Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące dynamicznej syntezy białek i proteomu zaangażowanego w ten proces. Technika ta umożliwia identyfikację mRNA, które są wybierane do translacji, mikroRNA, które mogą uczestniczyć w procesie i zakłócać translację, oraz białek, które przyczyniają się do translacji białek lub same są poddawane translacji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat reakcji serca na stres, ale może być również zastosowana do badania ostrych reakcji na stres w innych narządach.

Procedurę zademonstruje Miroslava Stastna, naukowiec z laboratorium Jennifer Van Eyk. W dniu eksperymentu napełnij lewą komorę miksera gradientowego pięcioma mililitrami 15% roztworu gradientu sacharozy, a prawą komorę napełnij pięcioma mililitrami 50% roztworu gradientu sacharozy. Otwórz kran i włącz pompę, aby wymieszać dwie małe komory za pomocą mieszadła magnetycznego i użyj rurki połączonej z drugim kranem, aby umożliwić przepływ zmieszanych roztworów sacharozy do jednej probówki ultrawirówki o cienkich ściankach na lodzie.

Następnie homogenizuj świeżą lub zamrożoną tkankę serca za pomocą POLYTRONU w przefiltrowanym buforze do lizy przez 15 sekund na lodzie. Pod koniec inkubacji odwirować lizat w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału i zebrać supernatant. Odłożyć 50 mikrolitrów supernatantu do oznaczania białka, izolacji RNA i analizy integralności RNA, a następnie ułóż warstwę od 100 do 500 mikrolitrów pozostałego supernatantu na roztworze gradientowym.

Użyj świeżego buforu do lizy, aby zrównoważyć objętości między dwiema rurkami gradientowymi i ultraodwiruj próbki w ultrawirówce z obracającym się wirnikiem kubełkowym. Bądź bardzo ostrożny, aby nie zakłócić gradientu sacharozy przed lub po odwirowaniu. Aby zebrać gradienty, zaprogramuj kolektor frakcji tak, aby odrzucał pierwsze trzy minuty zbierania i zbierał ciężkie, lekkie i nietranslujące frakcje z prędkością jednego mililitra na minutę w 17 frakcjach od czterech do 19 minut z ciągłym monitorowaniem absorbancji na poziomie 254 nanometrów.

Umieść każdą frakcję na lodzie, gdy tylko zostanie zebrana. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jeśli nie są one natychmiast przetwarzane. Aby wyekstrahować białka z frakcji polisomów, połącz zebrane frakcje sacharozy w trzy końcowe frakcje i oznacz frakcje jako ciężkie, lekkie i nieulegające translacji.

Wymieszaj 0,5 mililitra każdej próbki z 60 mikrolitrami 100% kwasu trójchlorooctowego lub TCA. Inkubuj frakcje przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w ciemności. Następnego ranka rozmrozić próbki na lodzie przed granulowaniem białek przez odwirowanie.

Wyrzuć supernatanty i umyj granulki dwa razy 0,5 mililitra schłodzonego acetonu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na odwirowanie. Upewnij się, że osad, po wytrąceniu TCA, jest całkowicie rozpuszczony, stosując sonikację impulsową, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność, jeśli to konieczne. Wysuszyć granulki na powietrzu po ostatnim praniu przed ponownym zawieszeniem w 360 mikrolitrach buforu Tris-HCl.

Następnie dodaj 40 mikrolitrów ditiotreitolu na 45-minutową inkubację w temperaturze 55 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów jodoacetamidu do próbek na 30-minutową inkubację na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, a następnie roztwarzić próbki przy stosunku wagowym trypsyny do białka wynoszącym jeden do 50 w celu całonocnej inkubacji z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka, po schłodzeniu, krótko odwiruj próbki i dostosuj pH do dwóch do trzech za pomocą 10% kwasu mrówkowego, aby ugasić aktywność trypsyny.

Aby odsolić próbki, najpierw kondycjonuje się sorbent w dołkach 96-dołkowej płytki trzykrotnie 200 mikrolitrami metanolu, a następnie kondycjonuje 200 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego na studzienkę trzy razy. Następnie załaduj próbki do każdej studzienki i umyj je trzykrotnie 200 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego na pranie. Wykorzystując grawitację, a następnie niską próżnię, wymyj próbki 100 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego w 50% acetonitrylu dwa razy do jednej probówki o niskiej retencji białka 0,5 mililitra na próbkę.

Następnie użyj koncentratora, aby odparować eluatywy próbki do sucha i rozpuść każdą osadkę peptydu tryptycznego w 50 do 100 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego do analizy spektrometrii mas. Analizę mRNA można przeprowadzić w celu oceny rozmieszczenia określonego mRNA będącego przedmiotem zainteresowania w każdej frakcji lub w celu kwantyfikacji i porównania połączonych polirybosomalnych frakcji translacyjnych z frakcją nietranslującą jako stosunek obfitości mRNA każdej frakcji. Na przykład w tym miejscu pokazano zmiany w dystrybucji mRNA we frakcjach translacyjnych i nietranslacyjnych po poddaniu serca myszy niedokrwieniu lub reperfuzji niedokrwiennej, w porównaniu z pozorowanym leczeniem serca.

W tym reprezentatywnym eksperymencie analiza podzbioru mikroRNA w połączonych ciężkich frakcjach wykazała, że 22 mikroRNA były związane z polisomami podczas niedokrwienia, dziewięć było związanych podczas niedokrwienia i reperfuzji, a siedem było wspólnych dla obu stanów, wykazując, że asocjacja mikroRNA jest dynamiczna w odpowiedzi na stres niedokrwienia i reperfuzji. Co więcej, większość mitochondrialnych białek rybosomalnych zidentyfikowano we frakcji lekkiej, a większość cytozolowych białek rybosomalnych zidentyfikowano powszechnie zarówno we frakcji ciężkiej, jak i lekkiej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zachować szczególną ostrożność z gradientem sacharozy.

Wytrącanie TCA do ekstrakcji białek z frakcji polisomowych zostało wybrane w naszym przepływie pracy zarówno na podstawie możliwości przetwarzania frakcji o wysokim stężeniu sacharozy, jak i liczby białek zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą zmagać się z wyzwaniami związanymi z odtwarzalnością gradientu sacharozy. Wytrącanie TCA jest korzystne, ponieważ do wytrącenia białek potrzebne są tylko niewielkie objętości, osad jest widoczny na dnie rurki i nie dochodzi do gromadzenia się sacharozy podczas wytrącania.