Name: Stosowanie przeciwciała 22C3 anty-PD-L1 Skoncentruj się na próbkach biopsji i cytologii od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę oceny ekspresji PD-L1 za pomocą przeciwciała 22C3 w biopsjach i materiale cytologicznym od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Technika ta zapewnia wysoką zgodność ze złotym standardem i wspiera niezawodną selekcję pacjentów do immunoterapii na całym świecie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było sponsorowane przez Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (Komisja ds. Etyki Badań Naukowych, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
UWAGA: Ten protokół jest specjalnie dostosowany do stosowania koncentratu przeciwciał 22C3 na dostępnym na rynku automatycznym barwniku IHC (tutaj określanym jako autostainer, zobacz Tabelę Materiałów) do biopsji guza i próbek cytologicznych.
1. Przygotowanie próbek tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Utrwal tkankę nowotworową w 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF) w kasecie. 
	UWAGA: Tkanka nowotworowa z bliższych guzów płuc jest zwykle uzyskiwana za pomocą bronchoskopii, wykonywanej w umiarkowanej sedacji przez pulmonologa lub specjalistę od płuc. W przypadku zmian obwodowych i rozlanej choroby płuc wskazana jest biopsja przezoskrzelowa lub igłowa. Zabiegi te są zwykle wykonywane na sali operacyjnej lub oddziale intensywnej terapii.</li>
	<li>Zanurz kasetę w parafinie. 
	UWAGA: Utrwalenie można osiągnąć przez perfuzję lub zanurzenie bezpośrednio po rozbiorze i zwykle wymaga 8–10 godzin. Objętość utrwalacza powinna być 15–20 razy większa niż objętość próbki. Nie zaleca się utrwalania tkanki biopsyjnej dłużej niż 10 godzin, ponieważ nadmierne utrwalenie może spowodować maskowanie antygenu. Prędkość utrwalania wynosi około 1 mm/h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Naciekać utrwaloną próbkę tkanki woskiem w procesorze tkanek (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Odwodnienie przeprowadza się w trzech kąpielach alkoholowych o rosnących stężeniach 70%, 85% i 90%. Woda jest ostatecznie usuwana przez trzy ostatnie absolutne kąpiele alkoholowe. Oczyszczanie odbywa się w trzech kąpielach toluenowych, a infiltracja wosku w gorących kąpielach woskowych (44–60 °C).</li>
	<li>Zanurz tkankę w formie wypełnionej stopioną parafiną (patrz Tabela materiałów) i poczekaj na zestalenie.</li>
	<li>Tkankę zatopioną w parafinie należy przeciąć na mikrotomie o grubości 3 μm.</li>
	<li>Przenieś wstęgę parafinową na dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Suszyć szkiełko przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Skrawki tkanki należy przechowywać w temperaturze 2–8 °C (preferowane) lub w temperaturze pokojowej do 25 °C, aby zachować antygenowość, i zabarwić w ciągu 15 dni od cięcia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek cytologicznych
<ol>
	<li>Zebrać popłuczyny oskrzelowe w roztworze konserwującym (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: W tym celu stosuje się standardową technikę bronchoskopii.
	<ol>
		<li>Płukanie rozkładu oskrzeli, z którego ma zostać pobrane próbki. Zbierz pranie do czystego pojemnika. Oznacz pojemnik imieniem i nazwiskiem pacjenta, datą urodzenia i źródłem próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść popłuczyny oskrzelowe do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 2 g proszku DL-ditiotreitolu (patrz tabela materiałów), wirować probówkę przez 30 minut, a następnie odwirować ją przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 10 ml roztworu mukolitycznego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Potrząsać próbką przez 20 minut ze średnią prędkością (poziom 9) i odwirowywać ją przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i umieścić osad komórkowy w probówkach zbiorczych zawierających 10% NBF.</li>
	<li>Dodać 4 krople odczynnika do przygotowania bloku komórkowego (patrz Tabela materiałów) do osadu komórkowego.</li>
	<li>Przenieś osad komórkowy do kasety, utrwal go w 10% NBF i zatapiaj w parafinie w celu przygotowania i podziału bloku komórkowego (patrz kroki 1.1–1.7).</li>
</ol>
3. Test barwienia PD-L1
<ol>
	<li>Włącz autostainer i komputer.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę autostainera i wybierz użytkownika.</li>
	<li>Kliknij "Utwórz etykietę", a następnie "Protokół".</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie protokół 22C3. 
	UWAGA: Protokół jest najpierw instalowany na komputerze autostainera poprzez kliknięcie "Utwórz protokół". Pełny protokół jest dostępny jako plik uzupełniający 1.</li>
	<li>Wpisz identyfikator pacjenta na etykiecie i kliknij "Drukuj".</li>
	<li>Przyklej etykietę do szkiełka.</li>
	<li>Otwórz wysuwaną szufladę, naciskając przycisk wybranej szuflady.</li>
	<li>Umieść etykietowany slajd na podkładce termicznej etykietą skierowaną do góry i do wewnątrz.</li>
	<li>Zamknij wysuwaną szufladę.</li>
	<li>Zdejmij nakrętki z dozowników i załaduj odczynniki na stojaki na odczynniki.</li>
	<li>Otwórz pokrywę barwiarki i umieść stojaki na karuzeli odczynników, upewniając się, że pasują i utrzymują się na swoim miejscu.</li>
	<li>Zamknij maskę.</li>
	<li>W oprogramowaniu kliknij instrument, który będzie używany i kliknij "Uruchomiony".</li>
	<li>Pod koniec procedury IHC płukać szkiełko przez kilka sekund wodą z kranu i jedną kroplą roztworu czyszczącego.</li>
	<li>Nawadniaj szkiełko jedną kąpielą etanolu 100% i drugą kąpielą etanolu 95% przez kilka sekund.</li>
	<li>Umieść szkiełko w maszynie do szkiełek nakrywkowych, aby automatycznie załadować szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
4. Interpretacja barwienia PD-L1
UWAGA: Wykwalifikowany patolog powinien przeprowadzić interpretację testu PD-L1 IHC.
<ol>
	<li>Oceń jakość barwienia PD-L1, analizując kontrole dodatnie i ujemne przed badaniem próbki pacjenta. 
	UWAGA: Wyniki uzyskane na próbce pacjenta uważa się za nieważne, jeśli barwienie kontrolek jest niedopuszczalne.</li>
	<li>Potwierdź obecność co najmniej 100 żywotnych komórek nowotworowych pod mikroskopem. 
	UWAGA: Zgłoś, gdy próbka pacjenta ma mniej niż 100 komórek nowotworowych.</li>
	<li>Przy małym powiększeniu 4X oceń wszystkie dobrze zachowane dodatnie i ujemne obszary guza. 
	UWAGA: Przy małym powiększeniu częściowe zabarwienie błony lub barwienie błony o słabej intensywności (1+) może być trudne do rozpoznania.</li>
	<li>Ocena częściowego lub całkowitego barwienia błony komórkowej. 
	UWAGA: Barwienie cytoplazmatyczne musi być wyłączone z interpretacji.</li>
	<li>Oblicz TPS, oceniając proporcję komórek nowotworowych PD-L1 dodatnich w stosunku do wszystkich komórek nowotworowych obecnych w dobrze zachowanych obszarach guza. 
	UWAGA: Należy badać tylko żywe komórki nowotworowe. Wszystkie inne elementy komórkowe, takie jak komórki odpornościowe, komórki martwicze, normalne komórki i artefakty, muszą być wyłączone z badania.</li>
</ol>

<ol><li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Reck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+Chemotherapy+for+PD-L1-Positive+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).</li>
<li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced%2C+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+randomised%2C+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li>
<li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing%3A+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li>
<li>Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+diagnosis+and+staging+in+the+minimally+invasive+age+with+increasing+demands+for+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).</li>
<li>Padmanabhan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Adequacy+of+Small+Biopsy+and+Fine-Needle+Aspiration+Specimens+for+Molecular+Testing+by+Next-Generation+Sequencing+in+Patients+With+Lung+Cancer%3A+A+Quality+Improvement+Study+at+Dartmouth-Hitchcock+Medical+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).</li>
<li>Tsao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsao%2C+MS+%22IASLC+ATLAS+of+PD-L1+Immunohistochemistry+Testing+in+Lung+Cancer%22">IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer</a>. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).</li>
<li>Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+IHC+in+NSCLC+with+a+global+and+methodological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective.</a> Lung Cancer. , 102-105 (2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-PD-L1+antibody+to+determine+PD-L1+expression+in+multiple+automated+immunohistochemistry+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms.</a> PLoS One. 12 (8), e0183023(2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-programmed+death+ligand+1+antibody+to+determine+programmed+death+ligand+1+expression+in+cytology+samples+obtained+from+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).</li>
<li>Skov, B. G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li>
<li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li>
<li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma%3A+Comparison+among+cytology%2C+small+biopsy%2C+and+surgical+resection+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li>
<li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li>
<li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeprowadziliśmy walidację zoptymalizowanego LDT przy użyciu koncentratu przeciwciał 22C3 PD-L1, porównując go z odpowiednim klinicznie zwalidowanym testem komercyjnym 10,11. LDT oparty na skoncentrowanych przeciwciałach 22C3 wykazał wysoki wskaźnik zgodności między próbkami z biopsji (~100%) i cytologii (~95%) w porównaniu z ekspresją PD-L1 IHC określoną za pomocą testu PD-L1 IHC 22C3 zarówno w punktach odcięcia ≥1% TPS, jak i ≥50% TPS. Zgodnie z niedawnym zale...

Ostatnie badania kliniczne wykazały skuteczność pembrolizumabu, humanizowanego przeciwciała monoklonalnego izotypu IgG4 kappa, które blokuje interakcję między programowaną śmiercią komórki 1 (PD-1) a jej ligandami, PD-L1 i PD-L2, w leczeniu pacjentów z zaawansowanym NDRPC1,2,3,4.
Obecnie, pembrolizumab jest zatwierdzony do leczenia NDRP z ekspresją PD-L1 zarówno u pacjentów wcześniej nieleczonych z TPS o ekspresji PD-L1 ≥50% i bez receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) lub kinazy chłoniaka anaplastycznego (ALK) aberracje genomowe nowotworu3 oraz dla wcześniej leczonych pacjentów z PD-L1 TPS ≥1%1.
Ekspresja białka PD-L1 wykryta przez IHC była szeroko stosowana jako predykcyjny test biomarkerowy dla terapii anty-PD-1/PD-L1. W badaniach klinicznych pembrolizumabu TPS PD-L1 uzyskany z próbek tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie oznaczono za pomocą testu towarzyszącego PD-L1 IHC 22C35. Ten test został zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) i został oznaczony znakiem CE w Europie do oznaczania guza PD-L1 TPS5.
Dodatkowe globalne opcje w różnych instytucjach dla wiarygodnych i wysokiej jakości ocen PD-L1 TPS z LDT, które wykorzystują koncentrat przeciwciał 22C3, są niezbędne do wspierania decyzji klinicznych podejmowanych w sprawie kwalifikacji pacjenta do leczenia pembrolizumabem. Wiele laboratoriów patologicznych nie ma dostępu do towarzyszącego testu diagnostycznego PD-L1 IHC 22C3. W związku z tym niezbędne jest opracowanie niezawodnych i spójnych LDT kompatybilnych z dodatkowymi, powszechnie dostępnymi platformami autostainerów IHC.
Ponadto, istnieje potrzeba ustanowienia LDT przy użyciu próbek cytologicznych, które są jedynym typem próbki często dostępnym od pacjentów z NSCLC. Test towarzyszący PD-L1 IHC 22C3 jest walidowany do resekcji, biopsji gruboigłowych i bronchoskopii tylko wtedy, gdy bronchoskopia daje 100 komórek nowotworowych. Chociaż powyższe typy próbek są często uzyskiwane, próbki cytologiczne są łatwiejsze do pobrania i są najczęściej dostępnym typem próbki w niektórych instytucjach6,7. Jednak obecnie nie ma dostępnego zwalidowanego testu diagnostycznego do oceny ekspresji PD-L1 w próbkach cytologicznych; wiarygodne LDT kompatybilne z próbkami cytologicznymi jeszcze bardziej ułatwiłyby wysokiej jakości badania PD-L1.
Ponadto, przy ustalaniu klinicznej walidacji LDT, IHC powinno być przeprowadzone w podobny sposób jak odpowiadający mu klinicznie zatwierdzony test komercyjny8. Na przykład, należy zweryfikować kilka krytycznych etapów, aby uzyskać ten sam sygnał w sekcjach szeregowych, takich jak miareczkowanie przeciwciał, opóźnienia w leczeniu wstępnym, czas inkubacji i systemy amplifikacji9.
Niedawno opracowaliśmy zoptymalizowany LDT, który wykorzystuje koncentrat przeciwciała 22C3 do oceny ekspresji PD-L1 w biopsjach guza i próbkach cytologicznych10,11. Znaleźliśmy wysoką zgodność z LDT w porównaniu ze "złotym standardem" testu PD-L1 IHC 22C310,11. Ten klinicznie zatwierdzony protokół będzie wspierał wiarygodne, wysokiej jakości testy PD-L1 w różnych regionach na całym świecie.

<table><tbody><tr><td>NovaPrep HQ1</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Roztwór konserwujący do próbek cytologicznych</td></tr><tr><td>Novaprep&reg; HQ+ B</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Roztwór mukolityczny</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6</td><td>Sakura</td><td>6042 VIP 6</td><td></td></tr><tr><td>System konsoli do zatapiania tkanek Tissue-Tek TEC 5</td><td>Sakura</td><td>5229 TEC 5</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe SuperFrost Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3801</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka Heidolph Multi Reax Vortex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-889-410</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytoblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7401150</td><td></td></tr><tr><td>22C3 koncentrat przeciwciała anty-PD-L1</td><td>Agilent Dako</td><td>#M365329</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td><td>Agilent Dako</td><td>SK006</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Agilent Dako</td><td>AS480</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA autostainer</td><td>Ventana</td><td>#750-600</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HQ Uniwersalny łącznik</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HRP Multimer</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplifikacja H2O2</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Wzmacniacz</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Multimer wzmacniający</td><td>Ventana</td><td>#760-100</td><td></td></tr><tr><td>OptiView DAB</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Copper</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin II</td><td>Ventana</td><td>#790-2208</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do niebieszczenia</td><td>Ventana</td><td>#760-2037</td><td></td></tr><tr><td>Kondycjonowanie komórek 1 (CC1)</td><td>Ventana</td><td>#950-124</td><td></td></tr><tr><td>Klapki nakrywkowe z folii Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>4742</td><td></td></tr></tbody></table>

stosowanie przeciwciała 22c3 anty-pd-l1 skoncentruj się na próbkach biopsji i cytologii od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Monoterapia pembrolizumabem została zatwierdzona do leczenia pierwszego i drugiego rzutu pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) z ekspresją PD-L1. Testowanie ekspresji PD-L1 za pomocą testu diagnostycznego 22C3 immunohistochemii PD-L1 (IHC), który daje wynik proporcji guza (TPS), zostało zwalidowane na tkance nowotworowej. Opracowaliśmy zoptymalizowany test laboratoryjny (LDT), który wykorzystuje przeciwciało 22C3 (Ab) skoncentrowane na powszechnie dostępnym autostainerze IHC do biopsji i próbek cytologicznych. TPS PD-L1 oceniano za pomocą 120 sparowanych wycinków tkanki całego guza i próbek biopsyjnych oraz 70 sparowanych próbek biopsyjnych i cytologicznych (płukanie oskrzeli, n = 40; wysięk opłucnowy, n = 30). LDT na bazie koncentratu 22C3 Ab wykazał wysoki wskaźnik zgodności między próbkami z biopsji (~100%) i cytologii (~95%) w porównaniu z ekspresją IHC PD-L1 oznaczoną za pomocą testu towarzyszącego PD-L1 IHC 22C3 w obu punktach cięcia TPS (≥1%, ≥50%). Zaprezentowany tutaj zoptymalizowany LDT, wykorzystujący koncentrat 22C3 Ab do określenia ekspresji PD-L1 zarówno w tkance nowotworowej, jak i w próbkach cytologicznych, rozszerzy możliwości laboratoriów na całym świecie do oceny kwalifikacji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca do leczenia pembrolizumabem w monoterapii w wiarygodny i powtarzalny sposób.

Stosując zaprezentowaną tutaj procedurę, opisaną szczegółowo w niedawnych publikacjach tej grupy10,1, zoptymalizowany test LDT został zwalidowany klinicznie z wykorzystaniem 120 archiwalnych próbek biopsji FFPE z NSCLC pobranych od pacjentów, którzy poddali się resekcji chirurgicznej lub biopsji w Uniwersyteckim Szpitalu Pasteur w Nicei między marcem 207 a marcem 2016 roku. Ponadto, w celu oceny ekspresji PD-L1 w próbkach cytologi...

Aby rozszerzyć możliwości laboratoriów na całym świecie do oceny kwalifikacji pacjentów z rakiem płuc do leczenia pembrolizumabem, w wiarygodny i powtarzalny sposób, opracowaliśmy test, który wykorzystuje koncentrat przeciwciał 22C3 na powszechnie dostępnym immunohistochemicznym autostainerze, zarówno dla próbek biopsyjnych, jak i cytologicznych.

Stosowanie przeciwciała 22C3 anty-PD-L1 Skoncentruj się na próbkach biopsji i cytologii od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Metoda ta, wykorzystująca koncentrat przeciwciał 22C3 do oznaczania ekspresji PD-L1 zarówno w tkance nowotworowej, jak i w próbce cytologicznej, rozszerzy możliwości laboratoriów do oceny selekcji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca do immunoterapii w sposób wiarygodny i powtarzalny. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wysoce zgodna ze złotym standardem testu i będzie wspierać wiarygodne, wysokiej jakości testy PD-L1 w różnych regionach na całym świecie. Ogólnie rzecz biorąc, patolodzy nowicjusze w tej metodzie będą zmagać się z powodu sporadycznie obserwowanego ziarnistego barwienia.Co więcej, barwienie ludzkich komórek jest nieco bardziej intensywne niż obserwowane przy użyciu standardu złota. Dlatego konieczne jest przeszkolenie patologów, aby uzyskać prawidłową interpretację barwienia PD-L1 za pomocą LDT 22C3. Procedurę zademonstruje pani Marame Hamila, technik z mojego laboratorium. Na początek utrwal tkankę nowotworową w 10% neutralnie buforowanej formalinie w kasecie i zanurz kasetę w parafinie, jak opisano w protokole tekstowym. Osadź przesączaną tkankę w formie wypełnionej stopioną parafiną.Pozostaw tkankę w formie, aż parafina zastygnie. Następnie za pomocą mikrotomu należy przeciąć tkankę zatopioną w parafinie o grubości trzech mikrometrów. Przenieś wstęgę parafinową na dodatnio naładowane szklane szkiełko mikroskopowe.Następnie suszyć szkiełko przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Najpierw zbierz popłuczyny oskrzelowe w roztworze konserwującym. Przenieś popłuczyny do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Dodać dwa gramy DL-ditiotreitolu i wirować probówkę przez 30 minut, a następnie odwirować z prędkością 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i dodaj 10 mililitrów roztworu mukolitycznego. Wstrząsać próbką ze średnią prędkością przez 20 minut i odwirowywać 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie usunąć supernatant i umieścić osad komórkowy w probówce zbiorczej zawierającej 10% neutralnie buforowaną formalinę. Dodać cztery krople środka do przygotowania bloków komórkowych. Przenieś osad komórkowy do kasety.Utrwalić osad komórkowy do zatapiania i cięcia parafiny przy użyciu procesu opisanego wcześniej dla przygotowania próbek tkanki nowotworowej. Aby rozpocząć, włącz autostainer i komputer. Kliknij dwukrotnie ikonę autostainera i wybierz użytkownika.Kliknij Utwórz etykietę, a następnie Protokół. Kliknij dwukrotnie protokół 22C3. Wpisz identyfikator pacjenta i kliknij przycisk Drukuj.Następnie przyklej etykietę do szkiełka. Naciśnij przycisk na wybranej szufladzie przesuwnej, aby ją otworzyć i umieść opisany suwak na podkładce termicznej z etykietą skierowaną do góry i do wewnątrz. Zamknij wysuwaną szufladę.Następnie zdejmij nakrętki z dozowników. Załaduj odczynniki na stojak na odczynniki. Otwórz pokrywę barwnika i umieść stojaki na odczynniki na karuzeli z odczynnikami, upewniając się, że są prawidłowo dopasowane i utrzymują się na miejscu, a następnie zamknij kaptur.W oprogramowaniu kliknij instrument, który będzie używany, a następnie kliknij Uruchomiony. Pod koniec procedury IHC użyj wody z kranu z pojedynczą kroplą roztworu czyszczącego, aby płukać szkiełko przez kilka sekund. Odwodnić szkiełko, zanurzając je kolejno w dwóch kąpielach etanolowych na kilka sekund każda, a następnie umieść szkiełko w maszynie do szkiełek nakrywkowych, aby automatycznie załadować szkiełko nakrywkowe.Aby rozpocząć ocenę jakości barwienia PD-L1, przed badaniem próbki pacjenta należy przeanalizować kontrole dodatnie i ujemne. Za pomocą mikroskopu potwierdź obecność co najmniej 100 żywotnych komórek nowotworowych. Przy małym powiększeniu 4 razy oceń wszystkie dobrze zachowane dodatnie i ujemne obszary guza.Następnie należy ocenić częściowe lub całkowite barwienie błony komórkowej i obliczyć wynik proporcji guza, oceniając proporcję komórek nowotworowych PD-L1-dodatnich w stosunku do wszystkich komórek nowotworowych obecnych w dobrze zachowanych obszarach guza. W tym badaniu ocena proporcji guza lub TPS jest oceniana dla próbek biopsji par tkanek w blokach komórkowych przygotowanych z płukania oskrzeli lub wysięku opłucnowego. Reprezentatywne wzorce barwienia z próbkami biopsji wykorzystuje się do porównania koncentratu przeciwciała 22C3 z testem towarzyszącym PD-L1 IHC 22C3.Współczynnik korelacji wewnątrzklasowej, który służy do pomiaru korelacji wyniku TPS jako zmiennej ciągłej, wynosi 99% między LDT a złotym standardem. Reprezentatywne wzorce barwienia z próbkami cytologicznymi są również wykorzystywane do porównania koncentratu przeciwciał 22C3 z testem towarzyszącym PD-L1 IHC 22C3. Wskaźnik zgodności próbek biopsyjnych i cytologicznych z LDT jest większy niż 95% w przypadku zastosowania któregokolwiek z punktów cięcia TPS.Współczynnik korelacji wewnątrzklasowej przy użyciu TPS jako zmiennej ciągłej wynosi od 0,88 do 0,90. Po opanowaniu technika ta zapewnia wysoki wskaźnik zgodności ze złotym standardem w ocenie wartości odcięcia dla dodatniości lub histologii guza zarówno dla próbek tkankowych, jak i cytologicznych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że próbki muszą być oceniane w odniesieniu do szkiełka HE, a w niektórych trudnych przypadkach można wykonać barwienie uzupełniające w celu oceny komórek odpornościowych, aby wykluczyć błędną interpretację ekspresji PD-L1 tylko w komórkach nowotworowych.Po tej procedurze można ocenić inne próbki, takie jak biopsje cienkoigłowe, EUS-FNA lub szczoteczki oskrzelowe. Po utrwaleniu testu w klinikach należy z czasem utrzymać jego solidność poprzez ubieganie się o akredytację, przestrzeganie standardowych procedur operacyjnych oraz regularne uczestnictwo w zewnętrznych programach oceny jakości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wdrożyć zoptymalizowany protokół przy użyciu koncentratu przeciwciał anty-PD-L1 22C3 na powszechnie dostępnym autostainerze IHC, zarówno w próbkach biopsji, jak i cytologii od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca.

using-22c3-anti-pd-l1-antibody-concentrate-on-biopsy-cytology-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje test immunofluorescencji krążących komórek nowotworowych (CTC), technikę charakteryzowania biomarkerów na krążących komórkach nowotworowych w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc. Test ten może być stosowany do monitorowania dynamicznych zmian guza i odpowiedzi immunologicznej, która może odzwierciedlać odpowiedź na chemioterapię, radioterapię i możliwe leczenie immunoterapeutyczne.

Test immunofluorescencji CTC: technika charakteryzowania krążących komórek nowotworowych

Ten protokół opisuje przygotowanie próbek guzów z parafiną utrwalonymi w formalinie, które są używane do zachowania tkanek i próbek cytologicznych z niedrobnokomórkowego raka płuc...

Przygotowanie próbek guzów zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie: protokół ochrony próbek tkanek i cytologii przed niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC)

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Ten artykuł ma na celu opisanie stopniowego podejścia do wykonywania bronchoskopii wspomaganej robotem w połączeniu z fluoroskopią, ultrasonografią promieniową wewnątrzoskrzelową i tomografią komputerową wiązką stożkową w celu uzyskania celowanej przezoskrzelowej kriobiopsji płuc.

Bronchoskopia wspomagana robotycznie w połączeniu z obrazowaniem multimodalnym do celowanych kriobiopsji płuc

Ten manuskrypt opisuje procedury operacyjne i środki ostrożności mające na celu zbadanie potencjalnych powszechnych mechanizmów patogennych łączących pierwotny zespół Sjögrena z gruczolakorakiem płuc poprzez analizę bioinformatyczną i weryfikację eksperymentalną.

Pierwotny zespół Sjögrena związany z gruczolakorakiem płuc: badanie potencjalnych powszechnych mechanizmów patogennych i weryfikacja eksperymentalna

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Poznaj metodę oceny ekspresji PD-L1 za pomocą przeciwciała 22C3 w biopsjach i materiale cytologicznym od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Technika ta zapewnia wysoką zgodność ze złotym standardem i wspiera niezawodną selekcję pacjentów do immunoterapii na całym świecie.

Stosowanie przeciwciała 22C3 anty-PD-L1 Skoncentruj się na próbkach biopsji i cytologii od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (Wideo) | JoVE Journal

Stosowanie przeciwciała 22C3 anty-PD-L1 Skoncentruj się na próbkach biopsji i cytologii od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca

Przeglądaj więcej filmów