Name: Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj strategię testowania zgodności biologicznej biomateriałów ortopedycznych do regeneracji kości. Metody in vitro i in vivo pozwalają ocenić skuteczność materiałów i potencjalne reakcje immunologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt badawczy otrzymał dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 263363.

<ol><li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+mechanisms+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Marsell, R., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21489527">The biology of fracture healing.</a> Injury. 42 (6), 551-555 (2011).</li>
<li>Cooper, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+critical+size+in+calvarial+bone+defects%3A+revisiting+the+concept+of+a+critical-size+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).</li>
<li>O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+%26+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Biomaterials & scaffolds for tissue engineering.</a> Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).</li>
<li>Stanovici, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+regeneration+strategies+with+bone+marrow+stromal+cells+in+orthopaedic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery.</a> Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).</li>
<li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+challenges+in+the+in+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+biomaterial+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369702115003788">Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials.</a> Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).</li>
<li>Ono, T., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28647888">Osteoimmunology in bone fracture healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).</li>
<li>Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+fracture+healing%3A+Which+are+the+important+molecules%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules?</a> Injury. 38, S11-S25 (2007).</li>
<li>Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+materials%2C+and+mechanobiology+of+biodegradable+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering.</a> BioMed Research International. 2015, 729076(2015).</li>
<li>Bastian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inflammation+and+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Systemic inflammation and fracture healing.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).</li>
<li>El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+immune+cells+in+bone+healing%3B+what+we+know%2C+do+not+know+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives.</a> Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).</li>
<li>Changi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+and+immunogenicity+of+elastin-like+recombinamer+biomaterials+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).</li>
<li>Laczko, J., Levai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+differential+staining+method+for+semi-thin+sections+of+ossifying+cartilage+and+bone+tissues+embedded+in+epoxy+resin%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin.</a> Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+osteoclasts+put+marks+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase+on+dentin+slices--a+simple+method+for+identifying+polarized+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts.</a> Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).</li>
<li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6, 22585(2016).</li>
<li>Epstein, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+noninstrumented+posterolateral+lumbar+fusions+performed+in+predominantly+geriatric+patients+using+lamina+autograft+and+beta+tricalcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate.</a> Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).</li>
<li>Epstein, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+tricalcium+phosphate%3A+observation+of+use+in+100+posterolateral+lumbar+instrumented+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions.</a> Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).</li>
<li>Kallai, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcomputed+tomography-based+structural+analysis+of+various+bone+tissue+regeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models.</a> Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).</li>
<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li>
<li>Gosain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+in+calvarial+defects%3A+contribution+of+the+dura%2C+the+pericranium%2C+and+the+surrounding+bone+in+adult+versus+infant+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dura+mater+stimulates+human+adipose-derived+stromal+cells+to+undergo+bone+formation+in+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects.</a> Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).</li>
<li>Wang, J., Glimcher, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+matrix-induced+osteogenesis+in+rat+calvarial+bone+defects%3A+II.+Origins+of+bone-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells.</a> Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu pokazujemy multidyscyplinarne podejście do przedklinicznej oceny biokompatybilności reprezentatywnych biomateriałów opracowanych do regeneracji i naprawy kości. Przetestowaliśmy odpowiedzi OB, OC i odpowiedź na gojenie in vivo w krytycznym modelu ubytku kości u myszy, a także odpowiedzi immunologiczne in vitro i in vivo . Naszym celem było pokazanie, jak działają testy oraz podsumowanie danych i wniosków wynikających z badania biomateriałów. Pokazujemy, że nasza strategia generuje...

Naprawa kości to złożony proces, który zaczyna się od powstania krwiaka, stanu zapalnego, tworzenia modzeli, a następnie przebudowy1,2. Jednak potencjał regeneracji kości jest ograniczony do wielkości złamania kości1,3. Na przykład duże złamania kości spowodowane urazem, rakiem lub osteoporozą mogą się nie goić i są określane jako złamania kości bez zrostu. Te zmiany kostne często wymagają leczenia w celu promowania zdrowej fizjologicznej naprawy i regeneracji kości. Obecnie autoprzeszczep i przeszczep allogeniczny jest podejściem z wyboru4 z 2,2 milionami zabiegów wymiany kości rocznie5. Chociaż procedury te mają wysoki wskaźnik sukcesu, mogą wystąpić komplikacje, na przykład ograniczona dostępność kości, infekcja, zachorowalność w miejscu dawczym i odrzucenie4. Poszukuje się nowych alternatyw dla inżynierii tkanki kostnej, aby sprostać tym wyzwaniom.
Projektowanie biomateriałów opartych na naturalnych lub syntetycznych polimerach, bioceramice lub metalach w połączeniu z komórkami i bioaktywnymi cząsteczkami jest na fali wznoszącej6. Nasze obecne rozumienie fizjologicznego gojenia się kości i gojenia w kontekście biomateriałów zależy od wielu czynników, takich jak właściwości mechaniczne oraz wiele czynników lokalnych i ogólnoustrojowych, w tym komórki z miejsca krążenia i złamania7,8,9. Biomateriały do regeneracji kości mają na celu promowanie osteogenności i osteointegracji10 i są idealnie biokompatybilne, biodegradowalne i porowate (sprzyjają migracji komórek, tlenu i składników odżywczych). Muszą być również wystarczająco mocne, aby podeprzeć miejsce złamania w celu złagodzenia bólu. Dodatkowo do zainicjowania procesu gojenia potrzebne są czynniki zapalne. Jeśli jednak biomateriał wywołuje nadmierny stan zapalny i reakcje alergiczne, może to ograniczać lub hamować gojenie się kości11,12. W związku z tym konieczne jest interdyscyplinarne podejście do oceny biomateriałów opracowanych do naprawy kości.
W tym badaniu prezentujemy przedkliniczną ocenę reprezentatywnych materiałów, 1) Pianka Orthovita Vitoss, która jest dostępnym na rynku substytutem przeszczepu kości gąbczastej, składającym się z fosforanu trójwapniowego składającego się z nanometrowych cząstek czystego fosforanu β-triwapniowego (β-TCP) i kolagenu bydlęcego typu 1 (C) (pianka β-TCP/C) oraz 2) krążków β-TCP. W tym miejscu ilustrujemy testowanie biokompatybilności tych biomateriałów za pomocą testów pierwotnego osteoblastów (OB) i osteoklastów (OC), modelu naprawy kości in vivo, oceny immunologicznej obejmującej proliferację limfocytów T in vitro i produkcję cytokin oraz immunogenność i alergenność in vivo, jak wcześniej zgłoszono13.

<table><tbody><tr><td>Biomaterials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-tricalcium phosphate disks (&beta;-TCP, 14 mm)</td><td></td><td></td><td>Krążki spiekano w piecu muflowym w temperaturze 1150 &deg;C. Szczegółowy opis produkcji można znaleźć w Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Próbki naświetlano promieniami UV (15 minut z każdej strony) przed użyciem w hodowlach komórkowych.</td></tr><tr><td>Pianka Orthovita Vitoss (&beta;-TCP/C)</td> <td>Orthovita</td><td>2102-1405</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla osteoblastów myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>ALP bufor do oznaczania (2x) pH 10,4</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 200 mM glicyny, 2 mM chlorku magnezu, 2 mM chlorku w ultraczystej wodzie i dostosuj do pH 10.</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu kości (BGM)</td><td></td><td></td> <td>i alfa-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina/streptomycyna</td></tr><tr><td>Bufor do lizy komórek: Bufor do lizy komórek CyQuant 20x koncentrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>C7027</td><td>Rozcieńczyć skoncentrowany bufor do lizy komórek 20-krotnie w ultraczystej wodzie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania żywotności komórek: Odczynnik do oznaczania żywotności komórek Presto Blue</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>A13261</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV z clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek DC II</td><td>Bio Rad</td><td>5000112</td><td>Zestaw do oznaczania białek DC zawiera odczynnik A, odczynnik B, odczynnik S i BSA dla wzorca odniesienia. Dla odczynnika A' dodać 20 &mikro; L odczynnik S do 1000 &mikro; L odczynnik A.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Filtr sterylny DMSO przed użyciem.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dyspaza II (proteaza obojętna, stopień II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>EnzCheck Zestaw do oznaczania fosfatazy alkalicznej pod kątem aktywności fosfatazy alkalicznej&nbsp;</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>E12020</td><td>EnzCheck Phosphatase Assay Kit zawiera fosforan 6,8-difluoro-4-metylobelokliferylu (DiFMUP), N,N-dimetyloformamid i 6,8-difluoro-7-hydroksy-4-metylokumarynę (DiFMU).&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny neutralny buforowany 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat chlorku heksadecylopiryny (cetylopirydyniowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9002</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MEM alfa medium (&alpha;-MEM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do mineralizacji osteogennej (MM)</td><td></td><td></td><td>&alfa;-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna + 50 &mikro; g/ml kwas askorbinowy + 5 mM &beta;-glicerofosforan</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej (10x)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15400054</td><td>Rozcieńczyć stężony roztwór podstawowy 10-krotnie w 1x PBS.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta: Woda do hodowli komórkowych wolna od pirogenów</td><td>VWR</td><td>L0970-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do płukania <td>Dodaj&nbsp; 0,05% Tween20 do 1x PBS.</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.08816</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan sól disodowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5422</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli zawiesinowej</td><td>Greiner bio-one</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Greiner bio-one</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa przezroczysta płytka</td><td>Greiner bio-one</td><td>655001</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka: VWR Mega Star 600R</td><td>Inkubator CO2 VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: HeraCell 240</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovial 2 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa jednostka filtrująca FP30/0,2 CA-S</td><td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td><td>10462200</td><td>Do sterylnej filtracji roztworu enzymatycznego.</td></tr><tr><td>Skaner płaski: Epson Perfection 1200 Photo</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 Pro Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek: Probówka Eppendorfa safe-lock 0,5 ml</td><td>VWR</td><td>20901-505</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek: Probówka Eppendorf safe-lock 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>21008-959</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Swip (orbitalna i pozioma)&nbsp;</td><td>Edmund Buehler&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z potrząsaniem GFL3032</td><td>GFL&nbsp;</td><td>3032</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednorazowa: pipeta do surowicy</td><td>Greiner bio-one</td><td>612301</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia (nożyczki, pęseta, kleszcze zakrzywione)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej (10 cm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>664960</td><td></td></tr><tr><td>Kosia kokultura osteoblastów i osteoklastów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&alpha;,25- Dihydroksywitamina D3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17936</td><td>1000x skoncentrowany bulion (10 &mikro; M w etanolu 100%)</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR Chemicals</td><td>22065.327</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu kości (BGM)</td><td></td><td></td><td>&alfa;-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Carl Roth</td><td>3478.4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100% obj./obj.)</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% obj./obj.)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Szybka czerwonofioletowa sól LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny neutralny buforowany 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>MEM alfa Medium (&alfa;-MEM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-MX fosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do różnicowania osteoklastów (DM)</td><td></td><td></td><td>&alfa;-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna + 1 nM 1,25-(OH)2-witamina D3 + 1 &mikro; M prostaglandyna E2&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Prostaglandyna E2 (PGE2)</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>9003016</td><td>1000x skoncentrowany bulion (1 mM w etanolu 100%)</td></tr><tr><td>Octan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Winian sodu dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8640</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia (nożyczki, kleszcze, skalpel)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRAP bufor pH 5,0</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 40 mM octanu sodu, 10 mM winianu sodu w ultraczystej wodzie i dostosuj do pH 5.</td></tr><tr><td>Woda ultraczysta: Woda do hodowli komórkowych wolna od pirogenów</td><td>VWR</td><td>L0970-500</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli zawiesinowej</td><td>Greiner bio-one</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa rurka do hodowli tkankowej</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Wirówka</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr>: <tr><td>VWR Mega Star 600R</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2: HeraCell 240</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamentowe ostrze do wafli (10,2 cm x 0,3 cm)</td>Piła wolnoobrotowa <td>Buehler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isomet</td> szalka Petriego <td>Buehler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(6 cm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>628,161</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętka szklana butelka 20 ml</td><td>Carl Roth</td><td>EXY4.1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka jednorazowego użytku 1 ml</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednorazowa: pipeta do surowicy</td><td>Greiner bio-one</td><td>612301</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna igła: Igła podskórna RW 27 G x 3/4'</td><td>'Henry Schein Animal Health</td><td>9003340</td><td></td></tr><tr><td>Model wady kalwarii myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analgezja: Buprenorfina (Bupaq)</td><td>Richter Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek sterylizujący na zimno: SafeSept Max</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% obj./obj.)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu: VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalny roztwór soli fizjologicznej (0,9% roztwór chlorku sodu)</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu: Braunol 1000 ml</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4,5% buforowana formalina</td><td>Carl Roth</td><td>2213.6</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy: Histoacryl 5 x 0,5 mL&nbsp;</td><td>B. Braun Chirurgiczne</td><td>1050060</td><td></td></tr><tr><td>Środki ochrony indywidualnej: rękawice chirurgiczne, czepek i maska, fartuch</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1045073, 1026614, 9009062, 370406</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia (skalpel, nożyczki, kleszcze, uchwyt</td><td></td><td></td><td></td> na igłę</tr>)<tr><td>Sterylne igły: Igły podskórne RW 27 G x 3/4'' i 30 G x 1/2''&nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003340, 9003630</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna strzykawka 1 ml</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza: Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki z gazy</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny jednorazowy skalpel (Figur 20)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9008957</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło chirurgiczne/dentystyczne: Implantmed SI-923</td><td>W& H Dentalwerk B&uuml; rmoos GmbH</td><td>16929000</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść typ S-II</td><td>W& H Dentalwerk B&uuml; rmoos GmbH</td><td>30056000</td><td></td></tr><tr><td>Trephine, średnica 4 mm</td><td>Hager& Meisinger GmbH</td><td>229040</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rurek do nawadniania 2,2 m</td><td>W& H Dentalwerk B&uuml; rmoos GmbH</td><td>4363600</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik okostnej 2 mm / 3 mm</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>472683</td><td></td></tr><tr><td>Szew niewchłanialny: Zielony poliester, DS19, met. 1,5, USP 4/0 75 cm</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>300715</td><td></td></tr><tr><td>In vitro odpowiedzi immunologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie do eutanazji: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proliferacja komórek ELISA, BrdU (kolorymetryczny) Zestaw testowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11647229001</td><td>Zestaw zawiera roztwór do znakowania BrdU, roztwór utrwalający (FixDenat), roztwór przeciwciała anty-BrdU, bufor płuczący i roztwór substratu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Concanavalin A (ConA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana splenocyty</td><td></td><td></td><td>Pożywka RPMI + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% roztwór penicyliny-streptomycyny + 0,1% gentamycyna + 0,2% &szlig;-merkaptoetanol + 1% aminokwasów endogennych</td></tr><tr><td>Etanol (70% obj./obj.)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;</td><td></td><td></td>10500064</tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15750037</tr><tr><td>Mysz IL-1&beta; ELISA Gotowy do działania!</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>88-7013-88</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-2 ELISA MAX Standard</td><td>BioLegend</td><td>431001</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-4 ELISA MAX Standard</td><td>BioLegend</td><td>431101</td><td></td></tr><tr><td>Mysz INF-&gamma; ELISA MAX Standard</td><td>BioLegend</td><td>430801</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11140050</tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC): BD Pharm Lyse</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 podłoże, HEPES</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>31350010</tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka: VWR Mega Star 600R</td> Sitko do komórek <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &mikro; m</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Infinite M200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna strzykawka 1 ml</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia chirurgiczne (kleszcze, szkiełka podstawowe)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><mocny>Model dootrzewnowy o wysokiej przepustowości</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator na zimno: SafeSept Max</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% obj./obj.)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu: VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-1&beta; ELISA Gotowy do działania!</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>88-7013-88</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-2 ELISA MAX Standard</td><td>BioLegend</td><td>431001</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-4 ELISA MAX Standard</td><td>BioLegend</td><td>431101</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu: Braunol 1000 ml</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990700</td><td>Do różnicowego zliczania komórek.</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza: Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr: komora Neubauera</td><td>Carl Roth</td><td>PC72.1</td><td></td></tr><tr><td>Szew niewchłanialny: Ethibond Excel 4-0</td><td>Ethicon</td><td>6683H</td><td></td></tr><tr><td>Szew wchłanialny: Polysorb</td><td>Covidien</td><td>SL-5628</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Shandon do cytopsyny</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna strzykawka 1 ml</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki z gazy</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne igły: Igły podskórne RW 27 G x 3/4'' i 25 G</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003340, 420939</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia chirurgiczne (skalpel, nożyczki, kleszcze, uchwyt na igłę)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td><silny>Podprzewlekły model podskórny</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek sterylizacyjny na zimno: SafeSept Max</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% obj./obj.)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu: VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu: Braunol 1000 ml</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4,5% buforowana formalina</td><td>Carl Roth</td><td>2213.6</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza: Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Szew niewchłanialny: Ethibond Excel 4-0</td><td>Ethicon</td><td>6683H</td><td></td></tr><tr><td>Środki ochrony indywidualnej: chirurgiczne rękawiczki, czepek i maska, fartuch</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1045073, 1026614, 9009062, 370406</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna strzykawka 1 ml</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki z gazy</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia (skalpel, nożyczki, kleszcze, uchwyt na igły)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna igła: Igły podskórne RW 27 G x 3/4''&nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003340, 420939</td><td></td></tr></tbody></table>

profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Duże złamania kości bez zrostu stanowią poważne wyzwanie w chirurgii ortopedycznej. Chociaż auto- i allogeniczne przeszczepy kostne doskonale nadają się do leczenia takich zmian, istnieją potencjalne komplikacje związane z ich stosowaniem. W związku z tym naukowcy zajmujący się materiałami opracowują syntetyczne, biokompatybilne biomateriały, aby przezwyciężyć te problemy. W niniejszej pracy prezentujemy multidyscyplinarną platformę do oceny biomateriałów do naprawy kości. Połączyliśmy wiedzę z zakresu biologii kości i immunologii, aby opracować platformę obejmującą testy in vitro osteoklastów (OC) i osteoblastów (OB) oraz mysie modele in vivo naprawy kości, immunogenności i alergenności. Pokazujemy, jak przeprowadzać eksperymenty, podsumowujemy wyniki i raportujemy o biokompatybilności biomateriałów. W szczególności przetestowaliśmy żywotność, różnicowanie i mineralizację OB oraz żywotność i różnicowanie OC w kontekście krążków fosforanu β-triwapniowego (β-TCP). Przetestowaliśmy również piankę β-TCP/Collagen (β-TCP/C), która jest dostępnym na rynku materiałem stosowanym klinicznie do naprawy kości w mysim modelu ubytku kości łydkowej o krytycznym rozmiarze, aby określić wpływ na wczesną fazę gojenia się kości. W równoległych eksperymentach ocenialiśmy reakcje immunologiczne i alergiczne u myszy. Nasze podejście pozwala na wygenerowanie profilu zgodności biologicznej biomateriału kostnego z szeregiem parametrów niezbędnych do przewidywania biokompatybilności biomateriałów stosowanych do gojenia i naprawy kości u pacjentów.

Aby ocenić skuteczność β-TCP jako biomateriału do regeneracji kości, zastosowaliśmy metody przesiewowe in vitro oraz in vivo. W pierwszej kolejności zmierzyliśmy odpowiedzi OB w kontakcie z dyskami β-TCP w porównaniu z kontrolą w samym medium bazowym. Rycina 2 przedstawia żywotność OB w odpowiedzi na dyski β-TCP po 7 i 14 dniach hodowli. Żywotność komórek, mierzona na podstawie aktywności metabolicznej komórek w dołkach hodowlanych, była tak...

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów. Szczególnie do regeneracji kości. Służą one do oceny skuteczności biomateriałów i potencjalnych odpowiedzi immunologicznych.Główną zaletą tej multidyscyplinarnej platformy jest to, że zapewnia ona szereg parametrów do przewidywania biokompatybilności biomateriałów wykorzystywanych do naprawy kości. Implikacje tych technik kostnych in vitro i in vivo rozciągają się na inne choroby kości. Ze względu na potrzebę przedklinicznych badań przesiewowych nowych biomateriałów ortopedycznych.Metodologia dermatologiczna może zapewnić wgląd w biomateriały do gojenia kości, może być również stosowana do oceny biomateriałów w przypadku wszelkich innych wskazań klinicznych. Odessać pożywkę hodowlaną z pierwotnych osteoblastów 14 dni po dodaniu pożywki do mineralizacji osteogennej. Spłucz dwukrotnie 0,5 mililitra 1X PBS.Następnie utrwal komórki, dodając 0,5 mililitra 10% buforowanego roztworu formaliny i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po 10 minutach odessać 10% buforowaną formalinę za pomocą jednorazowej pipety i przemyć dwukrotnie 0,5 mililitra ultraczystej wody. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 40-milimolowego roztworu barwiącego Alizarin Red S do utrwalonych osteoblastów.I inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów na minutę. Po inkubacji z roztworem barwiącym odessać roztwór barwiący za pomocą jednorazowej pipety i spłukać jednym mililitrem ultraczystej wody. Powtórz ten krok od pięciu do 10 razy, aż roztwór płuczący zejdzie z klarowności, aby usunąć niespecyficzne plamy.Po zaessaniu ostatniego prania dodaj jeden mililitr zimnego PBS. I inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce, tak jak poprzednio. Następnie przenieś barwione krążki fosforanu beta trójwapniowego do nowej studzienki i zeskanuj płytki skanerem płaskim, aby zarejestrować mineralizację.Po przechwyceniu obrazu dodaj 250 mikrolitrów 10% roztworu chlorku cetylopirydyniowego i wstrząsaj przez 15 minut, aby wyekstrahować barwnik Alizarin Red S. Następnie przenieś roztwór z dołków do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj przy 17 000 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć ekstrakt 10% roztworem chlorku cetylopirydyniowego w proporcji rozcieńczenia 1:10 do 1:20 w probówce o pojemności 1,5 mililitra.Następnie przenieś 300 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do dołków 96-dołkowej płytki. Uwzględnij dwie ślepe studzienki zawierające tylko 10% chlorku cetylopirydyniowego. Następnie przygotuj siedem wzorców referencyjnych czerwieni alizaryny S w zakresie od 4 400 mikromolów, rozcieńczając 40-milimolowy roztwór barwiący czerwień alizaryny S 10% roztworem chlorku cetylopirydyniowego w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.Załaduj 300 mikrolitrów każdego wzorca do płytki. Na koniec odczytaj absorbenty próbek, ślepych prób i wzorców referencyjnych przy 520 nanometrach. Wyizoluj prekursory osteoplastów szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy poddanej eutanazji za pomocą sterylnych nożyczek do usunięcia nóg z ciała w stawie biodrowym.Przetnij kończyny w stawach kolanowych i skokowych i usuń tkankę miękką za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy. Odetnij nasady. Włóż igłę o rozmiarze 27 dołączoną do strzykawki wypełnionej jednym mililitrem pożywki do wzrostu kości do światła i wypłucz szpik do sześciocentymetrowej sterylnej szalki Petriego.Po powtórzeniu tego dla wszystkich kości udowych i piszczelowych, przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Umyj sześciocentymetrową szalkę Petriego pięcioma mililitrami pożywki do wzrostu kości i przenieś ją do tej samej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Wirować przy 350 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze na studzienkę pożywki różnicującej osteoklasty. Jedna mysz BALB/c dostarcza wystarczającą liczbę prekursorów osteoklastów na jedną 24-dołkową płytkę hodowlaną. Dodaj pierwotne osteoblasty zawieszone w pożywce do wzrostu kości na biomateriał i kontrole w ilości 8,8 * 10 ^ 4 komórek na centymetr kwadratowy.Stosuje się tu krążki fosforanu beta trójwapniowego, kontrolowaną kość bydlęcą i plastik z kultur tkankowych. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po 24 godzinach dodaj świeżo wyizolowane prekursory osteoklastów szpiku kostnego i pożywkę różnicującą osteoklasty do hodowanych pierwotnych osteoblastów i wróć do inkubatora na pięć dni hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla.Pożywkę należy wymieniać na świeżo przygotowaną pożywkę do różnicowania osteoklastów co drugi dzień. Następnie wybarwić osteoklasty pod kątem kwasowej fosfatazy odpornej na winian, aby ocenić różnicowanie. Ogol skórę głowy znieczulonej ośmiotygodniowej myszy BALB/c i oczyść powierzchnię 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Zapewnij odpowiedni poziom znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i ogona. Następnie, po wykonaniu nacięcia strzałkowego w linii środkowej, usuń tkanki łączne przyczaszki powyżej prawej kości ciemieniowej, zeskrobując ją skalpelem.Następnie użyj sterylnej trepanacji dentystycznej o średnicy czterech milimetrów przy 2000 obrotach na minutę, aby stworzyć ubytek o krytycznej wielkości w prawej kości ciemieniowej. Stale nawadniaj obszar sterylnym roztworem soli fizjologicznej, jednocześnie nacinając prawą kość ciemieniową i przecinając ektokortekst i część kory wewnętrznej. Aby zapobiec uszkodzeniu Dera Mater, użyj małej windy okostnej, aby przebić się przez pozostałą korę wewnętrzną.Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś kość nazębną i usuń ją. Powstała wada powinna być okrągła i mieć średnicę około 3,5 milimetra. Następnie wypełnij ubytek kości nazębnej pianką kolagenową z fosforanu beta trójwapniowego, wstępnie nasączoną sterylnym PBS.Aby utrzymać biomateriał na miejscu, nałóż 0,5 mikrolitra kleju tkankowego na końcu ubytku w dwóch przeciwległych punktach. Następnie zamknij skórę niewchłanialnym szwem. Połóż znieczuloną mysz na grzbiecie, ogol sierść na brzuchu i oczyść ogoloną powierzchnię 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.Po wykonaniu ośmiomilimetrowego nacięcia linii środkowej przez skórę wzdłuż linii białej brzucha, wszczepić biomateriał PBS pod skórę. Następnie zszyj skórę niewchłanialnym szwem. Osiem tygodni po implantacji należy wyciąć miejsce implantacji wraz z otaczającą tkanką od myszy poddanej eutanazji.Obraz ten pokazuje, że wzrost na krążkach fosforanu beta trójwapniowego pokazany w otwartych prętach nie wpływa na żywotność osteoblastów w porównaniu ze wzrostem na plastikowej hodowli tkankowej po siedmiu i 14 dniach hodowli. Wyhodowane osteoblasty wybarwiono czerwienią Alizaryn S po 14 dniach. Mineralizacja była wyższa w grupie kontrolnej pożywki mineralizacyjnej w porównaniu z osteoblastami hodowanymi w samym pożywce.I na krążkach fosforanu beta triwapniowego w studzienkach do hodowli zawiesinowych. Gdy chirurgicznie wywołany ubytek kalwarii krytycznej pozostał pusty, zaobserwowano cienką warstwę pokrywającą cały ubytek, ale po 12 tygodniach od operacji nie stwierdzono znaczącej formacji kostnej. W przeciwieństwie do tego, gdy ubytek zawierał piankę kolagenową z fosforanu beta trójwapniowego, resztki pianki otoczone gęstą tkanką włóknistą, w tym niektórymi naczyniami krwionośnymi i komórkami zapalnymi, wypełniły obszar ubytku bez oznak tworzenia się kości.Po podskórnej implantacji pianki kolagenowej z fosforanu beta trójwapniowego zaobserwowano reakcję zapalną z gigantycznymi komórkami ciała obcego na skrawkach barwionych hematoksyliną i eozyną, co świadczy o zwłóknieniu na skrawkach barwionych trichromem Massona po ośmiu tygodniach. W przeciwieństwie do tego, miejsce implantacji pozorowanych kontroli miało minimalny stan zapalny i nie miało zwłóknienia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wykonać precyzyjne i powtarzalne nacinanie calvarium bez szkody dla zwierzęcia.Podążając za tą procedurą, można przygotować inne metody, takie jak testy różnicowania osteoklastów i wysoka przepustowość w modelach immunologicznych otrzewnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak odpowiedź osteoklastów na biomateriały i rodzaj odpowiedzi immunologicznej.

biological-compatibility-profile-on-biomaterials-for-bone-regeneration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono ulepszoną metodę mechanicznego testowania zakotwiczenia kości na powierzchniach potencjalnych implantów. Metoda ta pozwala na wyrównanie siły rozrywającej dokładnie prostopadle lub równolegle do płaszczyzny powierzchni implantu i zapewnia dokładny sposób kierowania sił zakłócających na dokładny obszar wokół implantu.

Ulepszona metoda badań mechanicznych do oceny zakotwiczenia implantu kostnego

Opisujemy tutaj, jak przygotować podłoże kondycjonowane z kością (BCM) i przetestować jego aktywność in vitro.

Pożywka kondycjonowana z kością: przygotowanie i test biologiczny

Przedstawiono ogólny proces tworzenia krok po kroku szablonu przypominającego kość z zaprojektowanymi mikrokanałami. Wysokie zdolności absorpcyjne i retencyjne matrycy wykazują działanie kapilarne za pośrednictwem mikrokanałów.

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Biomateriały domieszkowane białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP2) zostały użyte jako nowa strategia terapeutyczna do leczenia złamań kostnych bez zrostu. Aby przezwyciężyć skutki uboczne wynikające z niekontrolowanego uwalniania czynnika, proponujemy nową strategię bezpośredniego unieruchomienia czynnika, tworząc w ten sposób materiały o ulepszonych zdolnościach osteogennych.

Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Wprowadzamy trzy metody hodowli bezpośredniej, hodowli bezpośredniej ekspozycji i kultury ekspozycji do oceny cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych. Te metody in vitro naśladują różne interakcje komórka-implant in vivo i mogą być stosowane do badania różnych materiałów biodegradowalnych.

Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej w badaniu biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro

W tym badaniu szczegółowo opisujemy metody decelularyzacji, charakterystyki fizycznej, obrazowania i implantacji in vivo biomateriałów pochodzenia roślinnego, a także metody sadzenia i różnicowania komórek w rusztowaniach. Opisane metody pozwalają na ocenę biomateriałów pochodzenia roślinnego do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej.

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek do inżynierii tkanki kostnej in vitro i in vivo

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Badanie to ustanowiło model defektu półsegmentalnego szczura kości udowej do oceny mechanicznej i osteogenicznej wydajności materiałów zastępczych kości w warunkach nośnych, bez użycia wewnętrznego lub zewnętrznego fiksacji.

Model defektu kości dwułopowatej półsegmentalnej u szczurów do oceny wydajności substytucji kości w obszarach nośnych

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Poznaj strategię testowania zgodności biologicznej biomateriałów ortopedycznych do regeneracji kości. Metody in vitro i in vivo pozwalają ocenić skuteczność materiałów i potencjalne reakcje immunologiczne.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Przeglądaj więcej filmów