Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej

Ogólnym celem tego protokołu jest biochemiczne scharakteryzowanie aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej in vitro. Metoda ta jest przydatna do wykrywania in vitro i charakteryzowania aktywności tRNA-izopentenylotransferazy oczyszczonych enzymów rekombinowanych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty i bezpośredni test stosowany do wykrywania kowalencyjnej modyfikacji RNA.

Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w aktywność transferazy tRNA-izopentenylu, można ją potencjalnie dostosować do biochemicznej charakterystyki szerokiego zakresu enzymów modyfikujących RNA. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest dokładne oczyszczenie szklanych płytek, które będą używane do odlewania żelu. Umyj talerze wodą z mydłem, dobrze spłucz wodą dejonizowaną, a następnie wyczyść płytki izopropanolem i niestrzępiącymi się chusteczkami.

Następnie zmontuj płyty i przekładki. Wymieszaj następujące odczynniki, aby uzyskać 100 mililitrów 20% akrylamidu, 7,5 molowego mocznika, 1x żel TBE. 80 mililitrów koncentratu żelu mocznikowego, 10 mililitrów rozcieńczalnika w żelu mocznikowym i 10 mililitrów buforu żelu mocznikowego.

Do mieszaniny dodać 40 mikrolitrów T-med i 800 mikrolitrów świeżo przygotowanego 10% nadsiarczanu amonu. Pobrać roztwór żelu do dużej strzykawki i dozować roztwór żelu między szklanymi płytkami, stukając w szkło podczas dozowania roztworu, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Pozostaw żel do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po zestaleniu się żelu umieść żel na pionowym aparacie żelowym. Napełnij górną i dolną komorę buforową 1x TBE. Dwie godziny przed załadowaniem żelu należy wstępnie uruchomić żel przy natężeniu 20 miliamperów przez dwie godziny, aby umożliwić granicy buforu przepuszczenie najmniejszych oligonukleotydów.

Przygotuj każdą reakcję do testu izopentenylacji RNA w końcowej objętości 17 mikrolitrów. Dodaj do każdej probówki 50 milimolowych Tris-HCl, pH 7,2, 1,2 milimolowego ATP, 5,8 milimolowego chlorku magnezu, 0,2 milimolowego DMAPP, 10 jednostek inhibitora RNazy, 40 000 CPM wewnętrznie znakowanego 32P RNA, 5,3 mikromolowego Mod5 i 1,2 milimolowego 2-merkaptoetanolu. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po godzinie etanol wytrącić RNazę za pomocą 2,5 objętości 100% etanolu i 1/10 objętości 3,5 molowego octanu sodu o pH 5,5 i umieścić go w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza na jedną godzinę przez noc. Następnie odwiruj próbki RNA w temperaturze 15, 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Ostrożnie usunąć sklarat i umyć każdą osadkę RNA 500 mikrolitrami 70% etanolu.

Odwirować próbki w temperaturze 15, 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i wysuszyć granulki RNA na powietrzu przez 15 minut lub do momentu, gdy cały etanol odparuje. Następnie ponownie zawiesić każdą osadkę RNA w 10 mikrolitrach ośmiu molowych moczników.

Dodaj 150 jednostek RNazy T1 do każdej próbki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodaj dwa mikrolitry 6-krotnego buforu ładującego do każdej próbki. Załaduj 10 mikrolitrów każdej próbki RNA na wstępny przebieg, 20% poliakryloamid, 7,5-molowy żel mocznikowy.

Uruchom żel z prędkością 25 miliamperów przez dwie godziny. Po dwóch godzinach przerwij elektroforezę i usuń żel z aparatu. Zerwij uszczelkę między dwiema szklanymi płytkami i ostrożnie wyjmij jedną ze szklanych płytek z żelem pozostałym na każdej płytce.

Umieść warstwę folii plastikowej na żelu i wystaw na ekranie fosforowym przez trzy godziny. Protokół ten niezawodnie wykrywa isopentenylację zarówno kanonicznych, jak i niekanonicznych reszt tRNA zmodyfikowanych przez S.cerevisiae isopentenyl tranferazy Mod5. W tym przykładzie tRNA tyrozyny było wewnętrznie znakowane 32P-adenozyną, a Mod5 inkubowano z RNazą w obecności lub bez DMAPP.

RNA trawiono RNazą T1 i rozpuszczano na denaturującym żelu poliakrylamidowym. Mod5 modyfikuje przewidywaną resztę w obecności DMAPP i wskazuje na to przesunięty 10 nukleotydów, potrójny fragment zawierający adenozynę w pozycjach nukleozydów od 36 do 38 zawiera fragment w tRNA tyrozyny. Zmodyfikowana adenozyna 37 jest oznaczona gwiazdką.

Podobnie, gdy tRNA seryny jest inkubowane z Mod5 i DMAPP, obserwuje się całkowite przesunięcie fragmentu 10 nukleotydów zawierających potrójną adenozynę w pozycji nukleozydów od 36 do 38. Co ciekawe, obserwuje się częściowe przesunięcie fragmentu siedmiu nukleotydów, który nie zawiera fragmentu zawierającego potrójną adenozynę w pozycjach nukleozydów od 36 do 38, co sugeruje, że fragment zawierający potrójną adenozynę w sekwencji i strukturze nukleozydu od 36 do 38 może nie być wymagany do aktywności Mod5 in vitro. Po opanowaniu tej techniki zajmie dwa, cztery do sześciu godzin dziennie, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu i monitorowaniu integralności RNA, ponieważ degradacja RNA może wpłynąć na modyfikację RNA i zakłócić interpretację danych. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić badania mutacyjne z użyciem enzymu będącego przedmiotem zainteresowania w celu określenia określonych reszt lub domen wymaganych do aktywności enzymatycznej. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii RNA, czyli aktywności tRNA-izopentenylotransferazy enzymów prokariotycznych i eukariotycznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić protokół wykrywania aktywności transferazy izopentenylowej interesującego Cię enzymu. Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej, stosowanie odpowiednich osłon i prawidłowe usuwanie radioaktywności.