Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii chemicznej, takie jak identyfikacja feromonów. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona nowe związki z funkcją feromonów. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść 15-30 dojrzałych płciowo samców minogów morskich w zbiorniku zasilanym 250 litrami napowietrzonej wody z jeziora Huron, utrzymywanej w temperaturze 16-18 stopni Celsjusza.

Aby wydobyć uzdatnioną wodę przez ekstrakcję do fazy stałej, należy przepuścić ją ze zbiornika przez system pompowania do górnej części kolumny. Woda przepływa przez złoże składające się z dwóch kilogramów umiarkowanie polarnej, polimerowej żywicy jonowymiennej zawartej w szeregu czterech szklanych kolumn o pojemności jednego litra. Następnie usuń rozpuszczalnik organiczny i zbierz ekstrakt przez odparowanie obrotowe przez pięć godzin pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

Aby wyizolować pule frakcji, należy namoczyć żel krzemionkowy w początkowej fazie ruchomej przez 30 minut. Przenieść żel z rozpuszczalnikiem do szklanej kolumny i otworzyć jej zawór, aby umożliwić przejście fazy ruchomej. Następnie dokładnie wymieszaj ekstrakty z żelem krzemionkowym i załaduj je do kolumny chromatografii cieczowej nad złożem żelu krzemionkowego.

Eluuj je z gradientem od 95% chloroformu przez metanol do 100% metanolu, co daje w sumie 2,5 litra, a następnie zbierz eluent w pojedynczych 10-mililitrowych fiolkach. Następnie należy przeprowadzić eksperyment TLC na wstępnie powlekanych płytkach z żelu krzemionkowego, nakładając próbkę na linię startową i zanurzając linię początkową płytki w rozpuszczalniku rozwijającym się w szczelnie zamkniętym szklanym zbiorniku. Po tym, jak rozwijający się rozpuszczalnik dotrze do linii końcowej, wyjmij płytkę ze zbiornika i odczekaj 10 minut, aż rozpuszczalnik odparuje.

Wizualizuj plamy, najpierw w świetle UV o długości 254 nanometrów, a następnie zabarwić płytkę, spryskując ją kwaśnym roztworem metanolu 5% aldehydu aniowego za pomocą rozpylacza chromatograficznego i podgrzewając w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie zagęścić frakcję do postaci pozostałości przez odparowanie rotacyjne pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez około 30 minut. Aby wykonać zapis EOG, należy napełnić elektrody kapilarne i uchwyty elektrod półprzewodnikowych, prefabrykowane z granulkami chlorku srebra i srebra, trójmolowym chlorkiem potasu za pomocą mikropipety.

Następnie włóż elektrody z biegunami do uchwytów elektrod. Następnie przygotuj 100 mililitrów L-argininy od 10 do minus pięciomolowej w wodzie przefiltrowanej węglem drzewnym z 10 do minus dwumolowego roztworu podstawowego L-argininy w wodzie dejonizowanej w kolbie miarowej. Do krzywej stężenie-odpowiedź należy przygotować 10 mililitrów 10-krotnych rozcieńczeń puli frakcji.

Teraz ustaw znieczulonego minoga w stojaku w kształcie litery V i owiń go mokrym ręcznikiem papierowym, aby zapobiec wysuszeniu. Włóż rurkę z recyrkulacyjną, napowietrzoną wodą zawierającą 50 miligramów na litr MS222 do jamy policzkowej. Wyreguluj natężenie przepływu i upewnij się, że woda wydostaje się przez otwory skrzelowe, aby w sposób ciągły nawadniać skrzela.

Przepłukać rurkę doprowadzającą nawaniacz przefiltrowaną wodą i podłączyć ją do zaworu zamontowanego na mikromanipulatorze. Następnie umieść rurkę kapilarną doprowadzającą środek zapachowy do jamy nabłonka węchowego, aby dostarczyć przefiltrowaną wodę do nabłonka węchowego, aby zapobiec wysuszeniu, gdy nie podaje się substancji zapachowych. Następnie zamontuj elektrody rejestrującą i referencyjną na mikromanipulatorach.

Opuść elektrodę referencyjną na zewnętrzną skórę w pobliżu nozdrzy. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego opuść elektrodę rejestrującą tak, aby ledwo dotykała powierzchni nabłonka węchowego. Następnie przenieś absorpcję rurki doprowadzającej nawaniacz z przefiltrowanej wody w tle do 10-to-ujemnego pięciomolowego roztworu L-argininy.

Włącz komputer, wzmacniacz, filtr i digitizer. Korzystając z oprogramowania sterownika zaworu, zaprogramuj procedurę podawania czterosekundowego pojedynczego impulsu nawaniacza, zaznaczając pole T1, ustawiając T na cztery sekundy i zaznaczając pole T2.In oprogramowaniu do akwizycji danych, ustaw tryb akwizycji na szybki oscyloskop. Kliknij ikonę Odtwórz, a następnie kliknij przycisk Start w sterowniku zaworu, aby wyzwolić impuls nawaniania

Rozpocznij rejestrowanie ślepej próby, L-argininy, a następnie substancji zapachowych od niskich do wysokich stężeń, przepłukując dwuminutową przefiltrowaną wodę między aplikacjami. Aby zidentyfikować frakcje aktywne behawioralnie, zaaklimatyzuj dojrzałą płciowo samicę minoga morskiego w klatce wypuszczania w labiryncie przez pięć minut. Wypuścić minoga morskiego i zapisać łączną ilość czasu, jaki minóg spędza w kanale doświadczalnym i kontrolnym, z których każdy zawiera wodę rzeczną, przez 10 minut.

Następnie zastosuj bodziec testowy do losowo przydzielonego kanału eksperymentalnego w pojeździe do kanału kontrolnego za pomocą pomp perystaltycznych ze stałą szybkością 200 mililitrów na minutę przez pięć minut, a następnie zastosuj bodziec testowy w pojeździe na dodatkowe 10 minut i zapisz łączną ilość czasu, jaki minóg spędza w kanałach eksperymentalnych i kontrolnych. W tej procedurze należy dalej oczyścić frakcje aktywne do związków za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość przy użyciu kolumny sephadex LH-20. Przygotować próbkę w 0,5 mililitra początkowej fazy ruchomej, ładując ją do kolumny chloroform-metanol, a następnie kolumny metanolu i wymyć frakcje aktywne, aby uzyskać związek.

Rozpuścić i rozcieńczyć oczyszczony związek w początkowej fazie ruchomej HPLC, aby uzyskać 10-mikrolitrowy roztwór o stężeniu około jednego mikrograma na mililitr. Następnie przenieś roztwór próbki do fiolek HPLC i umieść je w automatycznym próbniku HPLC. Wstrzyknąć próbkę do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania i zarejestrować widma spektrometrii mas spektrometrii jonizacji elektrorozpylania o wysokiej rozdzielczości za pomocą chromatograficznego spektrometru mas.

Całkowicie rozpuść próbkę w wybranych rozpuszczalnikach deuterowanych, tworząc roztwór o stężeniu w zakresie od około 0,1 do 10 miligramów na mililitr. Przenieś roztwór próbki do probówki NMR, aby zarejestrować widma 1D i 2D NMR na 900-megahercowym spektrometrze NMR. Na zdjęciu znajduje się 600-megahercowy spektrometr NMR.

Zidentyfikowano pięć nowych przypuszczalnych feromonów minoga morskiego, a ich strukturę wyjaśniono metodami spektrometrycznymi i spektroskopowymi. Te domniemane feromony były stymulujące nabłonek węchowy dorosłego minoga morskiego i miały niskie progi wykrywalności w zapisach elektroolfaktogramu. W testach behawioralnych labiryntu z dwoma wyborami, owulowane samice minoga morskiego były przyciągane do Petromyzonu A, Petromyzenu A i Petromyzenu B i odpychane od Petromyzonu C. Próbując tej interdyscyplinarnej procedury, ważne jest, aby pamiętać o koordynacji eksperymentów chemicznych i biologicznych w celu przeprowadzenia tego iteracyjnego protokołu.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak krystalografia rentgenowska i reakcje derywatyzacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak stereochemia związków. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się produktami naturalnymi i neuroetologią do zbadania prawdopodobnej biosyntezy i biologicznej funkcji feromonów w organizmach wodnych, takich jak minóg morski. Nie zapominaj, że praca z chloroformem może być bardzo niebezpieczna i podczas pracy z tym odczynnikiem należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w kapturze chemicznym, noszenie rękawic i okularów ochronnych.