Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów. Szczególnie do regeneracji kości. Służą one do oceny skuteczności biomateriałów i potencjalnych odpowiedzi immunologicznych.

Główną zaletą tej multidyscyplinarnej platformy jest to, że zapewnia ona szereg parametrów do przewidywania biokompatybilności biomateriałów wykorzystywanych do naprawy kości. Implikacje tych technik kostnych in vitro i in vivo rozciągają się na inne choroby kości. Ze względu na potrzebę przedklinicznych badań przesiewowych nowych biomateriałów ortopedycznych.

Metodologia dermatologiczna może zapewnić wgląd w biomateriały do gojenia kości, może być również stosowana do oceny biomateriałów w przypadku wszelkich innych wskazań klinicznych. Odessać pożywkę hodowlaną z pierwotnych osteoblastów 14 dni po dodaniu pożywki do mineralizacji osteogennej. Spłucz dwukrotnie 0,5 mililitra 1X PBS.

Następnie utrwal komórki, dodając 0,5 mililitra 10% buforowanego roztworu formaliny i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po 10 minutach odessać 10% buforowaną formalinę za pomocą jednorazowej pipety i przemyć dwukrotnie 0,5 mililitra ultraczystej wody. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 40-milimolowego roztworu barwiącego Alizarin Red S do utrwalonych osteoblastów.

I inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów na minutę. Po inkubacji z roztworem barwiącym odessać roztwór barwiący za pomocą jednorazowej pipety i spłukać jednym mililitrem ultraczystej wody. Powtórz ten krok od pięciu do 10 razy, aż roztwór płuczący zejdzie z klarowności, aby usunąć niespecyficzne plamy.

Po zaessaniu ostatniego prania dodaj jeden mililitr zimnego PBS. I inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce, tak jak poprzednio. Następnie przenieś barwione krążki fosforanu beta trójwapniowego do nowej studzienki i zeskanuj płytki skanerem płaskim, aby zarejestrować mineralizację.

Po przechwyceniu obrazu dodaj 250 mikrolitrów 10% roztworu chlorku cetylopirydyniowego i wstrząsaj przez 15 minut, aby wyekstrahować barwnik Alizarin Red S. Następnie przenieś roztwór z dołków do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj przy 17 000 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć ekstrakt 10% roztworem chlorku cetylopirydyniowego w proporcji rozcieńczenia 1:10 do 1:20 w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie przenieś 300 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do dołków 96-dołkowej płytki. Uwzględnij dwie ślepe studzienki zawierające tylko 10% chlorku cetylopirydyniowego. Następnie przygotuj siedem wzorców referencyjnych czerwieni alizaryny S w zakresie od 4 400 mikromolów, rozcieńczając 40-milimolowy roztwór barwiący czerwień alizaryny S 10% roztworem chlorku cetylopirydyniowego w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.

Załaduj 300 mikrolitrów każdego wzorca do płytki. Na koniec odczytaj absorbenty próbek, ślepych prób i wzorców referencyjnych przy 520 nanometrach. Wyizoluj prekursory osteoplastów szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy poddanej eutanazji za pomocą sterylnych nożyczek do usunięcia nóg z ciała w stawie biodrowym.

Przetnij kończyny w stawach kolanowych i skokowych i usuń tkankę miękką za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy. Odetnij nasady. Włóż igłę o rozmiarze 27 dołączoną do strzykawki wypełnionej jednym mililitrem pożywki do wzrostu kości do światła i wypłucz szpik do sześciocentymetrowej sterylnej szalki Petriego.

Po powtórzeniu tego dla wszystkich kości udowych i piszczelowych, przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Umyj sześciocentymetrową szalkę Petriego pięcioma mililitrami pożywki do wzrostu kości i przenieś ją do tej samej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Wirować przy 350 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze na studzienkę pożywki różnicującej osteoklasty. Jedna mysz BALB/c dostarcza wystarczającą liczbę prekursorów osteoklastów na jedną 24-dołkową płytkę hodowlaną. Dodaj pierwotne osteoblasty zawieszone w pożywce do wzrostu kości na biomateriał i kontrole w ilości 8,8 * 10 ^ 4 komórek na centymetr kwadratowy.

Stosuje się tu krążki fosforanu beta trójwapniowego, kontrolowaną kość bydlęcą i plastik z kultur tkankowych. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po 24 godzinach dodaj świeżo wyizolowane prekursory osteoklastów szpiku kostnego i pożywkę różnicującą osteoklasty do hodowanych pierwotnych osteoblastów i wróć do inkubatora na pięć dni hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla.

Pożywkę należy wymieniać na świeżo przygotowaną pożywkę do różnicowania osteoklastów co drugi dzień. Następnie wybarwić osteoklasty pod kątem kwasowej fosfatazy odpornej na winian, aby ocenić różnicowanie. Ogol skórę głowy znieczulonej ośmiotygodniowej myszy BALB/c i oczyść powierzchnię 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.

Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Zapewnij odpowiedni poziom znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i ogona. Następnie, po wykonaniu nacięcia strzałkowego w linii środkowej, usuń tkanki łączne przyczaszki powyżej prawej kości ciemieniowej, zeskrobując ją skalpelem.

Następnie użyj sterylnej trepanacji dentystycznej o średnicy czterech milimetrów przy 2000 obrotach na minutę, aby stworzyć ubytek o krytycznej wielkości w prawej kości ciemieniowej. Stale nawadniaj obszar sterylnym roztworem soli fizjologicznej, jednocześnie nacinając prawą kość ciemieniową i przecinając ektokortekst i część kory wewnętrznej. Aby zapobiec uszkodzeniu Dera Mater, użyj małej windy okostnej, aby przebić się przez pozostałą korę wewnętrzną.

Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś kość nazębną i usuń ją. Powstała wada powinna być okrągła i mieć średnicę około 3,5 milimetra. Następnie wypełnij ubytek kości nazębnej pianką kolagenową z fosforanu beta trójwapniowego, wstępnie nasączoną sterylnym PBS.

Aby utrzymać biomateriał na miejscu, nałóż 0,5 mikrolitra kleju tkankowego na końcu ubytku w dwóch przeciwległych punktach. Następnie zamknij skórę niewchłanialnym szwem. Połóż znieczuloną mysz na grzbiecie, ogol sierść na brzuchu i oczyść ogoloną powierzchnię 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.

Po wykonaniu ośmiomilimetrowego nacięcia linii środkowej przez skórę wzdłuż linii białej brzucha, wszczepić biomateriał PBS pod skórę. Następnie zszyj skórę niewchłanialnym szwem. Osiem tygodni po implantacji należy wyciąć miejsce implantacji wraz z otaczającą tkanką od myszy poddanej eutanazji.

Obraz ten pokazuje, że wzrost na krążkach fosforanu beta trójwapniowego pokazany w otwartych prętach nie wpływa na żywotność osteoblastów w porównaniu ze wzrostem na plastikowej hodowli tkankowej po siedmiu i 14 dniach hodowli. Wyhodowane osteoblasty wybarwiono czerwienią Alizaryn S po 14 dniach. Mineralizacja była wyższa w grupie kontrolnej pożywki mineralizacyjnej w porównaniu z osteoblastami hodowanymi w samym pożywce.

I na krążkach fosforanu beta triwapniowego w studzienkach do hodowli zawiesinowych. Gdy chirurgicznie wywołany ubytek kalwarii krytycznej pozostał pusty, zaobserwowano cienką warstwę pokrywającą cały ubytek, ale po 12 tygodniach od operacji nie stwierdzono znaczącej formacji kostnej. W przeciwieństwie do tego, gdy ubytek zawierał piankę kolagenową z fosforanu beta trójwapniowego, resztki pianki otoczone gęstą tkanką włóknistą, w tym niektórymi naczyniami krwionośnymi i komórkami zapalnymi, wypełniły obszar ubytku bez oznak tworzenia się kości.

Po podskórnej implantacji pianki kolagenowej z fosforanu beta trójwapniowego zaobserwowano reakcję zapalną z gigantycznymi komórkami ciała obcego na skrawkach barwionych hematoksyliną i eozyną, co świadczy o zwłóknieniu na skrawkach barwionych trichromem Massona po ośmiu tygodniach. W przeciwieństwie do tego, miejsce implantacji pozorowanych kontroli miało minimalny stan zapalny i nie miało zwłóknienia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wykonać precyzyjne i powtarzalne nacinanie calvarium bez szkody dla zwierzęcia.

Podążając za tą procedurą, można przygotować inne metody, takie jak testy różnicowania osteoklastów i wysoka przepustowość w modelach immunologicznych otrzewnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak odpowiedź osteoklastów na biomateriały i rodzaj odpowiedzi immunologicznej.