Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii owadów, takie jak, czy wszystkie geny detoksykacji metabolicznej wyrażają się w oporności na środki owadobójcze? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wytwarzanie większych skal białek oraz charakteryzowanie funkcji tych białek w metabolizowaniu insektycydów in vitro. Procedury zademonstruje Xuechun Feng, doktorant w moim laboratorium.

Badania doktoranckie Xuechen koncentrują się na charakterystyce funkcji esterazy karboksylowej w odporności muszek domowych na pasożyty Musca domestica. Na początek wymieszaj jeden mikrolitr DNA z osocza wejściowego GFP z pięcioma mikrolitrami dostępnego na rynku liniowego DNA C-term w 250-mikrolitrowych probówkach do PCR. Następnie dodaj dwa mikrolitry dostępnej w handlu mieszanki rekombinacji lambda do każdej z probówek PCR.

Delikatnie wymieszaj probówki i inkubuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc. Wysiewaj dwa mililitry hodowli komórkowej owadów SF9 w fazie logarytmicznej równomiernie do dołków płytki do hodowli komórkowej. Następnie pozwól komórkom przyczepić się przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej w kapturze.

Używając mikroskopu z odwróconymi fazami o powiększeniu 250x, sprawdź mocowanie ogniwa. Następnie usuń pożywkę do hodowli komórkowej i zastąp ją dwoma mililitrami pożywki dla owadów Grace. Następnie przygotuj roztwory mieszaniny transfekcyjnej A i B zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie delikatnie wymieszaj mieszaniny transfekcji A i B, stukając w probówki. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej, w okapie, przez 35 minut. Następnie dodaj mieszaninę kroplami na wysiane komórki.

Uszczelnij studzienki taśmą i inkubuj komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez noc. Zastąp dwa mililitry pożywki dla owadów Grace dwoma mililitrami kompletnej pożywki wzrostowej. Następnie dodaj 100 mikromoli gancyklowiru do każdej studzienki.

Uszczelnij studzienki taśmą i inkubuj komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez 72 godziny. 72 godziny po zakażeniu zbierz pożywkę z każdej studzienki i przenieś ją do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie odwirować probówki w temperaturze 1500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki wzrostowej do studzienki i użyj mikroskopu ze światłem fluorescencyjnym, aby obserwować objawy infekcji komórek na etapie amplifikacji bakulowirusa P1. Przenieś supernatant do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w ciemnych warunkach. Następnie wysiewaj równomiernie dwa mililitry hodowli komórkowej owadów SF9 w fazie logarytmicznej w dołkach płytki do hodowli komórkowej.

Pozwól komórkom przyczepić się przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej w okapie. Zaszczepić pięć mikrolitrów zapasu wirusa P1 do studzienek z nasionami komórek, a następnie dodać 100 mikromoli gancyklowiru do każdej studzienki. Zamknij studzienki i inkubuj komórki przez 72 godziny w temperaturze 27 stopni Celsjusza.

Najpierw należy wyhodować pięć mililitrów komórek SF9 owadów o wzroście w fazie logarytmicznej z kompletną pożywką wzrostową w kolbach T25 niepoddanych działaniu substancji. Następnie dodaj 25 mikrolitrów roztworu podstawowego wirusa P1, aby zainfekować hodowlę komórkową przez 48 godzin, delikatnie wstrząsając, w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Za pomocą acetonitrylu przygotuj seryjne rozcieńczenia 100 milimolowej permetryny.

Następnie wysiewaj 200 mikrolitrów zakażonej kultury komórkowej uzupełnionej 300 mikrolitrami kompletnej pożywki wzrostowej na 24-dołkową płytkę. Upewnij się, że permetryna jest całkowicie rozpuszczona w acetonitrylu i równomiernie dostarczana do każdej studzienki płytki. Po dodaniu permetryny delikatnie wstrząsnąć płytką, aby całkowicie wymieszać permetrynę z podłożem.

Następnie uszczelnij płytkę taśmą i inkubuj płytkę w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez 48 godzin w ciemnych warunkach. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z płytki, nie naruszając dolnej warstwy komórek. Dodaj 200 mikrolitrów odczynnika MMT do każdego dołka.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny, aż w każdym dołku utworzą się ciemnofioletowe osady formazanu. Dodaj 500 mikrolitrów DMSO do każdej studzienki, aby całkowicie rozpuścić środki strącające. Następnie przenieś 200 mikrolitrów rozpuszczonego roztworu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.

Całkowite rozpuszczenie osadu w DMSO ma kluczowe znaczenie dla dokładności wyników. Po dodaniu DMSO do próbek w płytce, próbki zostaną kilkakrotnie przemyte za pomocą pipety, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu. Na koniec użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć wartości absorbancji płytki przy 540 nanometrach.

W stadium P1 współczynnik zakażeń jest niski. W stadium P2 współczynnik zakażeń uległ znacznemu zwiększeniu. Na etapie zakażenia P3 prawie wszystkie komórki wykazywały objawy oderwania się od płytki hodowli komórkowej, zwiększenia średnicy komórki, a także zatrzymania wzrostu komórek.

Na podstawie wykrytych wartości absorbancji, komórki wykazujące ekspresję Md alfa E7 wykazały znacznie wyższą żywotność w porównaniu z komórkami kontrolnymi CAT. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek na wszystkich etapach, poprzez wycieranie powierzchni rzeczy, takich jak butelki i tubki, 70-procentowym etanolem przed przeprowadzeniem eksperymentów na komórkach. Po tej procedurze można przeprowadzić kilka innych metod, takich jak modelowanie homologii i analiza ciemna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak interakcje między białkiem esterazy karboksylowej a ligandem permetryny.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się toksykologią owadów do zbadania funkcjonalnej charakterystyki genów i mechanizmów odporności owadów na insektycydy. Nie zapominaj, że praca z insektycydami może być bardzo szkodliwa, a podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.