Name: Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę profilowania polisomów w izolowanym sercu myszy po perfuzji Langendorffa. Analiza dynamiczna mRNA, miRNA i proteomu polisomów pozwala badać syntezę białek oraz odpowiedzi serca na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Women's Heart Center (RAG, JVE), Dorothy and E. Phillip Lyon Chair in Molecular Cardiology (RAG), Erika Glazer Endowed Chair in Woman's Heart Health (JVE) oraz Wsparcie Instytucjonalne Czeskiej Akademii Nauk RVO: 68081715 (MS).

<ol><li>Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+pseudohypoxia+targets+ambra1+mrna+to+p-bodies+for+translational+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression.</a> PLoS ONE. 10, e0129750(2015).</li>
<li>Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+in+atrial+tissue+of+patients+undergoing+heart+surgery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass.</a> JCI Insight. 2, e89303(2017).</li>
<li>Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+Combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+trafficking+of+transcripts+and+micrornas+in+regenerating+liver+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).</li>
<li>Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+Mirnas+and+mrnas+in+ischemic+preconditioning+and+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+enzymology.+Laboratory+methods+in+enzymology%3A+Rna.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface.</a> Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).</li>
<li>Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysomal+fractions+from+mouse+brain+synaptoneurosomes+and+analysis+of+polysomal-bound+mrnas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Molotski, N., Soen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+association+of+micrornas+with+polysomes+reflects+distinct+strengths+of+interactions+with+their+mrna+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets.</a> RNA. 18, 1612-1623 (2012).</li>
<li>Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+micrornas+are+associated+with+translating+messenger+rnas+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).</li>
<li>Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mirnas+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interplay between mirnas and human diseases.</a> Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrna+therapeutics%3A+Towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).</li>
<li>Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnp%3AMrna+association+in+polyribosomes+in+a+human+neuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line.</a> RNA. 10, 387-394 (2004).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+mirna+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).</li>
<li>Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+many+micrornas+that+copurify+with+polyribosomes+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).</li>
<li>Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-linked+microrna-21+exhibits+drastically+reduced+mrna+binding+and+silencing+activity+in+healthy+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver.</a> RNA. 18, 1510-1526 (2012).</li>
<li>Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+rna-binding+protein+hu+antigen+r%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).</li>
<li>McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+azidohomoalanine+labeling+in+mammals+%28palm%29+detects+changes+in+liver-specific+lkb1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice.</a> Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).</li>
<li>Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+biotinylated+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichloroacetic+acid-induced+protein+precipitation+involves+the+reversible+association+of+a+stable+partially+structured+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate.</a> Protein Science. 18, 980-993 (2009).</li>
<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza profilu polisomowego pozwala na badanie translacji białek poprzez analizę stanu translacyjnego określonego mRNA lub całego transkryptomu 6,7. Jest to również bardzo pomocne, gdy trzeba zbadać translację lokalną, taką jak synaptosomy8. Tradycyjnie, metoda ta polega na rozdzieleniu mono- i polirybosomów oraz związanych z nimi mRNA na gradiencie sacharozy, który można połączyć z technikami genomicznymi lub proteomicznymi w celu uzyska...

Serce reaguje na uraz spowodowany niedokrwieniem (I) i reperfuzją (R) w sposób dynamiczny. Jednak niewiele jest wglądu w ostre zmiany w syntezie białek podczas odpowiedzi. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystaliśmy sprawdzoną metodę profilowania polisomów1, aby zidentyfikować zmiany w obfitości białek, które odzwierciedlają redystrybucję rybosomów i translacyjnych czynników regulacyjnych od cytozolu do polisomów oraz wzrost nowo zsyntetyzowanych białek (NSP). W ustawieniu I/R wzrost syntezy nowych białek następuje w ramach czasowych, które są niespójne z transkrypcją nowych mRNAs2; ponadto odnotowano niezgodność między poziomami ekspresji mRNA a obfitością białka3. Z tych powodów zdecydowaliśmy się przeanalizować zmiany w dynamicznym proteomie odzwierciedlone przez translację białek. Aby to zrobić, oznaczamy ilościowo mRNA we frakcjach polisomów i analizujemy skład białek we frakcjach polisomów. Wreszcie, ponieważ mikroRNA (miR) regulują dostępność mRNA do translacji i mogą zakłócać wydajność translacji białek4,5, zbadaliśmy rozkład miR we frakcjach polisomów, koncentrując się na odpowiedzi na I/R.
Zdecydowaliśmy się użyć izolowanego mysiego modelu perfuzji Langendorffa i pobraliśmy tkankę w podstawowych warunkach ciągłej perfuzji, po 30 minutach globalnego niedokrwienia bez przepływu, a następnie po 30 minutach niedokrwienia, a następnie 30 minutach reperfuzji. Następnie rozpuściliśmy tkankę serca i oddzieliliśmy polisomy w gradiencie sacharozy, a następnie przeprowadziliśmy analizę proteomiczną i selektywne wykrywanie mRNA i miRNA odpowiednio za pomocą PCR i mikromacierzy. Ta kombinacja metod stanowi potężne podejście do zrozumienia dynamicznego proteomu, umożliwiając jednoczesne wykrywanie mRNA, miRNA i NSP, a także redystrybucję białek regulatorowych, miRNA i mRNA między frakcjami nietranslacyjnymi, polisomami o niskiej wydajności i polisomami o wysokiej wydajności (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Wgląd w dynamiczną regulację tego procesu zostanie poszerzony o dalszą analizę fosforylacji kluczowych czynników regulacyjnych, takich jak eIF2α czy mTOR. Te poszczególne kroki są teraz szczegółowo opisane.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>do eutanazji</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sagent</td><td>103424</td> stosowany w kleszczach <td>preparatycznych Langendorff</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>służy do zawieszania serca</td></tr><tr><td>System Langendorffa</td><td>Radnoti + domowej roboty</td><td>nie dotyczy</td><td>System "czterech serc" składający się z niestandardowego dmuchanego szkła, rurek i kąpieli wodnych</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Bufor Krebsa i gradient sacharozy</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Bufor Krebsa i bufor do lizy</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Bufor Krebsa</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Bufor Krebsa</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Bufor Krebsa</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Bufor Krebsa</td></tr><tr><td>Sacharoza w proszku</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Gradient sacharozy</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Gradient sacharozy i bufor do lizy</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Bufor gradientu sacharozy i bufor do lizy</td></tr><tr><td>Ksylen Cyanole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Gradient sacharozy</td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Gradient sacharozy i bufor lizy</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>Inhibitor RNAzy do buforu lizy</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe, bez EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Probówka, cienkościenna, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultrawirowanie gradientów</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultrawirowanie gradientów</td></tr><tr><td>Biologic LP (pompa)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Frakcjonowanie gradientów</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Frakcjonowanie gradientów</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf RNA/DNA LoBind, probówka 2 ml</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Frakcja gradientowa i ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Technologie życia Ekstrakcja</td><td>RNA</td><td>AM9738</td></tr><tr><td>Lucyferazy Kontrola RNA</td><td>Ekstrakcja RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA ekstrakcja</td></tr><tr><td>Glikogen, klasa RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>iScript Zestaw do syntezy cDNA</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Odwrotna transkrypcja</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>Quantative PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit do całkowitej izolacji RNA</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit do odwrotnej transkrypcji miRNA</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit do analizy ekspresji miRNA PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Wirówka 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do wirowania probówek o pojemności 1,5 ml lub 2,0 ml w różnych temperaturach. Maksymalna prędkość - 21130 x g</td></tr><tr><td>Wirówka 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do wirowania płytek PCR w czasie rzeczywistym w różnych temperaturach. Maksymalna prędkość - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Do analizy PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>Do kontroli jakości izolacji RNA</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki PCR Hard-Shell, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, zielone/przezroczyste</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>Do analizy PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plate Sealing Folia, klej, optyczna</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Do uszczelniania płytek PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Badania plus pipeta jednokanałowa, szara; 0,5-10 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>pipet PIPETMAN Classic, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>pipet PIPETMAN Classic, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>glikogenu, klasa RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Poprawia całkowitą skuteczność izolacji RNA</td></tr><tr><td>Probówki Posi-Click 1,7 ml, naturalny kolor</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>Izolacja i przechowywanie RNA; mieszanka odczynników</td></tr><tr><td>Termiczne probówki rowerowe -0,2 ml Indywidualne nakrętki, standardowe probówki 0,2 ml z optycznie</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Reakcja odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>Sharp 10 Precyzyjne końcówki barierowe</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>Sharp 20 Precyzyjne końcówki barierowe</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>Sharp 200 Precyzyjne końcówki barierowe</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>Końcówki LTS 1 mL Filter</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>Do pipetowania</td></tr><tr><td>miScript Primer Test ( 200)</td> <td>Qiagen</td> <td>(zmienia się w zależności od miRNA)</td> <td>Do analizy PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>Do przygotowania gradientów sacharozy</td></tr><tr><td>kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris chlorowodorek</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>jodoacetamid</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>stopień sekwencjonowania zmodyfikowana trypsyna, świnia</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan amonu</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>kwas mrówkowy, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>metanol, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind 0,5 ml</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind 1,5 ml</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &micro; Płytka elucyjna 30 &mikro; m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>sonikator</td><td>Wirówka Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr> LC kolumna <tr><td>pułapkowa PepMap 100 C18</td><td>Kolumna</td> separacyjna Thermo Scientific <td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC PepMap RSLC C18</td><td>Spektrometr masowy Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite spektrometr</td><td></td>masowy z pułapką jonową</tr><tr><td>Oprogramowanie MSConvert</td><td>Zestaw narzędzi ProteoWizard</td> Oprogramowanie <td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamiczna analiza proteomiczna i mirna polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji langendorffa

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Badania nad dynamicznymi zmianami w translacji białek wymagają specjalistycznych metod. Tutaj zbadaliśmy zmiany w nowo zsyntetyzowanych białkach w odpowiedzi na niedokrwienie i reperfuzję przy użyciu izolowanego perfundowanego serca myszy w połączeniu z profilowaniem polisomów. Aby lepiej zrozumieć dynamiczne zmiany w translacji białek, scharakteryzowaliśmy mRNA, które były obciążone rybosomami cytozolowymi (polirybosomami lub polisomami), a także odzyskaliśmy polisomy mitochondrialne i porównaliśmy dystrybucję mRNA i białek we frakcjach o wysokiej wydajności (liczne rybosomy przyłączone do mRNA), o niskiej wydajności (przyłączonych mniej rybosomów), które obejmowały również polisomy mitochondrialne, oraz frakcje nietranslujące. miRNA mogą również wiązać się z mRNA, które są poddawane translacji, zmniejszając w ten sposób wydajność translacji, zbadaliśmy rozkład miRNA we frakcjach. Rozkład mRNA, miRNA i białek badano w podstawowych warunkach perfuzji, pod koniec 30 minut globalnego niedokrwienia bez przepływu i po 30 minutach reperfuzji. W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystane do przeprowadzenia tej analizy – w szczególności podejście do optymalizacji ekstrakcji białek z gradientu sacharozy, ponieważ nie zostało to wcześniej opisane – i przedstawiamy kilka reprezentatywnych wyników.

Analiza mRNA 
Wyniki analizy mRNA można przedstawić jako rozkład konkretnego mRNA w każdej frakcji (Rysunek 3A); w celu kwantyfikacji należy połączyć frakcje polirybosomalne translacyjne i porównać je z frakcją nietranslacyjną (Rysunek 3B), prezentując stosunek obfitości mRNA w frakcjach translacyjnych do nietranslacyjnych. Dodatkowe informacje uzyskuje się poprzez oddzielne badanie frakcji polisomów o wysokiej wyda...

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące dynamicznej syntezy białek i proteomu zaangażowanego w ten proces. Technika ta umożliwia identyfikację mRNA, które są wybierane do translacji, mikroRNA, które mogą uczestniczyć w procesie i zakłócać translację, oraz białek, które przyczyniają się do translacji białek lub same są poddawane translacji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat reakcji serca na stres, ale może być również zastosowana do badania ostrych reakcji na stres w innych narządach.Procedurę zademonstruje Miroslava Stastna, naukowiec z laboratorium Jennifer Van Eyk. W dniu eksperymentu napełnij lewą komorę miksera gradientowego pięcioma mililitrami 15% roztworu gradientu sacharozy, a prawą komorę napełnij pięcioma mililitrami 50% roztworu gradientu sacharozy. Otwórz kran i włącz pompę, aby wymieszać dwie małe komory za pomocą mieszadła magnetycznego i użyj rurki połączonej z drugim kranem, aby umożliwić przepływ zmieszanych roztworów sacharozy do jednej probówki ultrawirówki o cienkich ściankach na lodzie.Następnie homogenizuj świeżą lub zamrożoną tkankę serca za pomocą POLYTRONU w przefiltrowanym buforze do lizy przez 15 sekund na lodzie. Pod koniec inkubacji odwirować lizat w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału i zebrać supernatant. Odłożyć 50 mikrolitrów supernatantu do oznaczania białka, izolacji RNA i analizy integralności RNA, a następnie ułóż warstwę od 100 do 500 mikrolitrów pozostałego supernatantu na roztworze gradientowym.Użyj świeżego buforu do lizy, aby zrównoważyć objętości między dwiema rurkami gradientowymi i ultraodwiruj próbki w ultrawirówce z obracającym się wirnikiem kubełkowym. Bądź bardzo ostrożny, aby nie zakłócić gradientu sacharozy przed lub po odwirowaniu. Aby zebrać gradienty, zaprogramuj kolektor frakcji tak, aby odrzucał pierwsze trzy minuty zbierania i zbierał ciężkie, lekkie i nietranslujące frakcje z prędkością jednego mililitra na minutę w 17 frakcjach od czterech do 19 minut z ciągłym monitorowaniem absorbancji na poziomie 254 nanometrów.Umieść każdą frakcję na lodzie, gdy tylko zostanie zebrana. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jeśli nie są one natychmiast przetwarzane. Aby wyekstrahować białka z frakcji polisomów, połącz zebrane frakcje sacharozy w trzy końcowe frakcje i oznacz frakcje jako ciężkie, lekkie i nieulegające translacji.Wymieszaj 0,5 mililitra każdej próbki z 60 mikrolitrami 100% kwasu trójchlorooctowego lub TCA. Inkubuj frakcje przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w ciemności. Następnego ranka rozmrozić próbki na lodzie przed granulowaniem białek przez odwirowanie.Wyrzuć supernatanty i umyj granulki dwa razy 0,5 mililitra schłodzonego acetonu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na odwirowanie. Upewnij się, że osad, po wytrąceniu TCA, jest całkowicie rozpuszczony, stosując sonikację impulsową, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność, jeśli to konieczne. Wysuszyć granulki na powietrzu po ostatnim praniu przed ponownym zawieszeniem w 360 mikrolitrach buforu Tris-HCl.Następnie dodaj 40 mikrolitrów ditiotreitolu na 45-minutową inkubację w temperaturze 55 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów jodoacetamidu do próbek na 30-minutową inkubację na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, a następnie roztwarzić próbki przy stosunku wagowym trypsyny do białka wynoszącym jeden do 50 w celu całonocnej inkubacji z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka, po schłodzeniu, krótko odwiruj próbki i dostosuj pH do dwóch do trzech za pomocą 10% kwasu mrówkowego, aby ugasić aktywność trypsyny.Aby odsolić próbki, najpierw kondycjonuje się sorbent w dołkach 96-dołkowej płytki trzykrotnie 200 mikrolitrami metanolu, a następnie kondycjonuje 200 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego na studzienkę trzy razy. Następnie załaduj próbki do każdej studzienki i umyj je trzykrotnie 200 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego na pranie. Wykorzystując grawitację, a następnie niską próżnię, wymyj próbki 100 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego w 50% acetonitrylu dwa razy do jednej probówki o niskiej retencji białka 0,5 mililitra na próbkę.Następnie użyj koncentratora, aby odparować eluatywy próbki do sucha i rozpuść każdą osadkę peptydu tryptycznego w 50 do 100 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego do analizy spektrometrii mas. Analizę mRNA można przeprowadzić w celu oceny rozmieszczenia określonego mRNA będącego przedmiotem zainteresowania w każdej frakcji lub w celu kwantyfikacji i porównania połączonych polirybosomalnych frakcji translacyjnych z frakcją nietranslującą jako stosunek obfitości mRNA każdej frakcji. Na przykład w tym miejscu pokazano zmiany w dystrybucji mRNA we frakcjach translacyjnych i nietranslacyjnych po poddaniu serca myszy niedokrwieniu lub reperfuzji niedokrwiennej, w porównaniu z pozorowanym leczeniem serca.W tym reprezentatywnym eksperymencie analiza podzbioru mikroRNA w połączonych ciężkich frakcjach wykazała, że 22 mikroRNA były związane z polisomami podczas niedokrwienia, dziewięć było związanych podczas niedokrwienia i reperfuzji, a siedem było wspólnych dla obu stanów, wykazując, że asocjacja mikroRNA jest dynamiczna w odpowiedzi na stres niedokrwienia i reperfuzji. Co więcej, większość mitochondrialnych białek rybosomalnych zidentyfikowano we frakcji lekkiej, a większość cytozolowych białek rybosomalnych zidentyfikowano powszechnie zarówno we frakcji ciężkiej, jak i lekkiej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zachować szczególną ostrożność z gradientem sacharozy.Wytrącanie TCA do ekstrakcji białek z frakcji polisomowych zostało wybrane w naszym przepływie pracy zarówno na podstawie możliwości przetwarzania frakcji o wysokim stężeniu sacharozy, jak i liczby białek zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą zmagać się z wyzwaniami związanymi z odtwarzalnością gradientu sacharozy. Wytrącanie TCA jest korzystne, ponieważ do wytrącenia białek potrzebne są tylko niewielkie objętości, osad jest widoczny na dnie rurki i nie dochodzi do gromadzenia się sacharozy podczas wytrącania.

dynamic-proteomic-mirna-analysis-polysomes-from-isolated-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Perfuzja izolowanego serca w trybie Langendorffa, w połączeniu ze spektroskopią NMR 31P, łączy dziedziny biochemii i fizjologii w jednym eksperymencie. Protokół ten umożliwia dynamiczny pomiar zawartości i obrotu fosforanów wysokoenergetycznych w sercu przy jednoczesnym monitorowaniu funkcji fizjologicznych. Prawidłowo wykonana, technika ta stanowi cenne narzędzie w ocenie energetyki serca.

Ocena funkcji i energetyki serca w izolowanych sercach myszy z wykorzystaniem spektroskopii 31P NMR

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.

Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Tutaj opisujemy protokół izolowania wystarczającej ilości pojedynczych niekardiomiocytów o wysokiej żywotności z serca myszy po zawale mięśnia sercowego (MI). Można to wykorzystać do późniejszego sekwencjonowania pojedynczych komórek, analizy cytometrii przepływowej i pierwotnej hodowli komórek.

Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego

Poznaj metodę profilowania polisomów w izolowanym sercu myszy po perfuzji Langendorffa. Analiza dynamiczna mRNA, miRNA i proteomu polisomów pozwala badać syntezę białek oraz odpowiedzi serca na stres.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Przeglądaj więcej filmów