Name: Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Odkryj metodę izolacji feromonów minoga morskiego przy użyciu ekstrakcji na fazie stałej i chromatografii. Technika ta pozwala powiązać nowe związki z funkcją feromonową w ekologii chemicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Stacji Biologicznej Hammond Bay U.S. Geological Survey za korzystanie z ich obiektów badawczych oraz personelowi U.S. Fish and Wildlife Service oraz Fisheries and Oceans Canada za dostarczenie minogów morskich. Badania te były wspierane przez granty Komisji Rybołówstwa Wielkich Jezior dla Weiming Li i Ke Li.

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.pherobase.com">http://www.pherobase.com</a> (2009).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+chemical+ecology%3A+Olfactory+proteins+from+the+giant+panda+and+their+interactions+with+putative+pheromones+and+bamboo+volatiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).</li>
<li>Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+chemical+ecology+at+the+service+of+conservation+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reverse chemical ecology at the service of conservation biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).</li>
<li>Carde, R. T., Minks, A. K. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.en.40.010195.003015">Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints.</a> Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).</li>
<li>Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+pheromones+and+their+impact+on+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+ecology%22%5BJournal%5D)">Sex pheromones and their impact on pest management.</a> Journal of chemical ecology. 36, (2010).</li>
<li>Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poison+and+alarm%3A+the+Asian+hornet+Vespa+velutina+uses+sting+venom+volatiles+as+an+alarm+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).</li>
<li>Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowse%2C+P+%22Insect+Pheromones+and+Their+Use+in+Pest+Management%22">Insect Pheromones and Their Use in Pest Management</a>. , Springer Science & Business Media. (2013).</li>
<li>Pizzolon, M., et al. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2435.2009.01608.x">When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success.</a> Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).</li>
<li>Stacey, N., Sorensen, P. <a target="_blank" href="https://experts.umn.edu/en/publications/hormones-in-communication-hormonal-pheromones">Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology</a>. , Elsevier Inc. (2011).</li>
<li>Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1023375931734">Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish.</a> Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).</li>
<li>Stacey, N. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9781118794739.ch3">Hormonally-derived pheromones in teleost fishes.</a> Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).</li>
<li>Kuhlisch, C., Pohnert, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25926134">Metabolomics in chemical ecology.</a> Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).</li>
<li>Prince, E. K., Pohnert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+signals+in+the+noise%3A+metabolomics+in+chemical+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).</li>
<li>Teeter, J. <a target="_blank" href="https://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/f80-254">Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).</li>
<li>Moore, H., Schleen, L. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/f80-227">Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).</li>
<li>Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/F10-169">Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus).</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).</li>
<li>Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/f06-008">A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).</li>
<li>Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347209002346">Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour?</a> Animal Behaviour. 78, (2009).</li>
<li>Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347205002538">Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus.</a> Animal Behaviour. 70, (2005).</li>
<li>Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiefkes%2C+MJ+%22Great+Lakes+Fisheries+Policy+and+Management%22">Great Lakes Fisheries Policy and Management</a>. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Novel+Bile+Alcohols+of+Mature+Male+Sea+Lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+Act+as+Chemical+Cues+for+Conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics.</a> Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).</li>
<li>Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993614000971">Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food.</a> TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).</li>
<li>Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%26%2334%3Bknown+unknowns%26%2334%3B+utilizing+accurate+mass+data+and+ChemSpider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Identification of &#34;known unknowns&#34; utilizing accurate mass data and ChemSpider.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).</li>
<li>Beckonert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling%2C+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine%2C+plasma%2C+serum+and+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2692(2007).</li>
<li>Kaiser, B., Wright, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaiser%2C+B+%22Draft+Bruker+XRF+Spectroscopy+User+Guide%3A+Spectral+Interpretation+and+Sources+of+Interference%22">Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference</a>. , BRUKER. Madison, WI. (2008).</li>
<li>Breitmaier, E., Sinnema, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBreitmaier%2C+E+%22Structure+Elucidation+by+NMR+in+Organic+Chemistry%3A+A+Practical+Guide%22">Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide</a>. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).</li>
<li>Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+absolute+configuration+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The assignment of absolute configuration by NMR.</a> Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+Salt-like+Dienones+Having+a+Novel+Skeleton+or+a+Rare+Substitution+Pattern+Function+as+Chemical+Cues+in+Adult+Sea+Lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Letters%22%5BJournal%5D)">Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey.</a> Organic Letters. , (2017).</li>
<li>Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+natural+products+that+act+as+pheromones+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish.</a> Natural Product Reports. , In press (2018).</li>
<li>Yambe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Kynurenine%2C+an+amino+acid+identified+as+a+sex+pheromone+in+the+urine+of+ovulated+female+masu+salmon%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).</li>
<li>Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+identification%2C+concentration+and+bioactivity+of+%28Z%29-7-dodecen-1-yl+acetate%3A+sex+pheromone+of+the+female+Asian+elephant%2C+Elephas+maximus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus.</a> Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).</li>
<li>Sorensen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+of+new+sulfated+steroids+functions+as+a+migratory+pheromone+in+the+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey.</a> Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).</li>
<li>Hoye, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Details+of+the+structure+determination+of+the+sulfated+steroids+PSDS+and+PADS%3A+New+components+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+migratory+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+organic+chemistry%22%5BJournal%5D)">Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone.</a> The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).</li>
<li>Fine, J. M., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+biological+activity+of+the+multi-component+sea+lamprey+migratory+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone.</a> Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).</li>
<li>De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+receiver+bias+underlying+female+preference+for+a+male+mating+pheromone+in+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).</li>
<li>De Bruyne, M., Baker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+detection+in+insects%3A+volatile+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Odor detection in insects: volatile codes.</a> Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).</li>
<li>Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/304265a0">Separate orientation and releaser components in a sex pheromone.</a> Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).</li>
<li>Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+components+and+active+spaces%3A+what+do+moths+smell+and+where+do+they+smell+it%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it.</a> Science. 237 (4815), 650-652 (1987).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ryby żyją w chemicznym świecie pełnym związków, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi okazało się niezbędne do identyfikacji i scharakteryzowania bioaktywnych cząsteczek, które pośredniczą w wielu interakcjach chemicznych, takich jak te obserwowane u łososia masu31, słoni azjatyckich32 i minogów morskich 33,34,35. Frakcjonowanie s...

Feromony to specyficzne sygnały chemiczne uwalniane przez jednostki, które pomagają im w lokalizowaniu źródeł pożywienia, wykrywaniu drapieżników i pośredniczeniu w interakcjach społecznych przedstawicieli tego samego gatunku1. Komunikacja feromonów u owadów została dobrze zbadana2; Jednak identyfikacja chemiczna i funkcja biologiczna feromonów kręgowców wodnych nie zostały tak szeroko zbadane. Wiedza na temat tożsamości i funkcji uwolnionych feromonów może być wykorzystana do ułatwienia odbudowy zagrożonych gatunków3,4 lub zwalczać gatunki szkodników5,6. Zastosowanie tych technik wymaga wyizolowania i scharakteryzowania bioaktywnych składników feromonów.
Identyfikacja feromonów to dziedzina chemii produktów naturalnych. Postęp w badaniach nad feromonami został częściowo ograniczony ze względu na charakter samych cząsteczek feromonów. Feromony są często niestabilne i uwalniane w małych ilościach, a istnieje tylko kilka technik pobierania próbek, które pozwalają wykryć niewielkie ilości substancji lotnych7,8 lub związków rozpuszczalnych w wodzie9. Podejścia do identyfikacji feromonów obejmują: 1) ukierunkowane badania przesiewowe znanych związków, 2) metabolomikę oraz 3) frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi. Ukierunkowane badania przesiewowe znanych związków testują dostępne na rynku metaboliczne produkty uboczne procesów fizjologicznych, co do których przypuszcza się, że działają jako feromony. Takie podejście jest ograniczające, ponieważ naukowcy mogą testować tylko znane i dostępne związki. Udało się jednak zidentyfikować hormony płciowe u złotych rybek, które działają jak feromony10,11,12. Metabolomika to drugie podejście do identyfikacji feromonów, które rozróżnia potencjalne małocząsteczkowe produkty przemiany materii w systemie biologicznym13. Porównanie profili metabolicznych dwóch grup (tj. ekstraktu aktywnego i nieaktywnego) umożliwia identyfikację potencjalnego profilu metabolicznego, z którego metabolit jest oczyszczany, struktura jest wyjaśniana, a bioaktywność potwierdzana14. Addytywne lub synergistyczne efekty złożonych preparatów określonych mieszanin są bardziej prawdopodobne do wykrycia za pomocą metabolomiki, ponieważ metabolity są rozpatrywane razem, a nie jako seria frakcji13. Implementacja metabolomiki opiera się jednak na dostępności syntetycznych odniesień, ponieważ uzyskane dane nie ułatwiają wyjaśnienia nowych struktur.
Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi to zintegrowane, iteracyjne podejście, które obejmuje dwie dziedziny: chemię i biologię. Podejście to wykorzystuje wyniki fizjologicznych i behawioralnych testów biologicznych do kierowania izolacją i identyfikacją aktywnego związku feromonowego. Surowy ekstrakt jest frakcjonowany pod względem właściwości chemicznych (tj. wielkości cząsteczki, polarności itp.) i badany za pomocą zapisów elektroolfaktogramu (EOG) i/lub w teście biologicznym. Składniki bioaktywne są odsiewane poprzez powtórzenie tych etapów frakcjonowania i EOG i/lub testów biologicznych. Struktury czystych związków aktywnych są wyjaśniane metodami spektrometrycznymi i spektroskopowymi, które dostarczają informacji o masie cząsteczkowej i strukturze w celu wytworzenia matrycy związku, który ma być zsyntetyzowany. Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi może dać różnorodne metabolity i potencjalnie nowe feromony o unikalnych szkieletach chemicznych, których prawdopodobnie nie można przewidzieć na podstawie szlaków biosyntezy.
Tutaj opisujemy protokół frakcjonowania sterowany testami biologicznymi, używany do izolowania i charakteryzowania bioaktywności związków feromonów płciowych samca minoga morskiego. Minóg morski (Petromyzon marinus) jest idealnym modelem kręgowców do badania komunikacji feromonów, ponieważ ryby te w dużym stopniu polegają na wykrywaniu węchowym sygnałów chemicznych, które pośredniczą w ich anadromicznej historii życia składającej się z trzech odrębnych etapów: larw, młodocianych i dorosłych. Larwy minoga morskiego zakopują się w osadach strumieni słodkowodnych, przechodzą drastyczną metamorfozę i przekształcają się w młode osobniki, które migrują do jeziora lub oceanu, gdzie pasożytują na dużych rybach żywicielskich. Po odłączeniu się od ryby-żywiciela dorosłe osobniki migrują z powrotem do strumieni tarłowych, kierując się feromonami wędrownymi uwalnianymi przez larwy zamieszkujące strumienie15,16,17,18,19. Dojrzałe samce wznoszą się na tarliska, uwalniają wieloskładnikowy feromon płciowy, aby zwabić partnerów, z przerwami odbywają tarło przez około tydzień, a następnie umierają15,20. Identyfikacja feromonów minoga morskiego jest ważna, ponieważ modulacja systemu komunikacji feromonów jest jedną z rozważanych opcji kontroli inwazyjnych minogów morskich w Wielkich Jeziorach Laurentyńskich21.

<table><tbody><tr><td>Standardowe kapilary borokrzemianowe Premium o standardowych ściankach z filamentem&nbsp;</td>Elektroda rejestrująca i referencyjna <td>Warner Instruments</td><td>G150F-4</td><td>(OD 1,5 mm, ID 0,86 mm)</td></tr><tr><td>Przyrząd do ściągania pipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>wyciąga elektrody do EOG</td></tr><tr><td>Nóż do szkła z diamentową końcówką</td><td>Ogólna</td><td></td><td>końcówka elektrod do EOG</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>rurka doprowadzająca nawaniacz do EOG</td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody rejestrującej serii E prosty korpus z granulką Ag/AgCl do szklanej kapilary OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>ESP-M15N</td><td>uchwyt elektrody nagrywającej</td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody referencyjnej Seria E z uchwytem z&nbsp; Granulat Ag/AgCl&nbsp; do kapilary szklanej OD 1,5 mm</td><td>Warner</td><td>Instruments E45P-F15NH</td><td>uchwyt elektrody referencyjnej</td></tr><tr><td>1 mm pin</td><td>Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>do mostkowania uchwytów elektrod referencyjnych i rejestrujących</td></tr><tr><td>Pin 2 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>WC2-5</td><td>do mostkowania uchwytów elektrod referencyjnych i rejestrujących</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>stopiony agar do napełniania elektrod</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl do napełniania elektrod i uchwytów elektrod</td></tr><tr><td>Micropipette microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>do napełniania elektrod i uchwytów elektrod</td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>środek nawaniający do kontroli pozytywnej EOG</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>posiada substancje zapachowe do EOG</td></tr><tr><td>Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaine1G</td><td>EOG znieczulenie</td></tr><tr><td>Trietiodek gallaminy</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG paralityczna</td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>do podawania paraliżu</td></tr><tr><td>Igła podskórna 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>do podawania paraliżu</td></tr><tr><td>Zacisk rolkowy</td><td>World Precyzja Instrumenty</td><td>14043-20</td><td>regulują szybkość przepływu środka znieczulającego do ust minoga</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>do przygotowania 0,9% soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Plastikowy stojak w kształcie litery V jako stolik na próbki</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie</td> dotyczy <td>trzyma minoga podczas EOG</td></tr><tr><td>Plastikowe koryto</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>trzyma plastikowy stojak w kształcie litery V podczas EOG</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela - #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>do preparacji EOG</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>do sekcji EOG</td></tr><tr><td>Proste ultra cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>do sekcji EOG, kleszcze Dumont #5SF</td></tr><tr><td>Zakrzywione ultra cienkie kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td> o nauce <td>11370-42</td><td>do preparacji EOG, Moria MC40B</td></tr><tr><td>Nożyczki</td> <td>prosteFine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>do preparacji EOG</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>do preparacji EOG</td></tr><tr><td>Światło oświetlacza</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>do rozwarstwiania EOG</td></tr><tr><td>Rurki z tworzywa sztucznego</td><td>Ogólne</td><td></td><td>do podłączenia układu recyrkulacyjnego EOG i kąpieli wodnych</td></tr><tr><td>Rurki doprowadzające nawaniacz</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>In Zestaw filtrów liniowych i uszczelek</td><td>Firma Lee TCFA1201035A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>do pozycjonowania elektrod i kapilarnej rurki doprowadzającej nawaniacz Magnetyczne</td></tr><tr><td>urządzenia przytrzymujące</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik zaworu</td><td>Arduino</td><td>wykonany na zamówienie</td><td>do sterowania otwieraniem zaworu w celu stymulacji zapachu</td></tr><tr><td>Zawór elektromagnetyczny</td><td>Lee Firma</td><td>LFAA1201618H</td><td>zawór do stymulacji zapachów</td></tr><tr><td>NeuroLog wzmacniacz AC/DC</td><td>Digitimer Sp. z o.o.</td><td>NL106</td><td>do zwiększenia amplitudy sygnału elektrycznego</td></tr><tr><td>NeuroLog DC przedwzmacniacz z głowicą</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>w celu zwiększenia amplitudy sygnału eliktrycznego</td></tr><tr><td>Filtr dolnoprzepustowy 60 Hz</td><td>Digitimer Sp. z o.o.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Komputer Dell (OptiPlex 745) z oprogramowaniem do pozyskiwania danych Axoscope</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope wersja 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>Ekranowanie szumów elektromagnetycznych</td></tr><tr><td>Labirynt</td> do <td>wyboru Wykonane na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>wodoodporna sklejka morska pokryta plastikową wkładką</td></tr><tr><td>Pompa do śmieci</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>napełnia labirynt wodą z pobliskiej rzeki</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna z rurką</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>do usuwania nawaniaczy w labiryncie</td></tr><tr><td>Generator inwerterowy</td><td>Honda</td><td>EU1000i</td><td>zasila pompę perstaltyczną</td></tr><tr><td>Klatka zwalniająca</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>służy do aklimatyzacji minoga w labiryncie</td></tr><tr><td>Siatka</td><td>Ogólna</td><td></td><td>służy do przechowywania wymiarów labiryntu i minimalizowania turbulencji wody za pomocą rolek siatkowych</td></tr><tr><td>Wiadra (5 galonów)</td><td>Ogólny</td><td></td><td>do mieszania substancji zapachowych</td></tr><tr><td>Przepływomierz</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>do pomiaru wyładowania</td></tr><tr><td>Żywica XAD 7 HP Chemiczna</td><td>Dow</td><td>37380-43-1</td><td>do ekstrakcji wody kondycjonowanej&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>do ekstrakcji wody kondycjonowanej&nbsp;</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>do ekstrakcji wody kondycjonowanej&nbsp;</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Koncentrator</td><td>do ekstrakcji kondycjonowanego chloroformu</td></tr><tr><td></td><td>wodnego Sigma</td><td>CX1050</td><td>do izolacji basenów frakcji</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy 70-230 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>do izolacji basenów frakcji</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy 230-400 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>do izolacji basenów frakcji</td></tr><tr><td>Krzemionka wstępnie powlekana żelowe płytki TLC</td><td>Sigma</td><td>99571</td><td>do izolacji basenów frakcji</td></tr><tr><td>aldehyd anżylowy</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>do izolacji pul frakcji</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>do izolacji basenów frakcji</td></tr><tr><td>Żywica Amberlite XAD 7 HP</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>do ekstrakcji wody kondycjonowanej&nbsp;</td></tr><tr><td>4, 2,5 l pojemności szklanych kolumn</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>do ekstrakcji wody kondycjonowanej&nbsp;</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>do ekstrakcji wody kondycjonowanej&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy TQ-S TOF LC (lub równoważny)</td><td>Waters Co.</td><td>Nie dotyczy</td><td>dla wyjaśnienia struktury</td></tr><tr><td>Binarna pompa HPLC</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>do izolacji pul/związków frakcji</td></tr><tr><td>Spektrometr Agilent NMR, 900MHz (lub równoważny)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>do wyjaśnienia struktury</td></tr><tr><td>System suszenia Rotovap</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>do ekstrakcji wody kondycjonowanej&nbsp;</td></tr><tr><td>Lampa UV (254 nm)</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>do chromatografii cienkowarstwowej&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi to iteracyjne podejście, które wykorzystuje wyniki fizjologicznych i behawioralnych testów biologicznych do kierowania izolacją i identyfikacją aktywnego związku feromonowego. Metoda ta doprowadziła do pomyślnego scharakteryzowania sygnałów chemicznych, które funkcjonują jako feromony u wielu gatunków zwierząt. Minogi morskie polegają na węchu do wykrywania feromonów, które pośredniczą w reakcjach behawioralnych lub fizjologicznych. Wykorzystujemy tę wiedzę z zakresu biologii ryb, aby określić funkcje przypuszczalnych feromonów oraz pokierować izolacją i identyfikacją aktywnych składników feromonów. Chromatografia służy do ekstrakcji, zagęszczania i oddzielania związków od kondycjonowanej wody. Zapisy elektroolfaktogramu (EOG) są przeprowadzane w celu określenia, które frakcje wywołują reakcje węchowe. Następnie stosuje się testy behawioralne labiryntu dwuwyboru, aby określić, czy którakolwiek z frakcji zapachowych jest również aktywna behawioralnie i wywołuje preferencje. Metody spektrometryczne i spektroskopowe dostarczają informacji o masie cząsteczkowej i strukturze, które pomagają w wyjaśnieniu struktury. Bioaktywność czystych związków jest potwierdzona za pomocą EOG i testów behawioralnych. Reakcje behawioralne zaobserwowane w labiryncie powinny ostatecznie zostać zweryfikowane w warunkach terenowych, aby potwierdzić ich funkcję w naturalnym otoczeniu strumienia. Te testy biologiczne odgrywają podwójną rolę: 1) kierują procesem frakcjonowania oraz 2) potwierdzają i dalej definiują bioaktywność wyizolowanych składników. W tym miejscu przedstawiamy reprezentatywne wyniki identyfikacji feromonów minoga morskiego, które ilustrują użyteczność podejścia do frakcjonowania sterowanego testami biologicznymi. Identyfikacja feromonów minoga morskiego jest szczególnie ważna, ponieważ modulacja systemu komunikacji feromonów jest jedną z rozważanych opcji zwalczania inwazyjnego minoga morskiego w Wielkich Jeziorach Laurentyńskich. Metodę tę można łatwo zaadaptować do scharakteryzowania komunikacji chemicznej w szerokim zakresie taksonów i rzucić światło na chemiczną ekologię przenoszoną przez wodę.

Schemat podsumowujący kroki opisane w protokole frakcjonowania sterowanego bioassayem przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmuje etapy izolacji oraz charakterystyki struktury, potencji węchowej i aktywności behawioralnej 5 domniemanych feromonów minogi morskiej (Rysunek 2). Wykorzystując dane z spektrometrii mas i NMR (Rysunek 3 oraz Rysunek 4), ustalono struktury pet...

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i charakterystyki struktury, siły węchowej i reakcji behawioralnej domniemanych związków feromonów minogów morskich.

Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii chemicznej, takie jak identyfikacja feromonów. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona nowe związki z funkcją feromonów. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść 15-30 dojrzałych płciowo samców minogów morskich w zbiorniku zasilanym 250 litrami napowietrzonej wody z jeziora Huron, utrzymywanej w temperaturze 16-18 stopni Celsjusza.Aby wydobyć uzdatnioną wodę przez ekstrakcję do fazy stałej, należy przepuścić ją ze zbiornika przez system pompowania do górnej części kolumny. Woda przepływa przez złoże składające się z dwóch kilogramów umiarkowanie polarnej, polimerowej żywicy jonowymiennej zawartej w szeregu czterech szklanych kolumn o pojemności jednego litra. Następnie usuń rozpuszczalnik organiczny i zbierz ekstrakt przez odparowanie obrotowe przez pięć godzin pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Aby wyizolować pule frakcji, należy namoczyć żel krzemionkowy w początkowej fazie ruchomej przez 30 minut. Przenieść żel z rozpuszczalnikiem do szklanej kolumny i otworzyć jej zawór, aby umożliwić przejście fazy ruchomej. Następnie dokładnie wymieszaj ekstrakty z żelem krzemionkowym i

the-identification-sea-lamprey-pheromones-using-bioassay-guided

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

W tym filmie demonstrujemy test pozwalający ustalić obecność fosfolipazy w surowym ekstrakcie z jadu Anthopleura dowii - morskiego ukwiału. Test wykorzystuje technikę dyfuzji żelu agarozowego, w której enzym fosfolipaza dyfunduje i rozkłada fosfolipidy zawarte w pożywce stałej w sposób promienisty.

Test aktywności fosfolipazy: Test dyfuzji żelu w celu określenia aktywności fosfolipazy w surowym ekstrakcie jadu z Anthopleura dowii

Minóg morski traci pęcherzyk żółciowy i drogi żółciowe podczas metamorfozy, procesu podobnego do atrezji dróg żółciowych u ludzi. Nowa metoda fiksacji i klarowania (CLARITY) została zmodyfikowana w celu wizualizacji całego drzewa żółciowego za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Ta metoda stanowi potężne narzędzie do badania zwyrodnienia dróg żółciowych.

Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus)

Ten test biologiczny wykorzystuje model drapieżnej ryby do oceny obecności metabolitów odstraszających od karmienia z organicznych ekstraktów tkanek organizmów morskich w naturalnych stężeniach przy użyciu porównywalnej pod względem odżywczym matrycy pokarmowej.

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

U, lipidy skórne od przedstawicieli tego samego gatunku są kluczowe dla sygnalizacji seksualnej, z potencjalnym zastosowaniem w zarządzaniu gatunkami inwazyjnymi. W tym miejscu opisujemy protokoły ekstrakcji lipidów skóry ze zrzuconej skóry lub całych zwierząt, określania i analizowania całkowitej masy lipidów oraz oddzielania lipidów za pomocą frakcjonowania za pomocą chromatografii kolumnowej.

Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Charakterystyka spektrometryczna mas neuropeptydów dostarcza informacji o sekwencji, kwantyfikacji i lokalizacji. Ten zoptymalizowany przepływ pracy jest przydatny nie tylko w badaniach neuropeptydów, ale także innych endogennych peptydów. Przedstawione tutaj protokoły opisują przygotowanie próbki, akwizycję MS, analizę MS i generowanie bazy danych neuropeptydów za pomocą LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting i obrazowania MALDI-MS.

Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Ten protokół przedstawia w pełni zautomatyzowany przepływ pracy do ekstrakcji geosminy i 2-metyloizoborneolu z wody i bogatych w lipidy tkanek ryb. Metoda pozwala na wczesne wykrycie tych cząsteczek, zanim osiągną one progi zapachowe. Przedstawiono reprezentatywne dane z otoczenia akwakultury.

Ekstrakcja i wykrywanie geosminy i 2-metyloizoborneolu w wodzie i rybach przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i GC-MS

Odkryj metodę izolacji feromonów minoga morskiego przy użyciu ekstrakcji na fazie stałej i chromatografii. Technika ta pozwala powiązać nowe związki z funkcją feromonową w ekologii chemicznej.

Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

Przeglądaj więcej filmów