność samic.</li>
		<li>Należy wybrać samice biorców, obserwując turgor i kolor sromu. Jeśli srom jest turgidny i zaczerwieniony, samica jest receptywna.</li>
		<li>Pseudociążę (owulację) indukuje się pojedynczym wtryśnięciem domięśniowym 1 µg octanu busereliny (syntetycznego analogu hormonu uwalniającego gonadotropiny), niezależnie od masy ciała. 
		UWAGA: Zazwyczaj dawka 0,8 µg jest odpowiednia do indukcji owulacji u królików średniej wielkości (4-5 kg), zatem 1 µg zazwyczaj gwarantuje wystąpienie owulacji.</li>
		<li>Owulację indukuje się z wyprzedzeniem odpowiadającym wiekowi embrionów przeznaczonych do transferu (na przykład 70-72 h przed ET świeżych morul).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie i analgezja
	<ol>
		<li>Należy zważyć królika i nabrać następujące środki znieczulające i przeciwbólowe.
		<ol>
			<li>Do strzykawki 1 mL z igłą 30G: nabrać ksylazynę (5mg/kg) i chlorowodorek buprenorfiny (0,03 mg/kg). Do drugiej strzykawki 1 mL z igłą pericranialis 23G nabrać chlorowodorek ketaminy (35 mg/kg).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Należy unieruchomić królika i wstrzyknąć domięśniowo mieszaninę ksylazyny i buprenorfiny.</li>
		<li>Należy wprowadzić igłę pericranialis z ketaminą do marginalnej żyły usznej, powoli wprowadzając całą zawartość strzykawki dożylnie.</li>
		<li>Należy przymocować igłę i pozostawić ją w miejscu wkłucia podczas pozostałych etapów, aby w razie potrzeby podać dodatkową dawkę znieczulenia.</li>
		<li>Królika należy pozostawić w klatce (czystej i bez innych zwierząt) na ogrzewanej platformie.</li>
		<li>Po utracie przytomności należy zastosować maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu, i sprawdzić brak odruchu powiekowego. 
		UWAGA: Protokół ten zapewnia płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego przez minimum 30 min. Jeśli wymagany jest dłuższy czas, po 30 min należy wstrzyknąć dodatkowe dawki, stosując połowę ilości chlorowodorku ketaminy opisanej w punkcie 1.2.1.</li>
		<li>Głębokość znieczulenia należy monitorować, sprawdzając odruch stóp oraz ruchy oddechowe. Zmiana wzorca oddychania na nieregularny i przyspieszony wskazuje na utratę właściwej płaszczyzny znieczulenia.</li>
		<li>Należy monitorować kolor błon śluzowych (oczy, wargi itp.), częstość oddechów (30-60 oddechów na minutę), częstość akcji serca (120-325 uderzeń na minutę) oraz temperaturę rektalną (38-39,6 °C).</li>
		<li>Na osiem godzin przed transferem należy odstawić pokarm, aby uniknąć zwiększenia rozmiaru i aktywności jelit aż do zakończenia procesu ET. Należy zapewnić swobodny dostęp do wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie embrionów
	<ol>
		<li>Podłoża do manipulacji embrionami należy ogrzać do 25 °C: Podłoże Bazowe (BM), składające się z soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) uzupełnionej o 0,2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej.</li>
		<li>Pracując pod stereomikroskopem, należy przepłukać świeże lub rozmrożone (Krok 2) embriony podłożem BM.</li>
		<li>Używając sterylnych rękawiczek, należy przymocować odpowiednio skonfigurowany cewnik epiduralny 17G do strzykawki 1 mL.</li>
		<li>Do cewnika należy zassać 1 cm BM, a następnie mały pęcherzyk powietrza.</li>
		<li>Należy zassać 5-7 embrionów w objętości 10 µL BM, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza.</li>
		<li>Napełnianie cewnika należy zakończyć poprzez zassanie 1 cm BM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfer embrionów
	<ol>
		<li>W celu zapewnienia środowiska aseptycznego należy rozważyć użycie sterylnych rękawiczek, fartucha i maski.</li>
		<li>Należy wysterylizować instrumenty chirurgiczne, oczyścić powierzchnie, na których będzie wykonywana operacja, i przetrzeć je 70% etanolem.</li>
		<li>Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 1.2), sprawdzając zanik odruchów.</li>
		<li>Sierść z brzusznej części brzucha należy usunąć za pomocą maszynki elektrycznej.</li>
		<li>Brzuszną część brzucha należy przygotować aseptycznie.
		<ol>
			<li>Oczyścić pole operacyjne i usunąć pozostałe włosy. Umyć pole operacyjne mydłem z glukonianem chlorheksydyny. Zdezynfekować obszar roztworem chlorheksydyny i etanolem 96º (3 razy).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zwierzę należy umieścić na ogrzewanym stole chirurgicznym w pozycji Trendelenburga (głowa obniżona o 45°), aby zapewnić przesunięcie żołądka i jelit w kierunku kranialnym. Należy rozważyć opróżnienie pęcherza moczowego, jeśli jest turgidny. Uszkodzenie jakichkolwiek trzewi w tym procesie może doprowadzić do śmierci zwierzęcia. Dlatego ważne jest ich prawidłowe zlokalizowanie (Rycina 1).</li>
		<li>Obszar należy przykryć sterylnym ręcznikiem z otworem (fenestracją) odsłaniającym ogoloną skórę, aby oddzielić miejsce operacyjne od potencjalnych obszarów zanieczyszczonych.</li>
		<li>Wprowadzić trokar endoskopowy na 5 cm do jamy brzusznej, 2 cm caudalnie od wyrostka miecza, i przeprowadzić przez niego insuflację jamy otrzewnej za pomocą mechanicznego insuflatora z regulacją ciśnienia. 
		UWAGA: Ciśnienie wewnątrzbrzuszne powinno wynosić 8-12 mmHg przy użyciu CO2 (Rycina 1A).</li>
		<li>Przez trokar endoskopowy wprowadzić kamerę endoskopową (Rycina 1B). 
		UWAGA: Należy zidentyfikować drogi rodne, określając stan i pozycję infundibulum oraz ampuły przed ET, aby ułatwić kolejne kroki.</li>
		<li>Wprowadzić igłę epiduralną 17-G w okolice pachwinowe w odległości 2-3 cm od infundibulum (Rycina 1B).</li>
		<li>Zidentyfikować wejście do infundibulum (Rycina 2A, 2B).</li>
		<li>Wprowadzić napełniony cewnik (krok 1.3) przez igłę epiduralną do jamy brzusznej (Rycina 1C).</li>
		<li>Zlokalizować jajowód i wprowadzić 1-2 cm cewnika epiduralnego przez infundibulum do ampuły (Rycina 2A-2C). Nie należy wprowadzać cewnika zbyt głęboko do jajowodu, aby zapobiec uszkodzeniom i krwawieniu.</li>
		<li>Uwolnić embriony do jajowodu, delikatnie naciskając tłok strzykawki połączonej z cewnikiem (Rycina 2D-2F). Oba pęcherzyki powietrza muszą opuścić cewnik.</li>
		<li>Cewnik należy usunąć bezpośrednio po uwolnieniu embrionów.</li>
		<li>Przepłukać cewnik, zasysając i wypuszczając podłoże manipulacyjne, aby sprawdzić brak embrionów i potwierdzić ich pomyślny transfer.</li>
		<li>W razie potrzeby powtórzyć kroki 1.4.11 do 1.4.16 po drugiej stronie macicy.</li>
		<li>Usunąć igłę epiduralną i kamerę endoskopową.</li>
		<li>Usunąć CO2 przez trokar endoskopowy. Jeśli w brzuchu zwierzęcia pozostanie nadmiar gazu, spowoduje to ból i dyskomfort.</li>
		<li>Usunąć trokar endoskopowy z jamy brzusznej. Zdjąć ręcznik chirurgiczny.</li>
		<li>Przerwać znieczulenie.</li>
		<li>Oczyścić nacięcie wykonane trokarem roztworem chlorheksydyny. Zamknąć nacięcie wykonane trokarem za pomocą zmikronizowanego aluminium i opatrunku plastikowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opieka pooperacyjna
	<ol>
		<li>Leczyć zwierzęta antybiotykami: enrofloksacyna 10 mg/kg, podskórnie, co 24 h przez 5 dni.</li>
		<li>Podawać leki przeciwbólowe: chlorowodorek buprenorfiny (0,03 mg/kg) domięśniowo co 12 godzin przez 3 dni; meloksykam (0,2 mg/kg) podskórnie co 24 h przez 3 dni.</li>
		<li>Monitorować zwierzęta przez co najmniej 30 min po operacji (zależnie od zwierzęcia i zastosowanej dawki znieczulenia), upewniając się, że odzyskały stan fizjologiczny.</li>
		<li>Zidentyfikować biorcę (np. tatuaż w uchu) i umieścić zwierzęta indywidualnie w czystej klatce w odpowiednich warunkach środowiskowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Chirurgiczny zabieg endoskopowy u królika; sekwencja znieczulenia, wprowadzenia narzędzi i iniekcji próbki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Laparoskopowy transfer embrionów wspomagany laparoskopią (widok zewnętrzny). A) Wprowadzenie trokaru endoskopowego (jeden port). B) Wprowadzenie kamery endoskopowej i igły do znieczulenia zewnątrzoponowego (czarna strzałka). C) Wprowadzenie cewnika do transferu embrionów (biała strzałka) przez igłę do znieczulenia zewnątrzoponowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Seria obrazów laparoskopowych przedstawiająca cewniki jajnikowe i jajowód w badaniu rozrodczym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Transfer embrionów wspomagany laparoskopią (widok wewnętrzny). A: Wprowadzenie cewnika przez igłę do znieczulenia zewnątrzoponowego do obszaru brzusznego. Gwiazdka wskazuje lejek jajowodu. B, C, D: Cewnik z załadowanymi embrionami jest wprowadzany do części rozpierastej jajowodu przez lejek. E, F: Uwolnienie embrionów, potwierdzone wizualizacją obrzękniętego jajowodu. Rysunek został opracowany na podstawie pracy Marco-Jiménez et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Witryfikacja i rozmrażanie zarodków
<ol>
	<li>Wszystkie manipulacje należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (około 22 °C), aby zmniejszyć toksyczność roztworu witryfikacyjnego w wyższych temperaturach. 
	UWAGA: W tym protokole do przenoszenia embrionów można używać automatycznej pipety 0,1-2 µL, ale odpowiednie mogą być również inne podobne urządzenia do przenoszenia embrionów z minimalną objętością cieczy.</li>
	<li>Przeprowadź witryfikację embrionów w dwuetapowej procedurze dodawania:
	<ol>
		<li>Umieść embriony na 2 minuty w roztworze równoważącym składającym się z 10% (v/v) glikolu etylenowego i 10% (v/v) dimetylosulfotlenku rozpuszczonych w BM.</li>
		<li>Przenieś embriony (z kroku 2.2.1) na 1 minutę do roztworu witryfikacyjnego składającego się z 20% (v/v) glikolu etylenowego i 20% (v/v) dimetylosulfotlenku rozpuszczonych w BM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj embriony do plastikowego ministraw o pojemności 125 µL (który posiada jeden zamknięty koniec z bawełnianym czopkiem i jeden otwarty koniec). Proces ten przedstawiono schematycznie na Rysunku 3.
	<ol>
		<li>Połącz zamknięty koniec ministraw 0,125 μL z odpowiednim mikrodozownikiem (np. Captroll III®).</li>
		<li>Zaspiruj BM do 1/3 długości słomki, a następnie mały pęcherzyk powietrza.</li>
		<li>Zaspiruj embriony w objętości 40 µL roztworu witryfikacyjnego, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza.</li>
		<li>Zaspiruj BM, aż pierwsza frakcja cieczy (krok 2.3.2) dotrze do bawełny.</li>
		<li>Zamknij otwarty koniec korkiem do słomek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krok 2.2.2 należy wykonać równolegle z krokiem 2.3, aby upewnić się, że nie upłynęła więcej niż jedna minuta, co byłoby toksyczne dla embrionów.</li>
	<li>Zanurz ministraw bezpośrednio w ciekłym azocie, aby przeprowadzić witryfikację.</li>
	<li>Przechowuj ministraw w naczyniu Dewar z azotem przez wymagany czas.</li>
	<li>Odmroź embriony w jednym etapie.
	<ol>
		<li>Umieść ministraw poziomo w odległości 10 cm od oparów ciekłego azotu na 20-30 s.</li>
		<li>Gdy wewnątrz ministraw rozpocznie się proces krystalizacji, zanurz ministraw w kąpieli wodnej o temperaturze 25 °C na 10-15 s.</li>
		<li>Usuń korek z ministraw i odetnij bawełniany czopek.</li>
		<li>Za pomocą podłączonego mikrodozownika wypchnij całą zawartość ministraw na płytkę zawierającą 0,33 M roztwór sacharozy w BM o temperaturze 25 °C na 5 minut. 
		UWAGA: Ten krok musi zostać wykonany szybko, aby ograniczyć ekspozycję embrionów na roztwór witryfikacyjny.</li>
		<li>Przenieś embriony na nową płytkę zawierającą roztwór BM na kolejne 5 min.</li>
		<li>Do dalszego procesu ET należy wybrać wyłącznie embriony nieuszkodzone (z nienaruszoną warstwą mucyny i strefą przejrzystą). 
		UWAGA: Należy wziąć pod uwagę, że w przypadku embrionów rozmrożonych, transfery asynchroniczne (np. 60-62 h w transferach morul) mogą poprawić wyniki, umożliwiając resynchronizację między embrionem a błoną śluzową macicy matki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ identyfikacji próbek embrionów; schemat i zbliżenie procesu przygotowania słomki z przerwami powietrznymi i zatyczkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat prawidłowo załadowanej słomki. A) BM odnosi się do pożywki do manipulacji embrionami stosowanej podczas witryfikacji. Embriony muszą być załadowane w roztworze do witryfikacji. B) Wygląd makroskopowy załadowanej słomki z powiększeniem szczegółu pozycji embrionu. To urządzenie o dużej objętości pozwala na witryfikację dużej liczby embrionów, w przeciwieństwie do urządzeń o minimalnej objętości. Ponadto obsługa tego urządzenia jest łatwiejsza w porównaniu z urządzeniami o minimalnej objętości, podczas gdy wyniki u królików są podobne41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Od czasu pierwszego udokumentowanego przypadku urodzenia żywego z przeniesionych zarodków9 technika ta i gatunki królików stały się kluczowe w badaniach nad reprodukcją. Poza tym badania nad embrionami obejmujące manipulację, produkcję, krioprezerwację itp. wymagają jako ostatniego kroku oceny zdolności zarodka do uzyskania zdrowego, donoszonego potomstwa. W związku z tym niezbędna jest technika transferu zarodków13,28. Z biegiem ...

W celu uniknięcia ludzkiej bezpłodności lub poprawy rozpowszechniania zwierząt gospodarskich o wysokiej wartości genetycznej i zachowania zasobów genetycznych zwierząt, opracowano zestaw technik zbiorczo określanych jako technologie wspomaganego rozrodu, takich jak superowulacja, zapłodnienie in vitro, hodowla zarodków lub kriokonserwacja1,2. Obecnie stosuje się leczenie hormonalne w celu stymulacji jajników i wytworzenia dużej liczby pęcherzyków jajnikowych antralnych1. Oocyty pobrane z tych pęcherzyków mogą być dojrzałe, zapłodnione i rozwijane in vitro, dopóki nie zostaną albo kriokonserwowane, albo przeniesione do matek zastępczych3. Jednak podczas tych zabiegów gamety i zygoty są narażone na szereg procesów niefizjologicznych, które mogą wymagać adaptacji zarodka do przetrwania w tych warunkach4,5. Ta adaptacja jest możliwa dzięki wczesnej plastyczności zarodka, która umożliwia zarodkowi zmiany w ekspresji genów i programowaniu rozwojowym6. Jednak modyfikacje te mogą wpływać na kolejne etapy rozwoju zarodka aż do dorosłości, a obecnie powszechnie przyjmuje się, że metody, czas, procedura kriokonserwacji lub warunki hodowli wykazują różne wyniki dotyczące losu zarodka7,8. Dlatego, aby wyjaśnić specyficzne efekty indukowane ART, nieuniknione jest użycie dobrze scharakteryzowanych modeli zwierzęcych.
Pierwsze udokumentowane żywe narodziny wynikające z transferu zarodków ssaków miały miejsce w 1890 roku9. Obecnie transfer zarodka (ET) do surogatki jest kluczowym krokiem w badaniu efektów wywołanych przez ART podczas preimplantacji na kolejne etapy rozwoju zarodka10. Techniki ET zależą od wielkości i budowy anatomicznej każdego zwierzęcia. W przypadku dużych modeli zwierzęcych możliwe było wykonanie ET za pomocą przezszyjkowych niechirurgicznych technik ET, ale u mniejszych gatunków cewnikowanie szyjki macicy jest bardziej skomplikowane i często stosuje się techniki chirurgiczne11. Jednak chirurgiczne ET może powodować krwotok, który może upośledzać implantację i rozwój zarodka, ponieważ krew może zaatakować światło macicy, powodując śmierć zarodka10. Niechirurgiczne techniki transszyjkowe ET są nadal stosowane u ludzi, pawianów, bydła, świń i myszy12,13,14,15,16,17, ale chirurgiczne ET są nadal stosowane u gatunków takich jak kozy, owce lub inne zwierzęta, które stwarzają dodatkowe trudności10,18,19,20,21, takie jak króliki (dwie niezależne szyjki macicy) lub myszy (mały rozmiar). Niemniej jednak metody transferu chirurgicznego są stopniowo zastępowane mniej inwazyjnymi metodami. Endoskopia była używana do transferu zarodków, na przykład u królików, świń i małych przeżuwaczy18,19,20. Te minimalnie inwazyjne metody endoskopowe mogą być stosowane do przenoszenia zarodków do bańki za pośrednictwem lejka, co jest niezbędne u królików i wykazało korzystne działanie u niektórych gatunków20. Opiera się to na znaczeniu prawidłowego dialogu między zarodkiem a matką we wczesnych stadiach zarodka w jajowodzie. Jak wspomniano powyżej, przebudowa zarodka, która ma miejsce u królików podczas migracji zarodka przez jajowód, jest niezbędna do uzyskania zarodków zdolnych do zagnieżdżenia się22,23.
Większe modele zwierzęce, takie jak bydło, są interesujące, ponieważ cechy biochemiczne i preimplantacyjne są podobne do tych u gatunków ludzkich24. Jednak duże zwierzęta są zbyt drogie, aby wykorzystać je we wstępnych próbach, a gryzonie są uważane za idealny model (76% organizmów modelowych to gryzonie) do badań laboratoryjnych25. Niemniej jednak model królika zapewnia pewne przewagi nad gryzoniami w badaniach reprodukcyjnych, ponieważ niektóre procesy biologiczne reprodukcyjne wykazywane przez ludzi są bardziej podobne u królików niż u myszy. U ludzi i królików występuje podobna chronologiczna aktywacja genomu embrionalnego, gastrulacja i struktura łożyska krwiochorowego. Ponadto, korzystając z królików, można poznać dokładny czas zapłodnienia i etapów ciąży ze względu na ich indukowaną owulację25. Cykle życiowe królika są krótkie, ciąża kończy się w 31 dni i osiąga dojrzałość płciową po około 4-5 miesiącach; Zwierzę jest łatwe w obsłudze ze względu na potulne i nieagresywne zachowanie, a jego utrzymanie jest bardzo ekonomiczne w porównaniu z wydatkami na większe zwierzęta. Ponadto należy wspomnieć, że króliki mają dupleksową macicę z dwiema niezależnymi szyjkami macicy11,25. Stawia to królika w uprzywilejowanej pozycji, ponieważ zarodki z różnych grup doświadczalnych mogą zostać przeniesione do tego samego zwierzęcia, ale do innego rogu macicy. Pozwala nam to porównać oba efekty eksperymentalne, redukując czynnik matczyny do wyników.
Dzisiaj, niechirurgiczne metody ET nie są stosowane u królików. Niektóre badania przeprowadzone pod koniec lat 90. przy użyciu techniki przezszyjkowej ET skutkowały niskimi wskaźnikami porodów od 5,5% do 20,0%11,26 w porównaniu z 50-65% metodami chirurgicznymi, w tym procedura laparoskopii opisana przez Besenfeldera i Brem18. Niskie wskaźniki powodzenia tych niechirurgicznych metod ET u królików zbiegają się z brakiem niezbędnej przebudowy zarodka w jajowodzie, której unika się w przezszyjkowym ET. W tym miejscu opisujemy skuteczną małoinwazyjną laparoskopową procedurę ET z wykorzystaniem królików jako organizmu modelowego. Technika ta stanowi model dla dalszych badań reprodukcyjnych na dużych zwierzętach i ludziach.
Ponieważ króliki mają szczególnie wąskie okno czasowe na implantację zarodka, ET u tego gatunku wymaga wysokiego stopnia synchronizacji między etapem rozwoju zarodka w ET a fizjologicznym statusem biorcy27. W niektórych przypadkach po leczeniu reprodukcyjnym, które spowalnia rozwój zarodka (takie jak hodowla in vitro) lub zmienia receptywność endometrium (takie jak leczenie superowulacyjne), nie ma synchronizacji między zarodkiem a macicą matki. Takie sytuacje mogą negatywnie wpłynąć na wynik. Aby odpowiedzieć w tych kontekstach, opisujemy skuteczny protokół witryfikacji moruli króliczej, który pozwala nam wstrzymać, uporządkować i wznowić eksperymenty. Proces ten jest logistycznie pożądany w badaniach reprodukcyjnych i daje nam możliwość długoterminowego przechowywania zarodków, umożliwiając ich transport. Procedura laparoskopowa i strategie kriokonserwacji pozwalają na lepsze planowanie badań z mniejszą liczbą zwierząt. W związku z tym nasza metodologia oferuje korzyści higieniczne i ekonomiczne oraz jest zgodna z koncepcją 3R (zastępstwo, redukcja i udoskonalenie) badań na zwierzętach z określonym celem, jakim jest poprawa traktowania zwierząt doświadczalnych przez ludzi. Tak więc, dzięki tym metodom, króliki stanowią idealny organizm modelowy do testów reprodukcyjnych in vivo.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek buprenorfiny</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>626</td><td>Na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Buserelin Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>Mydło diglukonianu klorheksydyny</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>Diglukonian klorheksydyny, roztwór Alvet</td><td>Escart&iacute;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Air Liquide</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Fisher</td><td>15385194</td><td></td></tr><tr><td>naukowy Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387509</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>Bez chlorku wapnia.</td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do golenia</td><td>Oster Golden A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>Kamera endoskopowa</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>Trokar endoskopowy z silikonowym zaworem ulotkowym</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>30114GK</td><td>Lekki model trokara.</td></tr><tr><td>Enrofloksacyna</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993046</td><td>Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Igła epicranealna 23G</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>514056353</td><td>Można również używać mniejszych igieł.</td></tr><tr><td>Cewnik zewnątrzoponowy</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Igła zewnątrzoponowa</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>184</td><td>Na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Aparatura laparoskopowa</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>26003 AA</td><td>Hopkins&reg; Laparoskop, laparoskop prosty 0&ordm;-mm, długość 30 cm, kanał roboczy 5 mm.</td></tr><tr><td>Źródło światła</td>: <td>Optomic Spain S.A</td>, <td>Fibrolux 250</td><td></td></tr>, <tr><td>Liquid Azot</td>, <td>Air Liquide</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>Mechaniczny infiltrator CO2</td>, <td>Karl Storz, Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>Endoflator&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993501</td><td>Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>szalki Petriego, 35 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Opatrunek plastikowy (Nobecutan)</td><td>IBOR medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>Słomka plastikowa 0,25 ml</td><td>IMV - technologie</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodku powidonu</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Sprawdzi się każde zwykłe małe proste nożyczki ze stali chirurgicznej.</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa do insulatora</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td></td><td></td>20400040</tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>Istnieją tańsze opcje, takie jak Leica MZ8 lub Nikon SMZ-10 lub SMZ-2B, żeby wymienić tylko kilka.</td></tr><tr><td>Sterylne rękawice</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny fartuch</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td></td><td></td>12261501</tr><tr><td>Sterylna maska</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>Słomka</td><td>IMV - technologie</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 1 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>11750425</td> Strzykawka, 5 ml Fisher scientific 11773313 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cewnik moczowy</td><td>IMV - technologie</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>525225</td><td>Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Króliki</td><td>Universitat Polit&egrave; cnica de Val&egrave; </td><td>ncia Linia A</td><td>Można stosować inne linie matczyne, takie jak linia V lub linia HP.</td></tr></tbody></table>

małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs), takie jak hodowla zarodków in vitro czy kriokonserwacja zarodków, wpływają na naturalne wzorce rozwoju, co prowadzi do skutków okołoporodowych i pourodzeniowych. Aby zapewnić nieszkodliwość aplikacji ART, konieczne są badania na modelach zwierzęcych. Ponadto, jako ostatni krok, badania nad rozwojem zarodków wymagają oceny ich zdolności do rozwoju donoszonego, zdrowego potomstwa. W tym przypadku transfer zarodka do macicy jest niezbędny do przeprowadzenia każdego eksperymentu związanego z ARTs.
Królik był używany jako organizm modelowy do badania rozmnażania ssaków przez ponad sto lat. Oprócz filogenetycznej bliskości gatunku ludzkiego oraz niewielkich rozmiarów i niskich kosztów utrzymania, ma ważne cechy reprodukcyjne, takie jak indukowana owulacja, chronologia wczesnego rozwoju embrionalnego podobna do ludzkiej i krótka ciąża, które pozwalają nam łatwo badać konsekwencje stosowania ART. Co więcej, ART (takie jak docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika, hodowla zarodków lub kriokonserwacja) są stosowane z odpowiednią skutecznością u tego gatunku.
Korzystając z techniki laparoskopowego transferu zarodków i protokołu kriokonserwacji przedstawionego w tym artykule, opisujemy 1) jak przenieść zarodki za pomocą łatwej, minimalnie inwazyjnej techniki oraz 2) skuteczny protokół długoterminowego przechowywania zarodków królika, aby zapewnić elastyczne czasowo możliwości logistyczne i możliwość transportu próbki. Wyniki uzyskane po transferze zarodków królików na różnych etapach rozwoju wskazują, że morula jest idealnym etapem do regeneracji i transferu zarodków królików. W związku z tym wymagany jest transfer zarodków do jajowodów, co uzasadnia zabieg chirurgiczny. Ponadto morule królicze są z powodzeniem witryfikowane i przenoszone laparoskopowo, co dowodzi skuteczności opisanych technik.

Mało inwazyjny laparoskopowy transfer świeżych lub witryfikowanych zarodków sprawia, że królik jest jednym z najlepszych zwierząt modelowych do badań nad rozrodczością. Tabela 1 przedstawia wyniki transferu zarodków (ET) w różnych stadiach rozwoju (Rysunek 4). Współczynnik przeżywalności przy urodzeniu (procent zarodków, z których rozwinęły się młode) potwierdził skuteczność opisanej w niniejszej pracy techniki laparoskopowej. Wyższe wartości...

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Głównym celem tego eksperymentu jest opisanie laparoskopowej procedury transferu zarodków u królika jako modelu. Główną zaletą tej techniki jest to, że działa ona w celu transferu zarodków przy użyciu łatwej, minimalnie inwazyjnej techniki. Co więcej, opisany tutaj skuteczny protokół kriokonserwacji zarodków działa również w celu długoterminowego przechowywania zarodków królików, zapewniając elastyczne czasowo możliwości logistyczne i możliwość transportu próbki.Jak wiemy, technologie wspomaganego rozrodu są poddawane ciągłej ocenie w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z nimi ryzyka. W związku z tym, przy użyciu obu technik, królik może być wykorzystany jako idealny zwierzęcy model rozrodu człowieka, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak wpływ manipulacji zarodkami in vitro na potomstwo. Wizualna demonstracja tych kwestii ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy transferu zarodków są trudne do nauczenia, ponieważ muszą być wykonane z dużą precyzją, aby zapewnić sukces techniki.W celu witryfikacji zarodków zanurzyć na dwie minuty w roztworze równoważącym, a następnie jednominutową inkubację w roztworze witryfikacyjnym. Pod koniec inkubacji załaduj zarodki do plastikowej minisłomki o pojemności 125 mikrolitrów i połącz zamknięty koniec minisłomki z odpowiednim mikrodozownikiem o pojemności jednego mililitra. Zassać podłoże bazowe do jednej trzeciej długości słomki, a następnie wprowadzić mały pęcherzyk powietrza.Następnie użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zaaspirować zarodki w 40 mikrolitrach roztworu witryfikacyjnego, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza i wystarczającą ilość podłoża podstawowego, aby przesunąć pierwszą frakcję płynną do bawełny mini-słomki. Następnie zamknij otwarty koniec mini-słomki korkiem słomkowym, zanurz mini-słomkę bezpośrednio w ciekłym azocie, aby uzyskać witryfikację, i przechowuj mini-słomkę w ciekłym azocie dewara. Aby rozmrozić zarodki do transferu, umieść minisłomkę poziomo 10 centymetrów od pary ciekłego azotu na 20 do 30 sekund.Gdy proces krystalizacji rozpocznie się wewnątrz mini-słomki, zanurz mini-słomkę w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza na 10 do 15 sekund. Natychmiast wyjmij minisłomkę i bawełniane zatyczki i użyj sprzężonego mikrodozownika, aby usunąć zawartość minisłomki do płytki zawierającej podłoże podstawowe o temperaturze 25 stopni Celsjusza uzupełnione 0,33-molowym roztworem sacharozy, w którym zarodki muszą pozostać przez pięć minut. Następnie przenieś zarodki na płytkę ze świeżą pożywką bazową na kolejną pięciominutową inkubację.Na tyle dni przed wiekiem zarodków, które mają być przeniesione, należy obserwować jędrność i kolor sromów dostępnych dojrzałych płciowo samic królików w wieku 4,5 miesiąca i wywołać owulację u zwierząt receptywnych za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia domięśniowego jednego mikrograma octanu busereliny, niezależnie od masy ciała. W dniu transferu wypłucz świeże lub rozmrożone zarodki w pożywce o temperaturze 37 stopni Celsjusza pod mikroskopem stereoskopowym i podłącz odpowiednio skonfigurowany cewnik zewnątrzoponowy o rozmiarze 17 do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Odessać jeden centymetr podłoża bazowego do cewnika, a następnie wprowadzić mały pęcherzyk powietrza.Następnie odessać od pięciu do siedmiu zarodków i 10 mikrolitrów pożywki podstawowej, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza i ostatni centymetr pożywki podstawowej. Po załadowaniu zarodków umieść znieczulonego królika biorcę w klatce na etapie rozgrzewki i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, zgol sierść z brzusznej części brzucha, oczyść obszar operacyjny mydłem glukonianu chlorheksydyny i usuń wszelkie pozostałe włosy.Przykryj obszar sterylną serwetą z otworem na obszar operacyjny i włóż jeden endoskopowy trokar na pięć centymetrów do jamy brzusznej, dwa centymetry doogonowo do wyrostka zyfoidalnego i użyj mechanicznego insulatatora regulującego ciśnienie, aby nadmuchać jamę otrzewnej. Przełóż kamerę endoskopową przez endoskopowy trokar i włóż igłę zewnątrzoponową o rozmiarze 17 do okolicy pachwinowej, dwa do trzech centymetrów od lejka. Wprowadzić załadowany cewnik przez igłę zewnątrzoponową do jamy brzusznej i wprowadzić jeden do dwóch centymetrów cewnika zewnątrzoponowego przez lejek w bańce.Delikatnie wciśnij tłok cewnika, aby uwolnić zarodki do jajowodu. Oba pęcherzyki powietrza muszą wydostać się z cewnika. Usuń cewnik zaraz po uwolnieniu zarodków, a następnie odessaj i uwolnij pozostałą pożywkę, aby potwierdzić brak zarodków.Po potwierdzeniu udanego transferu zarodków należy usunąć igłę zewnątrzoponową i kamerę endoskopową, a następnie uwolnić dwutlenek węgla z jamy brzusznej przez endoskopowy trokar. Oczyścić nacięcie trokaru roztworem chlorheksydyny i zamknąć ranę mikronizowanym aluminiowym opatrunkiem z tworzywa sztucznego. Następnie należy potraktować zwierzę odpowiednimi antybiotykami i środkami przeciwbólowymi i monitorować zwierzę aż do pełnego wyzdrowienia.Minimalnie inwazyjny laparoskopowy transfer zarodków plasuje królika wśród najlepszych modeli zwierzęcych do badań reprodukcyjnych, z wysokim odsetkiem przenoszonych świeżych zarodków, w wyniku których powstaje młode. Warto zauważyć, że wyższe wartości osiąga się, gdy transfer świeżych zarodków jest wykonywany z zarodkami we wczesnym lub zwartym stadium moruli. Podobne wyniki obserwuje się po wczesnym i zbitym transferze szkliwionej moruli króliczej, szczególnie w przypadku zwartych moruli, co potwierdza skuteczność i niezawodność tej techniki w przenoszeniu świeżych zarodków w szklikle u królików.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak warunkowe technologie wspomagającego rozrodu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób dodanie gęstości może wywołać efekt przeciwbólowy w późniejszym życiu. Po niedawnym rozwoju, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie rozrodu do zbadania tego efektu u ludzi w oparciu o bliski dystans filogenetyczny między królikiem a człowiekiem. W ten sposób technika ta może zapewnić wyniki, które można łatwo przenieść do medycyny klinicznej u ludzi, a także u innych gatunków ssaków.Nie zapominaj, że nasza metoda oferuje pewne korzyści higieniczne i ekonomiczne, zgodne z koncepcją trzech R: dobrostanu zwierząt, Wymiany, Redukcji i Udoskonalenia, mając na celu poprawę traktowania zwierząt doświadczalnych przez ludzi.

minimally-invasive-embryo-transfer-embryo-vitrification-at-optimal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę witryfikacji zarodków myszy opartą na glikolu etylenowym. Jest ona korzystniejsza od innych metod ze względu na prostotę i niską toksyczność dla zarodków, dzięki czemu może znaleźć szerokie zastosowanie u wielu szczepów myszy, w tym u myszy inbredowych i modyfikowanych genetycznie.

Kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego

W tym filmie opisujemy procedurę witryfikacji pobranych zarodków królika na pożądanym etapie rozwoju przy użyciu glikolu etylenowego i dimetylosulfotlenku jako krioprotektantów oraz słomy kriogenicznej jako systemu nośnego. Zarodki zeszklone mają wysoki wskaźnik przeżywalności i mogą być przechowywane przez dłuższy czas do momentu wykorzystania.

Witryfikacja zarodków królików za pomocą słomki kriogenicznej: ultraszybka technika chłodzenia w celu zachowania zarodków królika do długotrwałego przechowywania

Ten film pokazuje procedurę rozmrażania zeszklonych zarodków królika oraz kroki zapobiegawcze dla optymalnego odzyskiwania zarodków.

Rozmrażanie zarodków królików: procedura rozgrzewająca w celu odzyskania kriokonserwowanych zarodków królików do transferu zarodków

Ten film opisuje technikę transferu zarodków do jajowodu samicy biorcy za pomocą laparoskopii. Umożliwia przebudowę zarodka u królików podczas jego migracji przez jajowód, ostatecznie pomagając w udanej implantacji. Technika ta może być również stosowana w przypadku przechowywanych zarodków z dobrą wydajnością.

Transfer zarodka do królika: procedura transferu zarodków pod kontrolą laparoskopii do jajowodu owulującego biorcy modelu królika

Niedawny rozwój narzędzi do celowania w geny umożliwia produkcję królików nokautujących (KO). W niniejszej pracy wygenerowaliśmy pięć królików Apolipoproteiny (Apo) C-III KO przy użyciu nukleaz palca cynkowego (ZFN). Prace te wykazały, że ZFN jest wysoce wydajną metodą produkcji królików KO.

Produkcja królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego

Transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako barierę zapobiegającą odpływowi zarodka, który może wystąpić podczas transferu macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są zobowiązani do pozyskania biorców pseudociężarnych do transferu zarodków. Omówiono obie techniki.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Biopsja blastocysty i witryfikacja są niezbędne do skutecznego przeprowadzenia preimplantacyjnych badań genetycznych. Podejście polegające na sekwencyjnym otwieraniu osłonki przejrzystej i pobieraniu 7-8 komórek trofektodermy w 5-7 dniu po inseminacji ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe.

Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.

Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Ten protokół opisuje technikę zarządzania ciążą i żywieniem dla królików przeniesionych na zarodki i genetycznie zmodyfikowanych, mającą na celu zmniejszenie śmiertelności nowonarodzonych królików i zwiększenie efektywności przygotowania królików z edytowanymi genami.

Postępowanie w sprawie ciąży i karmienia królikami przeniesionymi na zarodki i zmodyfikowanymi genetycznie

W tym miejscu przedstawiamy protokół Spatula Montevideo do witryfikacji zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec, składający się z domowej szpatułki i wykorzystujący domowe roztwory. Zarodki są szybko równoważone w dwóch roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane na szpatułkę, zanurzane w ciekłym azocie, a na koniec zamykane słomką o pojemności 0,5 ml.

Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

Poznaj małoinwazyjną laparoskopową transferację zarodków i witryfikację u królików. Ta metoda umożliwia długoterminowe przechowywanie embriogonów i stanowi idealny model do badań nad ludzką reprodukcją.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Przeglądaj więcej filmów