Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania badawcze w neurobiologii, onkologii i nie tylko, takie jak ekspresja specyficzna dla typu komórki i mapowanie przestrzenne wariantów splicingu w mikrośrodowiskach mózgu i guza. Główną zaletą tej techniki jest to, że może wykrywać połączenia eksonowe, krótkie sekwencje i mutacje punktowe w kontekście tkankowym z bardzo wysoką czułością i swoistością w pojedynczych komórkach. Procedurę zademonstruje Hell Pimentel, naukowiec z naszego laboratorium.

Aby przygotować tkankę, utrwal ją natychmiast po rozbiorze w 10% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze pokojowej przez 16 do 32 godzin. Następnie próbka jest przetwarzana i zatapiana w parafinie przy użyciu standardowych procedur. Pokrój osadzoną tkankę na pięć odcinków plus minus jeden mikron za pomocą mikrotomu.

Zamontuj sekcje na szkiełkach elektrostatycznie przyklejonych i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez noc. Na godzinę przed wykonaniem testu hybrydyzacji RNA NC2 umieść zamontowane szkiełka tkankowe w stojaku na szkiełka i upiecz w piecu z krążącym powietrzem w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem testu hybrydyzacji RNA NC2 upewnij się, że piec do hybrydyzacji jest ustawiony na 40 stopni Celsjusza.

Dokładnie zwilż papier nawilżający, usuń resztki wody i umieść pokrywkę na tacy kontrolującej wilgotność. Przygotuj 200 mililitrów dostępnego w handlu odczynnika do odzyskiwania celu 1X, dodając 20 mililitrów odczynnika do odzyskiwania celu 10X do 180 mililitrów wody. Umieść dwa uchwyty na szkiełka w naczyniu do gotowania na parze.

Napełnij jeden uchwyt szkiełka 200 mililitrami odczynnika do odzyskiwania celu 1X, a drugi 200 mililitrami wody. Za pomocą parowaru podgrzej oba roztwory do wrzenia. Podgrzej bufor myjący 50X do 40 stopni Celsjusza przez 10 do 20 minut.

Następnie przygotuj trzy litry buforu do mycia 1X, rozcieńczając 60 mililitrów wstępnie podgrzanego buforu do mycia 50X z 2,94 litra wody. W dygestorium przygotuj 50% roztworu przeciwbarwiącego hematoksylinę Gilla, dodając 100 mililitrów hematoksyliny Gilla do 100 mililitrów wody. Przygotuj odczynnik do niebieszczenia, dodając 1,43 mililitra 20 do 30% wodorotlenku amonu do 250 mililitrów wody.

Rozgrzej sondy docelowe w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 10 minut przed hybrydyzacją sondy. Doprowadź siedem odczynników wzmacniających, Amp 0 do 6, do temperatury pokojowej. Rozpocząć deperycynizację próbki, wyjmując skrawki z pieca i zanurzając zamontowane szkiełka tkankowe w ksylenie z mieszaniem na pięć minut.

Ponownie depacycynuj w świeżym ksylenie przez pięć minut. Odwodnić w 100% etanolu z mieszaniem przez dwie minuty. I powtórz ponownie w świeżym 100% etanolu przez dwie minuty.

Suszyć szkiełka na powietrzu w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku z obiegiem powietrza przez pięć minut, aż całkowicie wyschną. Następnie inkubuj skrawki z około czterema kroplami gotowego do użycia nadtlenku wodoru w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby ugasić aktywność endogennej peroksydazy. Zdekantować roztwór ze szkiełek i spłukać je dwukrotnie wodą.

Na krótko zanurz skrawki w podgrzanej wodzie, a następnie umieść je w 200 mililitrach odczynnika do pobierania celu w temperaturze 100 stopni Celsjusza w parowarze na 15 do 30 minut. Wyjmij szkiełka z docelowego wyjmowania i dwukrotnie spłucz w wodzie. Zanurz w 100% etanolu na trzy minuty.

Następnie wysuszyć szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku z obiegiem powietrza, aż do całkowitego wyschnięcia. Po wyschnięciu szkiełek użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować hydrofobową barierę o wymiarach około 0.75 na 0.75 cala wokół sekcji. Pozostaw barierę do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej na jedną minutę.

Umieść szkiełka w uchwycie na szkiełka i umieść uchwyt na szkiełka w wstępnie podgrzanej tacy o kontrolowanej wilgotności. Dodaj około czterech kropli proteazy 3 do każdego szkiełka i inkubuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji przez 15 do 30 minut. Zdekantować roztwór ze szkiełek i spłukać je dwukrotnie wodą.

Aby rozpocząć procedurę hybrydyzacji sondy, dodaj około czterech kropli odpowiedniego, gotowego do użycia roztworu sondy, aby pokryć cały przekrój. Hybrydyzuj sondy w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji przez dwie godziny. Zdekantować roztwór ze szkiełek i umyć szkiełka w 200 mililitrach buforu do płukania 1X w temperaturze pokojowej z okazjonalnym mieszaniem przez dwie minuty.

Powtórz procedurę prania. Następnym krokiem jest wzmocnienie sygnału poprzez inkubację sekcji w serii odczynników wzmacniających. Dodaj około czterech kropli Amp 0, aby pokryć całą sekcję na każdym szkiełku i inkubować w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji przez 30 minut.

Następnie zdekantować roztwór i umyć szkiełka w 200 mililitrach buforu do płukania 1X w temperaturze pokojowej z okazjonalnym mieszaniem przez dwie minuty. Powtórz procedurę prania. W ten sam sposób inkubuj sekcje w Amp 1 do Amp 6 w temperaturze i przez czas wskazany na tym schemacie.

Po potraktowaniu szkiełek serią odczynników do amplifikacji, należy przygotować roztwór roboczy barwnika Fast Red. Dodaj odpowiednią objętość barwnika Fast Red-B i barwnika Fast Red-A do probówki i dobrze wymieszaj. Zdekantować nadmiar płynu ze szkiełek i dodać do szkiełek roztwór roboczy barwnika Fast Red.

Inkubować szkiełka na tacy z przykryciem w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po 10 minutach zdekantuj roztwór Fast Red i dwukrotnie opłucz szkiełka, zanurzając je w wodzie z kranu. Aby przeciwdziałać przebarwieniom skrawków tkanki, zanurz szkiełka w roztworze hematoksyliny 50% Gill w temperaturze pokojowej na dwie minuty.

Umyj szkiełka wodą z kranu, powtarzając to kilka razy, aż szkiełka będą czyste, podczas gdy sekcje pozostaną fioletowe. Zanurz szkiełka w 02% wodzie amoniakalnej dwa do trzech razy, aby uzyskać niebieszczenie. Zastąp wodę amoniakalną wodą z kranu i umyj szkiełka trzy do pięciu razy.

Suszyć szkiełka w piekarniku z obiegiem powietrza w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut, aż całkowicie wyschną. Umieść jedną lub dwie krople odczynnika montażowego na szkiełku nakrywkowym i umieść szkiełko na szkiełku nakrywkowym, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza. Suszyć szkiełka na powietrzu przez co najmniej pięć minut.

Na koniec obserwuj szkiełka pod standardowym mikroskopem jasnego pola. Sondy ze złączem eksonowym Double-Z zostały zaprojektowane do określania statusu EGFRvIII w dwóch próbkach zatopionych w parafinie w formalinie lub glejakach wielopostaciowych FFPE. Obie sondy typu dzikiego wykryły sygnał w obu próbkach, co wskazuje, że dwie próbki wyrażają EGFR typu dzikiego.

Jednak zmutowana sonda wykryła sygnał tylko w próbce dodatniej EGFRvIII, a nie w próbce ujemnej EGFRvIII. Do testu włączono sondy kontroli dodatniej i ujemnej. Kiedy przeprowadzono krótki test docelowy na komórkach Jurkat, przygotowanych jako osad komórek FFPE przy użyciu sond antysensownych lub zmysłowych, celujących w sekwencje na czerwono, zaobserwowano silne barwienie za pomocą sond antysensownych zarówno dla CDR3-alfa, jak i CDR3-beta, podczas gdy sondy wykrywały niewielki lub żaden sygnał.

dapB stosowano jako kontrolę ujemną. Test jest również w stanie wykryć mutacje punktowe. W tym przykładzie zaprojektowano dwie sondy, jedną do wykrywania zmutowanej sekwencji EGFR L858R, a drugą do wykrywania sekwencji EGFR L858 typu dzikiego.

Zmutowana sonda wykryła sygnał w linii komórkowej H1975, która jest heterozygotyczna pod względem mutacji EGFR L858R, ale nie wykryła sygnału w linii komórkowej H2229, która wyraża tylko EGFR L858 typu dzikiego. Sonda typu dzikiego wykryła sygnał w obu liniach komórkowych. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym utrwaleniu tkanek, uruchomieniu dodatnich i ujemnych sond kontrolnych oraz użyciu systemu przetwarzania szkiełek w piecu do hybrydyzacji.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak IHC z markerami komórkowymi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja specyficznej dla typu komórki ekspresji wariantów splicingu lub krótkich sekwencji docelowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii, onkologii i nie tylko do badania alternatywnych zdarzeń splicingu w kontekście tkankowym, identyfikacji przestrzennie mapowanych mutacji punktowych i wizualizacji wysoce homologicznych i krótkich sekwencji in situ. Nie zapominaj, że praca z neutralną buforowaną formaliną i ksylenem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem i noszenie środków ochrony osobistej.