Name: Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę wykrywania aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej in vitro przy użyciu enzymu Mod5 z drożdży. Prosty test biochemiczny pozwala badać modyfikacje RNA i charakteryzować enzymy modyfikujące RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Dr. Davidowi Engelke za jego wskazówki i pomocne komentarze na temat tego manuskryptu. PJS - fundusze startowe laboratorium Ball State University; DAB - dotacja 1R15AI130950-01.

UWAGA: Protokół został zaadaptowany z Ref. 24.
1. Uzyskaj RNA i enzym będący przedmiotem zainteresowania
<ol>
	<li>Użyj transkrybowanych in vitro RNA wewnętrznie znakowanych 32P i rekombinowanego His6-Mod5 wyrażonego i oczyszczonego z E. coli, jak opisano wcześniej24.
	<ol>
		<li>Wprowadzić transkrybowane RNA in vitro (sekcja 3) przy użyciu polimerazy RNA T7 w obecności nieznakowanych ATP, UTP, CTP, GTP i 10 μCi oczyszczonego żelem, wytrąconego etanolem α-ATP, ponownie zawieszonego w 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) i przechowywanego w temperaturze -80 °C24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, uzyskaj komercyjnie dostępne, znakowane fluorescencyjnie RNA, które Cię interesują. Wytworzyć interesujący enzym (enzymy) w dowolnym preferowanym systemie ekspresji. 
	Uwaga: Wewnętrzne znaczniki fluorescencyjne w RNA mogą zmieniać strukturę RNA i rozpoznawanie przez enzymy.</li>
</ol>
2. Przygotuj 20% poliakryloamidowy żel do denaturacji
Uwaga: Aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość fragmentów RNA, zalecany jest pionowy żel do płyt o długości 40 cm. Szerokość użytego żelu zależy od liczby próbek, które mają być analizowane.
<ol>
	<li>Dokładnie wyczyść szklane płytki. Najpierw umyj wodą z mydłem, dobrze spłucz wodą dejonizowaną, a na koniec wyczyść izopropanolem i niestrzępiącymi się chusteczkami.</li>
	<li>Zamontuj płyty i przekładki.</li>
	<li>Wymieszaj następujące odczynniki, aby uzyskać 100 ml 20% akrylamidu, 7,5 M mocznika, 1x żel TBE: 80 ml koncentratu żelu mocznikowego (237,5 g/L akrylamidu, 12,5 g/L bisakryloamidu metylenu, 7,5 M mocznika w wodzie dejonizowanej), 10 ml rozcieńczalnika w żelu mocznikowym (7,5 M mocznika w wodzie dejonizowanej) i 10 ml buforu w żelu mocznikowym (0,89 M tris-boran-20 mM bufor EDTA pH 8,3 i 7,5 M mocznik). 
	UWAGA: Objętość roztworu żelu należy dostosować do wymiarów żelu.</li>
	<li>Dodać 40 μl N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 800 μl świeżo przygotowanego 10% nadsiarczanu amonu (APS).</li>
	<li>Nabrać roztwór żelu do dużej strzykawki i rozlać między szklanymi płytkami. Stuknij palcami w szkło podczas nalewania, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.</li>
	<li>Pozostaw żel do zastygnięcia na 30 minut.</li>
	<li>Zaciskać zestalony żel na pionowym aparacie żelowym za pomocą spinaczy do segregatorów.</li>
	<li>Napełnij górną i dolną komorę buforową 1x TBE.</li>
	<li>Dwie godziny przed załadowaniem żelu należy wstępnie uruchomić żel pod ciśnieniem 20 mA przez 2 godziny, aby granica bufora mogła wyprzedzić najmniejsze oligonukleotydy - w przeciwnym razie najmniejsze nukleotydy i oligonukleotydy mają tendencję do zapadania się na froncie buforu.</li>
</ol>
3. Test izopentenylacji RNA
<ol>
	<li>Przygotuj reakcje w końcowej objętości 17 μl, zawierającej 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 U inhibitora RNazy (np. SuperRNaseIn), 40 000 CPM wewnętrznie 32znakowanego P RNA, 5,3 μM Mod5 i 1,2 mM 2-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wytrącić RNA z osadu etanolu za pomocą 2,5 objętości (42,5 μl) 100% etanolu i 1/10 objętości (1,7 μl) 3,5 M octanu sodu o pH 5,5 i umieścić w temperaturze -20 °C na 1 godzinę lub na noc.</li>
	<li>Odwirować próbki RNA przez 20 minut w temperaturze 15 400 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarat nadnaturalny i przemyć osad RNA 500 μl 70% etanolu.</li>
	<li>Odwirować próbki przez 5 minut 15 400 x g w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i suche na powietrzu granulki RNA przez 15 minut lub do momentu, gdy cały etanol wyparuje.</li>
	<li>Zawiesić granulki RNA w 10 μl 8 M mocznika</li>.
	<li>Dodać 150 j. RNazy T1 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Dodać 2 μl 6x buforu ładującego (60% glicerolu, 0,1% cyjanolu ksylenowego).</li>
	<li>Załadować 10 μl każdej próbki RNA na wstępny przebieg, 20% poliakrylamid, 7,5 M żel mocznikowy (patrz sekcja 2 Protokołu). 
	UWAGA: Drabinki o rozmiarach RNA znakowane radioaktywnie mogą być dołączone jako dodatkowy znacznik mobilności.</li>
	<li>Uruchom żel przez 2 godziny przy 25 mA.</li>
	<li>Zatrzymać żel i wyjąć z aparatu.</li>
	<li>Zerwać uszczelkę między dwiema szklanymi płytkami i usunąć jedną ze szklanych płytek, pozostawiając żel na "dolnej" płytce. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie rozerwać żelu na tym etapie.</li>
	<li>Na żel nałożyć warstwę folii foliowej i naświetlić na ekranie luminoforowym przez 3 godziny. Alternatywnie umieścić żel na bibule chromatograficznej i wysuszyć w suszarce do żelu przed ekspozycją na ekran fosforowy.</li>
	<li>Obraz ekranu luminoforowego na imagerze luminoforowym.</li>
</ol>

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li>
<li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li>
<li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+modification+of+transfer+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li>
<li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li>
<li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li>
<li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li>
<li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li>
<li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li>
<li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+MOD5%2C+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li>
<li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li>
<li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li>
<li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li>
<li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+%28TRIT1%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutations%22%5BJournal%5D)">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li>
<li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424(2014).</li>
<li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li>
<li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3%27+untranslated+region+of+TRIT1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009(2015).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1%2C+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients%27+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li>
<li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li>
<li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tRNA-modifying+protein%2C+TRIT1%2C+forms+amyloid+fibers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23716598">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li>
<li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li>
<li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li>
<li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N%281%29-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+reveals+a+conserved%2C+widespread%2C+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li>
<li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053(2011).</li>
<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li>
</ol>

Brak do ujawnienia.

Wykazano, że modyfikacje RNA odgrywają coraz ważniejszą i bardziej różnorodną rolę w funkcjonowaniu komórek i organizmów. W związku z tym opracowanie testów do badania enzymów modyfikujących RNA ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia podstawowych aspektów biologii. Protokół ten opisuje test in vitro o wysokiej rozdzielczości w celu scharakteryzowania aktywności modyfikacji tRNA Mod5.
Protokół ten ma tę wyraźną zaletę, że zapewnia bezpośredni i łatwy do interpretacji odczyt izo...

Zidentyfikowano co najmniej 163 różne posttranskrypcyjne modyfikacje RNA, przy czym te modyfikacje nadają RNA różnorodne i zależne od kontekstu funkcje, bezpośrednio wpływając na strukturę RNA i wpływając na interakcje RNA z innymi cząsteczkami1,2. Wraz ze wzrostem docenienia liczby i różnorodności modyfikacji RNA, kluczowe znaczenie ma opracowanie testów, które mogą wiarygodnie badać zarówno modyfikacje RNA, jak i enzymy, które je katalizują.
Jedna z pierwszych modyfikacji RNA, które zostały zidentyfikowane, występuje w bazie 37 w tRNA, w sąsiedztwie antykodonu po stronie 3'3,4. Grupa izopentenylowa jest przenoszona z dimetyloallopirofosforanu (DMAPP) do pozycji N6 adenozyny 37 (i6A37) 3,5 na podzbiorze zarówno cytoplazmatycznych, jak i mitochondrialnych tRNA. i6A37 poprawia wierność i wydajność translacji poprzez zwiększenie powinowactwa tRNA do rybosomów4,6 i i i6A37 jest ważne dla reakcji na stres u bakterii7. Enzymy, które dokonują tej modyfikacji, są określane jako transferazy iopentenylowe tRNA i są wysoce konserwatywne w bakteriach8,9, fungi10, worms11, plants12, and higher eukariontes13, including humans14.
Mutacje w ludzkim genie transferazy tRNA, TRIT1, są związane z chorobami ludzkimi. Na przykład mutacja w TRIT1 jest skorelowana z ciężką chorobą mitochondrialną, prawdopodobnie spowodowaną defektem syntezy białek mitochondrialnych15,16. Co więcej, TRIT1 został opisany jako gen supresorowy nowotworu17,18 i jest związany z kilkoma typami nowotworów, w tym czerniakiem19, breast20, gastric21 i lung cancers22,23. Wreszcie, transferazy opentenylowe TRIT1 i Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) są białkami podatnymi na agregację, które tworzą włókna amyloidowe podobne do prionów24,25,26. Obserwacje te potencjalnie sugerują isopentenylotransferazy tRNA w chorobach neurodegeneracyjnych, chociaż bezpośrednie dowody na to nie zostały jeszcze pokazane.
Biorąc pod uwagę rolę, jaką transferazy isopentenylowe odgrywają w translacji i chorobie, metody bezpośrednio mierzące aktywność transferazy izopentenylowej i6A są ważne dla mechanistycznego zrozumienia tych enzymów w stanach normalnych i chorobowych. Dostępnych jest coraz więcej metod wykrywania modyfikacji RNA i6A, w tym testy izopentenylacji in vitro, dodatnia hybrydyzacja przy braku testów i6A (PHA6), chromatografia cienkowarstwowa (TLC), testy aktywności akceptacji aminokwasów i podejścia spektrometrii mas (Przegląd w Ref. 4).
Opisano test in vitro isopentenylacji, który wykorzystuje 14C-DMAPP i nieznakowane tRNA. W tym teście radioaktywny węgiel jest przenoszony do RNA z 14C-DMAPP przez transferazę izopentenylową. Chociaż ten test jest bardzo czuły, często trudno jest określić konkretną pozostałość, która jest modyfikowana9,20,27. Testy PHA6 opierają się na masywnej modyfikacjii 6A zakłócającej hybrydyzację sondy znakowanej 32P, obejmującej zmodyfikowaną pozostałość. W związku z tym hybrydyzacja jest większa w przypadku braku modyfikacji i6A18,28,29. Testy PHA6 są bardzo czułe i zdolne do analizy całkowitego RNA wyekstrahowanego z lizatów komórkowych. Dodatkowo, możliwość projektowania sond specyficznych dla interesującego RNA daje tej metodzie znaczną elastyczność docelową. Jednak testy PHA6 ograniczają się do charakterystyki modyfikacji, które zachodzą na pozostałościach w docelowym regionie sondy, a zatem są mniej prawdopodobne, aby zidentyfikować nowe miejsca modyfikacji. Ponadto, ponieważ brak wiązania wskazuje na modyfikację, inne modyfikacje lub mutacje, które wpływają na wiązanie RNA, zakłócą analizę danych.
Inne podejście łączy chromatografię celulozową z benzylu DEAE (BD) z aktywnością akceptacji aminokwasów jako odczyt modyfikacji i6A w tRNA30. Podejście to bezpośrednio bada funkcję modyfikacji i6A, ale jest to pośrednie podejście do wykrywania modyfikacji i6A i brakuje rozdzielczości do mapowania modyfikacji określonej reszty w RNA. Do wykrycia całkowitych modyfikacji tRNA i6A zastosowano podejście TLC. W tym podejściu wewnętrznie 32tRNA znakowane P są trawione do pojedynczych nukleotydów, a dwuwymiarowa analiza TLC służy do identyfikacji izopentenylacji. Podejście to jest bardzo czułe w wykrywaniu całkowitej ilości i6A w danej próbce RNA, ale po trawieniu wszystkie informacje o sekwencji są tracone; W związku z tym badacz nie ma możliwości określenia, które pozostałości zostały zmodyfikowane31.
Ostatnio opracowano metody chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS), które ilościowo porównują całkowite modyfikacje RNA między gatunkami, typami komórek i warunkami eksperymentalnymi32,33,34. Ograniczeniem tej metodologii jest to, że jest ona mniej zdolna do określenia tożsamości i pozycji w RNA, z którego pochodził zmodyfikowany nukleozyd34. Co więcej, wiedza specjalistyczna i sprzęt niezbędne do przeprowadzenia tych eksperymentów ograniczają praktyczność tego podejścia.
Ponadto, opracowano kilka technologii sekwencjonowania nowej generacji do mapowania modyfikacji RNA w całym transkryptomie34. Immunoprecypitacja RNA z przeciwciałami specyficznymi dla określonej modyfikacji (RIP-Seq) umożliwia badaczowi zidentyfikowanie wszystkich sekwencji zawierających określoną modyfikację35,36. Ponadto podejścia oparte na odwrotnej transkryptazie, takie jak Chem-Seq i sekwencjonowanie nielosowych niezgodności, opierają się na zaburzeniach reakcji odwrotnej transkrypcji w zmodyfikowanych resztach37,38,39. Pomimo przewagi tych technik do mapowania modyfikacji RNA w całym transkryptomie, technologie RIP-seq i Chem-Seq są ograniczone przez brak wiarygodnych przeciwciał lub reaktywnych substancji chemicznych dostępnych odpowiednio dla każdej specyficznej modyfikacji34. Co więcej, enzymy odwrotnej transkryptazy wymagane do wykonywania technik sekwencjonowania Chem-Seq i nielosowych niedopasowań mogą być hamowane przez stabilne struktury RNA. Wysoce zmodyfikowany i stabilny strukturalnie charakter tRNA sprawia, że są one szczególnie trudne do zbadania przy użyciu tych technik. Do tej pory technologie oparte na sekwencjonowaniu nowej generacji nie zostały jeszcze wykorzystane do mapowania i6A modifications34.
Tutaj opisujemy proste i bezpośrednie podejście do wykrywania modyfikacji i6A tRNA in vitro. Metoda ta wykorzystuje inkubację RNA z rekombinowaną izopentenylotransferazą S. cerevisiae (Mod5), a następnie trawienie RNazy T1 i 1-wymiarową analizę elektroforezy żelowej w celu zmapowania modyfikacji6A. Takie podejście jest bezpośrednie i wymaga niewielkiej specjalistycznej wiedzy specjalistycznej do analizy danych. Co więcej, metodę tę można dostosować do innych enzymów modyfikujących RNA, w tym enzymów, które kowalencyjnie zmieniają masę cząsteczkową RNA lub ruchliwość RNA przez żel.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UreaGel Concentrate</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>W zestawie</td></tr><tr><td>UreaGel Diluent</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>W ramach zestawu</td></tr><tr><td>UreaGel Buffer</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>W zestawie</td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>W ramach zestawu</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyloethelenodiamina (TMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>DMAPP</td><td>Caymen Chemical</td><td>1186-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Super RNaseIN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza T1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt i materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krótkie płytki szklane (20-40 cm szer. x 40 cm dł.)</td> <td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Długie szklane płytki (20-40 cm szer. x 40 cm dł.)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy aparat żelowy</td><td>The Gel Company</td><td>S2-3040</td><td></td></tr><tr><td>50 ml jednorazowa strzykawka</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-26</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do segregatorów ze stali nierdzewnej</td><td>Idea Scientific</td><td>1066</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoscreen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Folia (</td><td>lokalny sklep spożywczy)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy trna-izopentenylowej

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Nmodyfikacje RNA 6-isopentenyloadenozyny są funkcjonalnie zróżnicowane i wysoce konserwatywne wśród prokariontów i eukariontów. Jedna z najbardziej konserwatywnych modyfikacji N 6-izopentenyloadenozyny zachodzi w pozycji A37 w podzbiorze tRNA. Ta modyfikacja poprawia wydajność i wierność translacji poprzez zwiększenie powinowactwa tRNA do rybosomu. Mutacje enzymów odpowiedzialnych za tę modyfikację u eukariontów są związane z kilkoma stanami chorobowymi, w tym dysfunkcją mitochondriów i rakiem. Dlatego zrozumienie specyficzności substratowej i aktywności biochemicznej tych enzymów jest ważne dla zrozumienia normalnej i patologicznej biologii eukariotycznej. Do scharakteryzowania modyfikacjii 6A zastosowano różnorodny wachlarz metod. W niniejszym artykule opisano bezpośrednie podejście do wykrywania izopentenylacji przez Mod5. Metoda ta wykorzystuje inkubację RNA z rekombinowaną transferazą izopentenylową, a następnie trawienie RNazy T1 i jednowymiarową analizę elektroforezy żelowej w celu wykrycia modyfikacji i6A. Ponadto omówiono potencjalną zdolność adaptacyjną tego protokołu do charakteryzowania innych enzymów modyfikujących RNA.

Mod5 inkubowano z tRNA tyrozyny lub tRNA seryny w obecności lub w braku DMAPP. Po reakcji modyfikacji produkty trawiono RNazą T1, która rozcina koniec 3' wszystkich guanozyn, pozostawiając 3'-monofosforany guanozyny (GMP)24 (Rysunek 1). Pełne trawienie RNA daje przewidywalny wzór fragmentów znakowanych izotopowo (Rysunek 2A), które następnie rozdzielano na 20% denaturującym żelu poliakrylo...

Tutaj opisujemy protokół charakterystyki biochemicznej enzymu modyfikującego RNA drożdży, Mod5, i omawiamy, jak ten protokół mógłby być zastosowany do innych enzymów modyfikujących RNA.

Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Ogólnym celem tego protokołu jest biochemiczne scharakteryzowanie aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej in vitro. Metoda ta jest przydatna do wykrywania in vitro i charakteryzowania aktywności tRNA-izopentenylotransferazy oczyszczonych enzymów rekombinowanych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty i bezpośredni test stosowany do wykrywania kowalencyjnej modyfikacji RNA.Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w aktywność transferazy tRNA-izopentenylu, można ją potencjalnie dostosować do biochemicznej charakterystyki szerokiego zakresu enzymów modyfikujących RNA. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest dokładne oczyszczenie szklanych płytek, które będą używane do odlewania żelu. Umyj talerze wodą z mydłem, dobrze spłucz wodą dejonizowaną, a następnie wyczyść płytki izopropanolem i niestrzępiącymi się chusteczkami.Następnie zmontuj płyty i przekładki. Wymieszaj następujące odczynniki, aby uzyskać 100 mililitrów 20% akrylamidu, 7,5 molowego mocznika, 1x żel TBE. 80 mililitrów koncentratu żelu mocznikowego, 10 mililitrów rozcieńczalnika w żelu mocznikowym i 10 mililitrów buforu żelu mocznikowego.Do mieszaniny dodać 40 mikrolitrów T-med i 800 mikrolitrów świeżo przygotowan

an-in-vitro-assay-to-detect-trna-isopentenyl-transferase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Próby wyizolowania podjednostki katalitycznej telomerazy, TERT, w ilościach wystarczających do badań strukturalnych, przez ponad dekadę przynosiły ograniczone rezultaty. W niniejszej pracy przedstawiamy metody izolacji rekombinowanej białka TERT z Tribolium castaneum (TcTERT) oraz rekonstrukcji aktywnego kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) telomerazy T. castaneum in vitro.

In vitro Rekonstytucja aktywnej telomerazy T. castaneum

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorofenylcorol i jego wolnozasadowy analog wykazują niską cytotoksyczność komórek mikromolowych. W tym artykule opisano reakcję transkrypcji RNA, obrazowanie RNA za pomocą żelu barwionego bromkiem etydyny oraz ilościowe oznaczanie RNA za pomocą spektroskopii UV-Vis, w celu oceny hamowania transkrypcji przez korole i demonstruje prostą metodę oceny właściwości kandydatów przeciwnowotworowych.

Test enzymatyczny in vitro do pomiaru hamowania transkrypcji przez korole galu(III) i H3 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

A przedstawiono protokół produkcji tRNA(UUU) i analizy tRNA(UUU) w kompleksie z enzymem TcdA za pomocą testów opóźniających działanie żelu agarozowego.

Testy opóźnienia w żelu agarozowym białko-tRNA do analizy funkcji TcdA N 6-treonylokarbamoiloloadenozyny

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Poznaj metodę wykrywania aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej in vitro przy użyciu enzymu Mod5 z drożdży. Prosty test biochemiczny pozwala badać modyfikacje RNA i charakteryzować enzymy modyfikujące RNA.

Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej

Przeglądaj więcej filmów