Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości fikobiliproteiny w Cyanobacterium synechocystis

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie zawartości fikobiliprotein w modelowym cyjanobakterii Synechocystis przy użyciu metody spektrofotometrycznej. Fikobiliproteiny to rozpuszczalne w wodzie kompleksy pigmentowo-białkowe, które reprezentują główne składniki czułków zbierających światło w prokariotycznych sinicach i kilku grupach glonów eukariotycznych. Ponieważ są to główne kompleksy zbierające światło, fikobiliproteiny stanowią jeden z kluczowych czynników decydujących o produktywności glonów i sinic.

Synechocystis to modelowa sinica, która jest stosowana w setkach laboratoriów na całym świecie. Synechocystis zawiera dwie fikobiliproteiny, fikocyjaninę i allofikocyjaninę. Protokół ten opisuje prostą, wydajną i niezawodną metodę ilościowego oznaczania obu fikobiliprotein w tym szczepie pleśni.

Porównaliśmy kilka metod, ekstrakcję fikobiliprotein i spektrofotometryczną kwantyfikację ilościową. Metoda oznaczania ilościowego musi być przetestowana dla każdego szczepu, ponieważ widma absorpcji fikobiliprotein mogą się różnić między różnymi szczepami. Na początku ekstrakcji fikobiliprotein przenieś jeden mililitr kultury cyjanobakterii do probówki z bezpiecznym zamkiem.

Jeżeli użytkownik zdecyduje się na oznaczenie suchej masy próbek, powinien zważyć puste probówki przed pobraniem próbek z hodowli. Upewnij się, że kultura nie jest osadzona. Odwirować komórki w temperaturze 15 000 G w temperaturze laboratoryjnej przez pięć minut.

Ostrożnie wyrzucić supernatant. Pamiętaj, aby nie naruszać pelletu. Umieść próbki w zamrażarce.

W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Jest to konieczne, aby zapobiec degradacji fikobiliprotein. Po zamrożeniu próbek włóż je do liofilizatora.

Po rozpoczęciu liofilizacji sprawdź temperaturę i ciśnienie w liofilizatorze. Temperatura musi być niższa niż 60 stopni Celsjusza, a ciśnienie musi wynosić około jednego hektara Pascala. Liofilizować próbki przez noc.

Po zakończeniu cyklu liofilizacji należy jak najszybciej zamknąć probówki, aby zapobiec ponownemu wchłonięciu wody z powietrza. Dodaj cztery sztuki po dwa mililitrowe szklane koraliki do każdej probówki z próbką. Homogenizować próbki z kulkami szklanymi przez 15 sekund.

Prawidłowo zhomogenizowaną próbkę rozprowadza się na całej wewnętrznej powierzchni probówek z zamkiem bezpiecznym. Po homogenizacji komórek dodać jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do próbek w celu ekstrakcji fikobiliprotein. Optymalne pH PBS wynosi około 7,4.

Mieszać komórki z PBS przez pięć sekund na homogenizatorze. Zapewni to optymalne mieszanie próbek w celu wydajnej ekstrakcji fikobiliprotein. Po wymieszaniu próbki są zielonkawe.

Utrzymuj próbki na lodzie przez 60 minut, aby uzyskać najbardziej efektywną ekstrakcję fikobiliprotein. Po ekstrakcji odwirować próbki w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po odwirowaniu supernatant ma niebiesko-niebieską barwę.

Przed pomiarem spektrofotometrycznym należy skalibrować spektrofotometr przy użyciu PBS jako ślepej próby. Po skalibrowaniu spektrofotometru wyrzucono PBS z jednej spektrofotometru, kuwetę i pipetuje supernatant z wyekstrahowanymi fikobiliproteinami zamiast wyrzuconego buforu. W celu ilościowego oznaczania fikocyjaniny i allofikocyjaniny supernatant z wyekstrahowanymi fikobiliproteinami mierzy się w odległości 615, 652 i 720 nanometrów.

Jak opisano w tekście, w literaturze znanych jest kilka równań do oznaczania ilościowego fikobilisomów. Równanie użyte w tym protokole okazało się najlepiej korelować stężenia fikocyjaniny i allofikocyjaniny jako pigmentów i kropek. Krytycznymi etapami protokołu są homogenizacja i ekstrakcja komórek, które powinny zapewnić zarówno wysoką wydajność, jak i wysoką specyficzność.

Przetestowaliśmy kilka procedur ekstrakcji, takich jak rozbijanie komórek przez sonikację, homogenizacja za pomocą kulek cyrkonu lub zamrażanie połączenia komórkowego. Metoda z tego protokołu zapewniła najwyższy plon fikobilisomów. Ponieważ nawet niewielkie zanieczyszczenie ekstraktu białkowego chlorofilem może prowadzić do przeszacowania zawartości fikobiliprotein, należy unikać ekstrakcji chlorofilu z komórek.

Wykryliśmy chlorofil w surowym ekstrakcie, a następnie zastosowaliśmy sonikację do rozerwania komórek. Wraz z powtarzaniem cykli sonikacji stężenie chlorofilu wzrastało. Czas homogenizacji został zoptymalizowany na 15 sekund.

Homogenizacja zarówno przez pięć sekund, jak i 20 sekund zapewniła nieco niższą wydajność. Dodanie chlorku sodu lub potasu do buforu PBS lub do wody nie zwiększyło efektywności ekstrakcji fikobiliprotein, podobnie jak ekstrakcja w buforze octanu sodu. Czas ekstrakcji fikobiliprotein został zoptymalizowany na 60 minut, ponieważ po 120, a nawet 240 minutach stężenie fikobiliprotein nie zmieniło się znacząco.

Upewnij się, że absorbancja przy 615, 652 i 720 nanometrach mieści się w bliskim zakresie absorbancji spektrofotometru. Spektrofotometr używany w tym protokole pokazuje bliski zakres absorbancji od 0,1 do trzech. Porównaliśmy kilka znanych z literatury równań kwantyfikacji fikobiliprotein metodą spektrofotometryczną.

Równanie Bennetta i Bogorada zapewniło najlepszą rekonstrukcję zarówno zawartości fikocyjaniny, jak i allofikocyjaniny w wzorcach pigmentów o znanych stężeniach białka. Różnice między poszczególnymi równaniami są związane ze zmianami współczynników ekstynkcji fikobiliprotein w danym organizmie. Stosowanie siarczanu streptomycyny nie prowadziło do redukcji chlorofilu A w próbkach, w których zastosowano sonikację lub jej unikano.

Jako dane reprezentatywne określiliśmy zawartość fikobiliprotein w komórkach Synechocystis. Zawartość fikobiliprotein zmniejszyła się pod wpływem zwiększonego światła. Protokół został opracowany w celu zminimalizowania wymagań czasowych i sprzętowych dotyczących pisemnej analizy pigmentu, którą można przeprowadzić w dowolnym standardowym laboratorium naukowym na żywo.

Protokół zawiera również dwa inne etapy, takie jak liofilizacja osadu komórkowego i ekstrakcja białek. Całkowity czas pracy przy oznaczaniu ilościowym fikobilisomów nie jest dłuższy niż dwie godziny.