Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii makrofagów i komórek dendrytycznych dotyczące subkomórkowej lokalizacji i dynamiki różnych białek w tych typach komórek. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta, niedroga i wykazuje lepszą skuteczność i stabilność ekspresji niż większość innych dostępnych metod. Procedurę zademonstruje Jarmila Kralova, doktorantka z mojego laboratorium.

Aby wytworzyć retrowirusa, umieść jednokomórkową zawiesinę komórek Platinum Eco-packaging na 10-centymetrowej szalce Petriego i hoduj komórki w 15 mililitrach DMEM, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS, aż kultura będzie zlewać się w 50 do 60%. Następnego dnia dodaj 20 mikrogramów interesującego nas konstruktu retrowirusowego i 10 mikrogramów wektora eko-opakowania PCL do 1 mililitra DMEM bez surowicy, delikatnie mieszając. Dodaj 75 mikrolitrów PEI w 1 mililitrze DMEM bez surowicy i antybiotyków do drugiej probówki na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej i wymieszaj zawartość obu probówek razem przez dodatkowe 10 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.

Następnie ostrożnie zastąp podłoże na ogniwach Platinum Eco 8 mililitrami świeżego DMEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionego 2% FBS i ostrożnie dodaj mieszaninę transfekcji w kroplach na płytkę. Po 4-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza zastąp supernatent 10 mililitrami DMEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza, uzupełniony 10% FBS na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia użyj pipety o pojemności 5 mililitrów, aby przenieść ekotropowy supernatent zawierający cząstki retrowirusowe do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i usunąć zanieczyszczenia i zawierające je komórki przez odwirowanie.

W międzyczasie dodaj 10 mililitrów DMEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza plus 10% FBS do naczynia hodowlanego na kolejną 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zbierz drugą rundę cząstek wirusa, jak właśnie pokazano. Aby pobrać szpik kostny, w kapturze do hodowli tkankowej, użyj pęsety i nożyczek, aby usunąć skórę i część mięśni z kończyn tylnych i ostrożnie usunąć panewkę ze stawu biodrowego bez złamania kości udowej. Odetnij łapy w stawach skokowych i spryskaj kości 70% etanolem.

Następnie usuń resztę mięśnia ręcznikiem papierowym i umieść kości na 5-centymetrowej szalce Petriego z PBS uzupełnionej 2% FBS. Następnie zegnij staw kolanowy każdego zestawu kości i ostrożnie oddziel kości nożyczkami. Użyj nożyczek, aby usunąć około jednego do dwóch milimetrów każdej nasady jednej kości i użyj dwu- lub pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 załadowaną świeżym PBS i FBS, aby przepłukać szpik kostny z obu końców kości do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Po pobraniu szpiku z każdej z kości, osadzać komórki kostne przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 2,5 mililitra buforu do lizy czerwonych krwinek na dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej. Po lizie przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i przywróć wytrzymałość za pomocą 12 mililitrów PBS plus FBS. Ponownie zawiesić osad w DMEM, uzupełniony 10% FBS i antybiotykami do liczenia i płytkować od pięciu do 10 razy 10 do szóstych komórek szpiku kostnego w 10-centymetrowej, nietkankowej szalce Petriego poddanej hodowli tkankowej w 10 mililitrach DMEM uzupełnionym surowicą i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów lub MCSF.

W piątym dniu hodowli ostrożnie przechylić szalkę do hodowli komórkowej i usunąć wszystko, z wyjątkiem około 5 mililitrów pożywki z powierzchni w pobliżu krawędzi szalki. Następnie dodaj 20 mililitrów świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej FBS i MCSF do naczynia i włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Aby zebrać komórki, w szóstym do siódmym dniu usuń wszystkie pożywki i pływające komórki i umyj kulturę PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odłącz przylegające komórki za pomocą pięciu mililitrów 0,02% EDTA i PBS na trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych i użyj pięciomililitrowej pipety, aby delikatnie wypłukać zdysocjowane komórki z dna płytki. Następnie przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 25 mililitrów świeżego PBS. Aby indukować ekspresję białka znakowanego EGFP w komórkach prezentujących antygen pochodzący ze szpiku kostnego, na początku protokołu różnicowania komórek rozcieńczyć komórki szpiku kostnego do dwóch do pięciu razy od 10 do szóstych komórek na mililitry DMEM plus FBS i antybiotyków kontenracji i pokryć komórki jednym mililitrem pożywki na dołek, uzupełnione o odpowiednią cytokinę różnicującą.

Po czterech do sześciu godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych dodać dwa mililitry pierwszej rundy zebranego wirusa uzupełnionego polibrenem i przetoczyć hodowle komórkowe przez odwirowanie i czterogodzinną inkubację w inkubatorze kultur komórkowych. Pod koniec okresu transdukcji przenieś nieprzylegające komórki z każdej studzienki do pojedynczych 15-mililitrowych probówek wirówkowych i zbierz komórki przez odwirowanie. Jeśli potrzebna jest większa liczba komórek, komórki mogą zostać zainfekowane tym samym konsumpcją w wielu studzienkach i połączone przed różnicowaniem.

Następnie ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach pożywki hodowlanej uzupełnionej odpowiednią cytokiną różnicującą i umieścić komórki na jednej 10-centymetrowej szalce Petriego poddanej działaniu kultury nietkankowej na probówkę, na ich sześciodniową hodowlę, jak właśnie pokazano. Ocena skuteczności transfekcji Platinum Eco metodą cytometrii przepływowej po pobraniu drugiego wirusa zawierającego supernatent wykazała średnią skuteczność transfekcji wynoszącą 62% dla PSTPIP2-EGFP i 53% dla OPAL1-EGFP. Transdukcja retrowirusowa nie wpływa na status różnicowania komórek pochodzących ze szpiku kostnego, przy czym ponad 90% komórek w obu kulturach wykazuje dodatnie wyniki dla odpowiednich markerów po transdukcji z którymkolwiek z wirusów.

I z odpowiednimi, charakterystycznymi zmianami morfologicznymi obserwowanymi dla obu typów zróżnicowanej komórki. Warto zauważyć, że ogólna ekspresja EGFP była niższa w hodowlach komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego w porównaniu z ekspresją EGFP makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, niezależnie od rodzaju retrowirusa. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby używać plastikowych naczyń bez tkanki, poddanych hodowli, które są zwykle używane do hodowli bakterii, jeśli planujesz usunąć komórki z naczynia do eksperymentu.

Po tej procedurze można zastosować inne metody obrazowania żywych komórek, mikroskopię superrozdzielczą lub inne rodzaje mikroskopii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące subkomórkowej lokalizacji i dynamiki interesujących komórek dendrytycznych i makrofagów. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią w badaniu rozmieszczenia i relacji przestrzennych białek wyrażanych przez makrofagi i komórki dendrytyczne oraz w pogłębianiu wiedzy na temat funkcji tych białek podczas odpowiedzi immunologicznej. Nie zapominaj, że praca z cząsteczkami wirusów może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak minimalizowanie wytwarzania aerozolu, noszenie sprzętu ochronnego i używanie kaptura z przepływem laminarnym.