Name: Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj metodę izolacji i fluorescencyjnego obrazowania centrioli Chlamydomonas do rekonstrukcji pojedynczych cząstek. Technika umożliwia lokalizację białek w określonych regionach centrioli z wykorzystaniem mikroskopii superrozdzielczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pierre'owi Gönczy i BioImaging & Optics Platform (BIOP) w École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lozanna, Szwajcaria, gdzie uzyskano obrazy SIM centrioli. Nikolai Klena i Davide Gambarotto są wspierani przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach grantu dla początkujących naukowców (StG) 715289 (ACCENT), a Maeva Le Guennec, Paul Guichard i Virginie Hamel przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers jest wspierana przez Uniwersytet Genewski.

<ol><li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+in+cells+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li>
<li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+and+only+once%3A+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li>
<li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
<li>Gönczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li>
<li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+organization+and+centriole+architecture%3A+their+sensitivity+to+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li>
<li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113101/">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li>
<li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+basal+bodies+in+paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461(1968).</li>
<li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li>
<li>Li, S., Fernandez, J. -J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li>
<li>Guichard, P., Chrétien, D., Marco, S., Tassin, A. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li>
<li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li>
<li>Hirono, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113102/">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li>
<li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li>
<li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li>
<li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li>
<li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li>
<li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529(1974).</li>
<li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus%3A+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326(2014).</li>
<li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813(2017).</li>
<li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li>
<li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li>
<li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/pdf/3143215.pdf?seq=1#page_scan_tab_contents">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li>
<li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li>
<li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth.f.392">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>de la Rosa-Trevín, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+3D-SIM%2FSMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+%E2%88%BC4-5+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li>
<li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+lytic+enzymes+%28autolysins%29+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+%28hydroxy%29proline-specific+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li>
<li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z wyzwań w biologii jest rozszyfrowanie dokładnej lokalizacji białek w kontekście architektonicznym. Centriole są idealną strukturą do zastosowania tych metod, ponieważ ich architektura została zbadana za pomocą tomografii krioelektronowej, ujawniając interesujące cechy ultrastrukturalne na całej jej długości. Jednak ze względu na jego wymiary bliskie granicy rozdzielczości w mikroskopii optycznej, trudno jest precyzyjnie zlokalizować białko za pomocą immunofluorescencji w strukturalnym podregionie centrioli przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów30.
Rozdzielczość w mikroskopii optycznej jest ograniczona przez dyfrakcję światła, która daje w przybliżeniu maksymalną rozdzielczość boczną 200 nm w mikroskopii optycznej24. Ograniczenie to zostało jednak ominięte przez jeden z największych przełomów ostatnich 20 lat w mikroskopii optycznej: wynalezienie metod superrozdzielczych. Podejścia te mogą obrazować poza granicami dyfrakcji w różnych rozdzielczościach: 120 nm dla SIM, około 50 nm dla wymuszonego zubożenia emisji (STED) i 20–40 nm dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM)24. Dzięki tym nowym osiągnięciom mikroskopii superrozdzielczej możliwe jest uzyskanie strukturalnych podregionów centrioli. Jednak w praktyce nadal trudno jest dokładnie określić lokalizację białka w elemencie strukturalnym z głównego powodu, że dojrzałe centriole występują tylko w 2 kopiach na komórkę i mają losowe orientacje, co utrudnia interpretację lokalizacji. Z tego powodu stworzono protokół, który umożliwia naukowcom obrazowanie w superrozdzielczości dużej liczby centrioli, zwiększając szansę na zaobserwowanie jednoznacznych orientacji. Co ważne, ponieważ metoda ta opiera się na użyciu izolowanych centrioli, zapewniamy metodę oczyszczania nienaruszonych centrioli C. reinhardtii , które zawierają dojrzałe centriole i procentriole.
Wreszcie, ze względu na szereg orientacji centrioli, które można obrazować za pomocą tego protokołu, analiza pojedynczych cząstek może być stosowana za pomocą oprogramowania do mikroskopii elektronowej. Powoduje to generowanie średnich klas centrioli w określonej orientacji. Co ważne, uzyskane obrazy 2D można następnie wykorzystać do oceny lokalizacji określonego białka wzdłuż centrioli. Rzeczywiście, metodę tę można zastosować do dwukolorowych obrazów o wysokiej rozdzielczości, a jeden kolor może być użyty do odsłonięcia szkieletu centrioli (np. tubuliny), podczas gdy drugi kolor można przypisać określonemu białku dośrodkowej. Odejmując uzyskane średnie za pomocą jednego lub dwóch kolorów, łatwiej jest zarejestrować białko wzdłuż centrioli (proksymalnie, centralnie lub dystalnie). Należy pamiętać, że oba kanały powinny być dokładnie wyrównane, aby zapobiec wprowadzającym w błąd interpretacjom. Co więcej, średnie widoków z góry pomogą rozszyfrować, czy białko lokalizuje się wewnątrz światła centriorów, wzdłuż ściany mikrotubul, czy na zewnątrz centrioli.
Zaletą tej metody jest ustalenie lokalizacji określonych białek, które w inny sposób mogłyby być trudne do zlokalizowania ze względu na heterogeniczne znakowanie. Należy zauważyć, że inne metody mapowania białek w centriolach zostały opisane w korelacyjnym 3-D SIM/SMLM, na przykład z oceną specyficznej orientacji centrioli poprzez określenie eliptycznego profilu markera tworzącego torus wokół centrioli za pomocą obrazowania SIM. Za pomocą tego parametru możliwa jest lokalizacja białka z dokładnością do 4–5 nm30. Należy również zauważyć, że opisana tutaj metoda wykorzystuje izolowane centriole z nienaruszonymi procentriolami, co oznacza, że architektura centrioli jest najprawdopodobniej w dużej mierze zachowana. Nie możemy jednak wykluczyć, że niektóre cechy architektoniczne są zaburzone podczas oczyszczania, takie jak średnica centrioli zmieniająca się wraz ze stężeniem kationów dwuwartościowych, wzmocniona izolacją ludzkiego centrosomu5.
Jednym z kluczowych etapów przedstawionego tutaj protokołu jest uzyskanie wystarczająco skoncentrowanych izolowanych centrioli w różnych orientacjach podatnych na Fluo-SPA. W tym celu należy najpierw upewnić się, że procedura izolacji centrioli jest czysta i skuteczna. Niskie stężenie izolowanych centrioli uniemożliwi prawidłowe obrazowanie i dalszą obróbkę obrazu. W tym celu udostępniamy metodę wzbogacania liczby centrioli na pole widzenia. W zależności od liczby centrioli w użytej frakcji, objętość załadowaną do koncentratora powinna być dostosowana, przy maksymalnej objętości 250 μL.
Co ważne, metoda ta została opracowana dla ściany komórkowej minus komórki cw15-C. reinhardtii . W tym szczepie kruchość ściany komórkowej pozwala na prawidłową lizę komórek, a tym samym uwolnienie jej zawartości. Protokół ten nie jest skuteczny w przypadku komórek C. reinhardtii typu dzikiego, ponieważ ściana komórkowa uniemożliwia prawidłową lizę. Alternatywne strategie, takie jak sonikacja lub wstępna inkubacja komórek z autolizyną, enzymem, który może degradować ścianę komórkową31, musiałyby zostać wprowadzone w celu zmiany ściany komórkowej przed zastosowaniem przedstawionego tutaj protokołu izolacji.
Ta konfiguracja może być używana z różnymi typami mikroskopów, począwszy od konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych, a skończywszy na dedykowanych mikroskopach o wysokiej rozdzielczości. Należy pamiętać, że podczas wykonywania SMLM do prawidłowego obrazowania wymagany jest specjalny bufor, a zatem należy użyć komory przystosowanej do szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm z buforem umieszczonym na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Kolejne obrazowanie zostanie wykonane za pomocą mikroskopów odwróconych. Jeśli konfiguracja mikroskopu nie pozwala na wykonanie szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm, przedstawiony tutaj protokół można zastosować do szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm za pomocą probówki o okrągłym dnie o pojemności 30 ml oraz zmodyfikowanego adaptera i koncentratora. Ważne jest również, aby pamiętać, że jakość końcowej rekonstrukcji w SMLM będzie zależeć od jakości barwienia i użytego pierwotnego przeciwciała, a także metody utrwalenia.
Podsumowując, dostarczamy metodę, którą można zastosować do obrazowania wielu centrioli, a następnie Fluo-SPA, która wygeneruje średnie centrioli w różnych orientacjach, pomagając w ten sposób z precyzją zlokalizować białko centrioralne. Co ważne, metoda ta może być stosowana bardziej ogólnie do izolowanych centrioli innych gatunków, do innych organelli lub do dużych zespołów makromolekularnych. Wreszcie, przedstawione tutaj podejście do przygotowania próbek, w połączeniu z niedawnym opracowaniem algorytmu do analizy pojedynczych cząstek fluorescencyjnych danych SMLM32, może przyczynić się do dalszego doskonalenia kartografii molekularnej dużych zespołów makromolekularnych.

Centriole to ewolucyjnie zachowana organella, która leży w sercu centrosomu w komórkach zwierzęcych i może działać jako ciało podstawowe (zwane dalej centriolami) do szablonu rzęsek lub wici u wielu eukariontów1,2. W związku z tym centriole mają kluczowe znaczenie dla podstawowych procesów biologicznych komórek, od składania wrzeciona po sygnalizację komórkową. W związku z tym defekty w montażu lub funkcji centrioli są związane z kilkoma ludzkimi patologiami, w tym ciliopatiami i nowotworami3.
Centriole to dziewięciokrotne, symetryczne, oparte na mikrotubulach potrójne struktury cylindryczne, które zazwyczaj mają ~450 nm długości i ~250 nm szerokości4,5,6,7. Konwencjonalna mikroskopia elektronowa i krioelektronowa tomografia centrioli różnych gatunków wykazały, że centriole są spolaryzowane wzdłuż swojej długiej osi z trzema odrębnymi obszarami: obszarem proksymalnym, centralnym jądrem i obszarem dystalnym5,7,8,9,10,11. Co ważne, każdy z tych regionów wykazuje określone cechy konstrukcyjne. Po pierwsze, światło obszaru proksymalnego o długości 100 nm zawiera strukturę koła wozu połączoną z trypletem mikrotubul za pomocą elementu główki szpilki12. Po drugie, obszar centralny o długości 300–400 nm zawiera włókniste gęstości w świetle i cechy strukturalne wzdłuż wewnętrznej powierzchni mikrotubul: łącznik w kształcie litery Y, ogon kanalika C i krąg rurki A9. Wreszcie, obszar dystalny 50–100 nm wykazuje subdystalne i dystalne wyrostki, które otaczają dystalną część centriole5,13.
Ostatnie dwie dekady upłynęły pod znakiem odkrywania coraz większej liczby białek centriolarnych, co doprowadziło do obecnego oszacowania około 100 odrębnych białek będących częścią klasy centriole<sup="xref">14,15,16,17. Pomimo tych postępów, dokładna lokalizacja tych białek w centrioli pozostaje nieuchwytna, szczególnie w podregionach strukturalnych. Co ważne, przypisanie precyzyjnej lokalizacji do obszarów strukturalnych centrioli ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia ich funkcji. Pod tym względem centriole C. reinhardtii odegrały zasadniczą rolę w obu aspektach, najpierw wyznaczając granice różnych cech strukturalnych wzdłuż cylindra9,18,19, co następnie pozwoliło naukowcom skorelować lokalizację podzbioru białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z regionem substrukturalnym. Obejmuje to na przykład białka Bld12p i Bld10p, które lokalizują się w regionie proksymalnym, a w szczególności w strukturze koła wozu20,21,22,23. Lista białek zlokalizowanych w podstrukturze obejmuje również POB15 i POC16, dwa nowe białka zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas, które zdobią wewnętrzny centralny region rdzenia C. reinhardtii centrioles17.
Ten artykuł zawiera pełny opis metody opracowanej do izolowania i obrazowania centrioli C. reinhardtii do późniejszej mikroskopii superrozdzielczej i uśredniania pojedynczych cząstek. Aby osiągnąć ten cel, ważne jest nakreślenie ograniczeń technicznych, które należy pokonać. Po pierwsze, oczyszczanie centrioli może mieć wpływ na ogólną architekturę, przy czym struktura koła wozu często jest tracona podczas różnych etapów izolacji9. Po drugie, wymiary centrioli są bardzo zbliżone do granicy dyfrakcji w mikroskopii optycznej. Rzeczywiście, rozdzielczość boczna, którą można uzyskać w mikroskopii konfokalnej, wynosi około 200 nm24, podobnie jak średnica centrioli, a rozdzielczość w osi z jest około 2-3 razy niższa, co prowadzi do objętości anizotropowej. Po trzecie, niejednorodność znakowania przeciwciał i orientacji centrioli może ograniczać interpretację potrzebną do lokalizacji białka w określonym podregionie centriolowym. Wreszcie, centriole występują tylko w dwóch kopiach na komórkę, co utrudnia uzyskanie dużej liczby obrazów i znalezienie jednoznacznej orientacji centrioli. Aby obejść te problemy techniczne, opracowaliśmy metodę, która opiera się na zastosowaniu mikroskopii superrozdzielczej na dużej liczbie izolowanych centrioli, które przyjmują różne orientacje. Najpierw opiszemy protokół oczyszczania centrioli C. reinhardtii, który umożliwia oczyszczanie strukturalnie nienaruszonych centrioli i procentrioli zawierających koło wozu. Następnie opiszemy krok po kroku protokół koncentracji centrioli na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania za pomocą konwencjonalnej lub superrozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej. Ten ważny krok pozwala na zwiększenie liczby centrioli obrazowanych w wielu orientacjach. Na koniec opiszemy procedurę uśredniania pojedynczych cząstek na danych uzyskanych na mikroskopach fluorescencyjnych, która ułatwia wykrywanie centrioli w różnych orientacjach. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może być stosowana do obrazowania centrioli różnych gatunków lub innych dużych zespołów makromolekularnych.

<table><tbody><tr><td>Mysia monoklonalna tubulina anty-apha (klon DM1A)</td><td>Abcam</td><td>ab7291&nbsp;</td><td>Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe DNaseI</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>12 mm</td><td>Roth</td><td>YX03.1</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 18 mm</td><td>Roth</td><td>LH23.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fluka</td><td>60355</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fluka</td><td>60230</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Biosolve Chimie SARL</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>524520</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A-4514</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>63140-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>filtr steritop</td><td>Millipore</td><td></td><td></td>SCGPT05RE</tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P6757-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>197530010</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A1694,0250</td><td></td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne (Kimble) 15 ml</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-34</td><td></td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne (Kimble) 30 ml</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-37</td><td></td></tr><tr><td>stojak do barwienia szkła nakrywkowego</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>skrzynka laboratoryjna z krystalicznego polistyrenu</td><td>FISHERS</td><td>11712944</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10735086001</tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>kozioł anty-mysz sprzężony z Alexa 488&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>A11029</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>kozia anty-królik sprzężona z Alexa 568</td><td>invitrogen</td><td>A11036</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>podłoże montażowe</td><td>abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>Rurka, cienkościenna polipropylen</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna 1 mg/ml</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Mysia monoklonalna modyfikacja anty-poliglutamylacji mAb (GT335)</td><td>Adipogen</td><td>AG-20B-0020</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>podłoże montażowe glicerolu z DAPI i DABCO</td><td>Abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5811000622</td><td></td></tr><tr><td>Beckman JS-13.1 wahliwy wirnik</td><td>kubełkowy Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW 32Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Bemis&nbsp;</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 z trybem Hyvolution</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSRAM L18W/954 LUMILUX&nbsp;</td>Bibuła filtracyjna <td>Luxe Daylight/ OSRAM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1001325</tr><tr><td>Rozcieńczenie przeciwciała</td><td></td><td></td> CrSAS-6/Bld12 <td>1:300 (Hamel el al., 2014)</td></tr><tr><td>Kamera CCD Scipion</td><td>http://scipion.i2pc.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>EM (Andor iXON DU897)</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek chlamydomonas centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centriole to duże zespoły makromolekularne, ważne dla prawidłowego wykonywania podstawowych procesów biologicznych komórek, takich jak podział komórki, ruchliwość komórki czy sygnalizacja komórkowa. Zielone algi Chlamydomonas reinhardtii okazały się wnikliwym modelem w badaniach nad architekturą, funkcją i składem białek centrioli. Pomimo ogromnych postępów w zrozumieniu architektury centriolowej, jednym z obecnych wyzwań jest określenie dokładnej lokalizacji komponentów centriolarnych w obszarach strukturalnych centrioli, aby lepiej zrozumieć ich rolę w biogenezie centrioli. Głównym ograniczeniem jest rozdzielczość mikroskopii fluorescencyjnej, która komplikuje interpretację lokalizacji białka w tej organelli o wymiarach zbliżonych do granicy dyfrakcji. Aby odpowiedzieć na to pytanie, przedstawiamy metodę oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli C. reinhardtii o różnych orientacjach przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej. Technika ta pozwala na dalsze przetwarzanie danych poprzez fluorescencyjne uśrednianie pojedynczych cząstek (Fluo-SPA) ze względu na dużą liczbę pozyskanych centrioli. Fluo-SPA generuje średnie barwionych centrioli C. reinhardtii w różnych orientacjach, ułatwiając w ten sposób lokalizację odrębnych białek w podregionach centrioralnych. Co ważne, metoda ta może być stosowana do obrazowania centrioli innych gatunków lub innych dużych zespołów makromolekularnych.

C. reinhardtii Izolacja centriolów: 
W celu izolacji centriolów komórki C. reinhardtii szczepu cw15 hodowano w kulturze ciekłej przez kilka dni przy naświetlaniu, a następnie osadzano poprzez wirowanie przy 600 x g przez 10 min. Osad z komórek przemyto 1x w PBS i zawieszono w buforze do deflagelacji przed przeprowadzeniem deflagelacji poprzez szok pH z użyciem 0,5 M kwasu octowego do końcowego pH 4,5–4,7 przez 2 min (Rycina 1A). Do przywrócenia pH do poziomu 7,0 zastosowano dodatek 1 N KOH. Aby oddzielić odłączone flagella od ciał komórkowych, komórki po deflagelacji odwirowano najpierw w celu usunięcia głównej części flagell. Osad przemyto 2x w PBS i zawieszono w 30 mL PBS przed powolnym nałożeniem na poduszkę 25%- sacharozy (Rycina 1B). Probówkę wirowano przy 60 x g przez 15 min w 4 °C, aby usunąć większość odłączonych flagell. Po wirowaniu ciała komórkowe rozprzestrzeniono w poduszce sacharozy (Rycina 1C) i odzyskano poprzez usunięcie około 30 mL supernatantu (do czerwonej strzałki na Rycynie 1C). Otrzymane 20 mL przemytych komórek zawieszono następnie w 20 mL zimnego PBS i wirowano przy 60 x g przez 10 min. Następnie odlano supernatant, a komórki całkowicie zawieszono w 10 mL PBS. Komórki przeniesiono do butelki o pojemności 250 mL i do zawiesiny komórkowej dodano jednorazowo bufor do lizy. Do lizatu dodano DNazę i inkubowano przez 1 h w 4 °C. Po etapie wirowania w celu usunięcia szczątków komórkowych (patrz biały osad na Rycynie 1D), zebrano supernatant i ostrożnie nałożono go na 2 mL poduszki 60%- sacharozy przed wirowaniem przy 10 0 x g przez 30 min w 4 °C. Należy zaznaczyć, że dla 100 mL lizatu użyto 8 probówek po 15 mL do wykonania tego kroku, co odpowiadało nałożeniu 12,5 mL buforu do lizy na 2 mL sacharozy w każdej probówce. Po wirowaniu usunięto większość supernatantu do poziomu 1 mL powyżej poduszki. Pozostały 1 mL supernatantu zebrano wraz z 2 mL poduszki, a następnie wymieszano i połączono, aby uzyskać końcową objętość 24 mL. Połączoną próbkę nałożono na gradient sacharozy 40%-, 50%-, 70%- i wirowano przy 68 320 x g przez 1 h i 15 min w 4 °C. Na koniec odizolowane centriole zebrano, wykonując igłą otwór w dolnej części probówki wirowania; krople zbierano w 12 frakcjach po 500 µL. Ze względu na wysoką gęstość różnych stężeń sacharozy, krople tworzyły się bardzo powoli na początku (70% sacharozy), a następnie szybciej (40% sacharozy).
Immunofluorescencja wyizolowanych centrioli 
Aby ocenić jakość procedury izolacji, 10 µL każdej zebranej frakcji gradientu poddano wirowaniu na szkiełku nakrywce przy użyciu specjalnego adaptera wspornika do szkiełek nakrywczych (Rysunek 2A-2D). Co ważne, w celu bezpiecznego usunięcia szkiełka nakrywki zaprojektowano specjalne urządzenie z haczykiem (Rysunek 2B). Następnie szkiełka nakrywkowe analizowano metodą immunofluorescencji. W badaniu zastosowano przeciwciała przeciwko CrSAS-6(Bld12p), aby wskazać obecność struktury koła rowerowego (cartwheel), oraz przeciwko α-tubulinie (DMA1), aby uwidocznić ścianę centrioli. Poprzez przeliczenie liczby centrioli wykazujących pozytywny wynik zarówno dla CrSAS-6, jak i α-tubuliny w jednym polu widzenia, a następnie obliczenie całkowitej liczby centrioli w poszczególnych frakcjach, możliwe było ustalenie, które frakcje były wzbogacone w wyizolowane centriole (Rysunek 2F-2H). Co ciekawe, 6 frakcji było wzbogaconych w centriole (Rysunek 2F oraz 2G, frakcje #1–6), z pikiem w frakcji #3, podczas gdy ostatnie frakcje nie były wzbogacone, co świadczy o skuteczności oczyszczania. Należy zauważyć, że w tym konkretnym eksperymencie 95% wszystkich centrioli w frakcji #3 było pozytywnych dla CrSAS-6 i α-tubuliny. Wskazuje to, że większość wyizolowanych centrioli zachowała strukturę koła rowerowego. Jeśli w pierwszych frakcjach nie zaobserwowano wzbogacenia w centriole, oznacza to, że procedura izolacji nie powiodła się i należy ją powtórzyć. Należy zwrócić uwagę, że fragmenty flagel można zaobserwować głównie w frakcjach pozbawionych centrioli.
Następnie, aby obliczyć całkowitą liczbę centriol na µL, liczbę centriol w jednym polu widzenia należy pomnożyć przez przelicznik przedstawiony na Rysunku 2H. Otrzymaną wartość należy następnie podzielić przez objętość frakcji wykorzystanej do immunofluorescencji, aby uzyskać liczbę centriol na µL. W tej konkretnej procedurze izolacji frakcja o największym wzbogaceniu zawierała około 37 centriol na powierzchni 0,0846 mm2 (przy polu widzenia 92 x 92 µm2). Przekrój probówki miał promień 7,5 mm i całkowitą powierzchnię 176 mm2. Odpowiedni przelicznik wynosił zatem 176/0,0846 = 20 803,8, co daje łącznie 769 740 centriol (37x20 803,8) w 10 µL. Zatem liczba centriol w 1 µL wynosiła 76 974.
Koncentracja wyizolowanych centrioli na szkiełkach nakrywkowych: 
Zwiększenie liczby centrioli w polu widzenia zwiększa szansę na wykrycie jednoznacznej orientacji centrioli, a także zwiększa prawdopodobieństwo znalezienia podobnych orientacji, które mogą zostać wykorzystane w dalszych procedurach uśredniania cząstek. Ponieważ centriole z frakcji skoncentrowanych są nadal rzadko rozmieszczone na szkiełku nakrywkowym, opracowaliśmy akcesorium do wirowania służące do koncentracji centrioli w środkowej części szkiełka (Rysunek 3A), nazwane koncentratorem. Należy pamiętać, że wraz z niniejszym manuskryptem dostarczono plik .stl z dokładnymi wymiarami do druku 3D.
Najpierw na koncentratorze zamontowano jedną szkiełko nakrywkę o średnicy 12 mm (Ryc. 3B). Na wierzchu szkiełka nakrywki umieszczono adapter, a następnie odwrócono probówkę z okrągłym dnem i nałożono ją na zmontowany adapter i koncentrator. Następnie delikatnie odwrócono probówkę z okrągłym dnem, umożliwiając w ten sposób załadowanie próbki (Protokół, krok 4.2). Centriole odwirowano następnie przy 10,0 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Po tym czasie centriole poddano immunofluorescencji i barwiono na CrSAS-6/Bld12p oraz α-tubulinę (Ryc. 3C-3E). Co istotne, bez użycia koncentratora w jednym polu widzenia obserwowano około 30 centrioli (Ryc. 3C), natomiast przy zastosowaniu koncentratora w jednym polu widzenia zaobserwowano 183 centriole (Ryc. 3D-3F). Należy zauważyć, że centriole pokrywały jedynie obszar o średnicy 4 mm na środku szkiełka nakrywki. Wynik ten dowodzi, że etap koncentracji jest skuteczny i pozwala na 6-krotne wzbogacenie centrioli w określonym obszarze szkiełek nakrywek, co ułatwia ich detekcję i obrazowanie.
Fluorescencyjna średnia z pojedynczych cząsteczek izolowanych centrioli C. reinhardtii: 
W niniejszej pracy, przy użyciu mikroskopii SIM, która pozwala na osiągnięcie rozdzielczości około 120 nm, obrazowano centriole barwione na monoglutamylowaną tubulinę (GT35, Rycina 4), będącą modyfikacją tubuliny występującą w mikrotubulach centriolarnych24. Centriole C. reinhardtii mają około 500 nm długości, zawsze występują w parach i często towarzyszą im powiązane, nowo zduplikowane ciała probazalne (zwane w dalszej części procentriolami) oraz prążkowane włókna związane z mikrotubulami19. Zatem ten końcowy kompleks miał rozmiar około 1 µm. Z tego powodu, aby obrazować centriole w całości, zalecamy wykonanie stosu Z (Z-stack) izolowanych centrioli.
W tym przypadku po akwizycji wygenerowano obraz końcowy poprzez wykonanie projekcji maksymalnej intensywności przy użyciu programu ImageJ28 (image/Stacks/Z project/max intensity projection, Rysunek 4B). Na podstawie takich obrazów przeprowadzono analizę pojedynczych cząsteczek przy użyciu oprogramowania do kriomikroskopii elektronowej, aby stworzyć klasy centriol o podobnej orientacji, a następnie wykonano uśrednianie. W tym celu najpierw odwrócono kolory obrazu, aby lepiej zwizualizować obiekty (Rysunek 4C). Centriole wybierano ręcznie w ramce wycentrowanej na każdej cząsteczce, korzystając z bezpłatnego oprogramowania Scipion29, które integruje kilka programów do mikroskopii elektronowej, takich jak Xmipp3 (Rysunek 4D). Należy pamiętać, że rozmiar ramki musi zostać zdefiniowany przez użytkownika. W tym przypadku zastosowano ramki o wymiarach 50 x 50 pikseli przy rozmiarze piksela wynoszącym 31.84 nm. Następnie wszystkie cząsteczki zostały wyekstrahowane (Rysunek 4E) i wyrównane przy użyciu Xmipp3 (Rysunek 4F). Kolejno zastosowano okrągłą maskę o promieniu 12 pikseli, aby odizolować każdy centriol od pary centriolarnych (Rysunek 4G). Następnie cząsteczki zostały sklasyfikowane za pomocą Xmipp3 w celu wygenerowania kilku średnich. Zachowano jedynie homogeniczne średnie klas, co oznacza, że cząsteczki odbiegające od średnich klas zostały usunięte ręcznie. Krok ten powtarzano, aby uzyskać niemal idealną średnią dla każdej wybranej orientacji. Po pięciu iteracjach wygenerowano dwie klasy średnich: widok z góry z 63 obiektów (Rysunek 4H) oraz widok z boku z 98 cząsteczek (Rysunek 4I) monoglutamylowanych centrioli. Wymiary obiektu określono poprzez pomiar odległości między szczytami profilu wykresu intensywności wzdłuż sygnału monoglutamylacji.
Co istotne, długość średniej dla klasy widoku bocznego wynosi 260 nm przy średnicy 250 nm, co jest porównywalne z zmierzonym sygnałem monoglutamylowanej tubuliny, który lokalizował się w obszarze o długości 286 ± 3 nm wewnątrz rdzenia centriola17.
<img alt="Schemat procesu wirowania w celu oczyszczania białek z wykorzystaniem gradientu sacharozy; metoda i wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Oczyszczanie C. reinhardtii centriole (A) Jest to schematyczne przedstawienie każdego etapu prowadzącego do izolacji C. reinhardtii centriole. Obejmuje ono reprezentatywne etapy protokołu (B) przed i (C) po wirowaniu w gradiencie 25% sacharozy. Czerwona strzałka na panelu C oznacza minimalną objętość, którą należy zachować po wirowaniu. (D) Na tym panelu widoczny jest biały osad z lizowanych komórek po wirowaniu. Czarna strzałka wskazuje osad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu wirowania i wyniki; wykres ilościowy gradientu; konfiguracja mikroskopu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Konfiguracja wirowania w celu przeprowadzenia immunofluorescencji na wyizolowanych centriolach. (A) 10 µL każda zebrana frakcja jest najpierw rozcieńczana w 100 µL 10 mM K-PIPES (pH 7,2). (B) Jest to schematyczne przedstawienie urządzeń do wirowania, obejmujące probówkę z okrągłym dnem o objętości 15 ml, szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm, adapter do szkiełka nakrywkowego oraz wykonany na zamówienie zaczep do wyjmowania szkiełka nakrywkowego po wirowaniu. Panele C i D przedstaw rysunki wyjaśniające, jak odzyskać szkiełko nakrywkę po wirowaniu. (C) Włóż narzędzie z haczykiem do otworu znajdującego się w naciętej krawędzi adaptera i (D) delikatnie pociągnąć. (ESą to zdjęcia komory wilgotnościowej niezbędnej do wykonania obrazowania immunofluorescencyjnego. Strzałka wskazuje szkiełko cover-slip o średnicy 12 mm.F) Są to reprezentatywne obrazy konfokalne przy powiększeniu 63X (zoom 2) frakcji gradientu nr 1–8, pobranych podczas procedury oczyszczania i barwionych na CrSAS-6 (czerwony) oraz $\alpha$-tubulinę (zielony). Wstawki odpowiadają obszarowi wskazanemu białą ramką na widokach o mniejszym powiększeniu. Pasek skali = 10 µm. (GWykres przedstawia liczbę centrioli wykazujących pozytywną reakcję zarówno na CrSAS-6, jak i α-tubulinę w jednym polu widzenia dla każdej frakcji. Zwrócono uwagę na wzbogacenie we frakcjach nr 1–6. Średnia liczba centrioli na pole w każdej frakcji: nr 1 = 16,3 ± 4,7, nr 2 = 24,0 ± 4,6, nr 3 = 37,0 ± 17,0, nr 4 = 23,3 ± 1,4, nr 5 = 14,3 ± 2,1, nr 6 = 13,7 ± 9,3, nr 7 = 2,7 ± 1,2, nr 8 = 1,0 ± 0,0, nr 9 = 1,0 ± 0,0, nr 10 = 0,0 ± 0,0, nr 11 = 0,3 ± 0,6, nr 12 = 0,0 ± 0,0. Dla każdej frakcji obrazowano 3 losowe pola. Odnotowano, że podczas liczenia w najbardziej wzbogaconej frakcji nr 3 ustalono, iż 95% centrioli wykazuje pozytywną reakcję na CrSAS-6 oraz α-tubulinę (n = 205 centrioli). (H) Do obliczenia całkowitej liczby centrioli obecnych w obszarze probówki wykorzystuje się stosunek liczby centrioli znajdujących się w zmierzonym obszarze mikrografii. Liczba centrioli na µL można obliczyć na podstawie 10 µL pierwotnie odwirowane frakcje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat wirówki z konfiguracją koncentratora, obrazy mikroskopowe, analiza białek i wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Wyizolowane centriole są wirowane przy użyciu koncentratorów. (A) Na tym panelu przedstawiono urządzenia do wirowania niezbędne do koncentracji centrioli na szkiełkach nakrywkowych przed przeprowadzeniem immunofluorescencji, w tym probówkę o okrągłym dnie o pojemności 15 ml, koncentrator, szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm oraz aparat wspierający w postaci adaptera. (B) Na tym panelu przedstawiono etapy montażu urządzenia do wirowania. Panele C-E prezentuj obrazy konfokalne centrioli barwionych na CrSAS-6 (czerwony) i α-tubulinę (zielony) (C) bez lub (D-E) z koncentratorem. Wstawki odpowiadają obszarowi wskazanemu białą ramką na widokach przy niższym powiększeniu. Pasek skali wynosi 10 µmNależy zauważyć, że centriole są skoncentrowane w środkowej części szkiełka nakrywki (linia przerywana wyznacza granicę obszaru zagęszczenia).FWykres ten przedstawia liczbę centrioli w jednym polu widzenia bez i z zastosowaniem koncentratora. Przeanalizowano pięć losowych pól widzenia. Średnia liczba centrioli wynosi 29,8 ± 2,9 bez koncentratora oraz 182,6 ± 1,5 z koncentratorem. P &lt;0,001. Istotność statystyczną oceniano za pomocą niepowiązanych t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu monoglutamylacji obejmujący ekstrakcję cząsteczek, wyrównanie, maskowanie i uśrednianie klas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Uśrednianie pojedynczych cząstek na izolowanych C. reinhardtii centriole (A) Ten panel przedstawia obrazy serii Z (Z-stack) centrioli barwionych przeciwciałem GT335, uzyskane przy użyciu mikroskopu SIM. (BPanele te przedstawiają maksymalną projekcję intensywności (MIP) stosu obrazów. Pasek skali = 1 µm. (C) Panele te przedstawiają reprezentacyjny obraz z odwróconym kontrastem. Wstawka stanowi powiększenie, które pozwala na lepszą wizualizację centrioli. (D) Panele te przedstawiają proces wyboru cząstek. Wstawka wskazuje sposób, w jaki wybrano cząstki. (E) Są to przykłady 5 wyekstrahowanych cząstek. (F) Ten panel przedstawia cząstki po dopasowaniu. (G) Ten panel przedstawia cząstki po zastosowaniu maski. Panele H i I wyświetl średnie dla dwóch grup: (H) widok z góry (63 cząsteczki) oraz (I) widok z boku (98 cząsteczek). Podwójne strzałki wskazują wymiary sygnału GT35. Pasek skali = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Plik uzupełniający 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opracowaliśmy strategię oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli w różnych orientacjach, które można poddać mikroskopii superrozdzielczej i uśrednianiu pojedynczych cząstek.

Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie centrioli, takie jak lokalizacja białka w określonym regionie centrioli. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewniamy środki do koncentracji centrioli, aby uzyskać je w wielu orientacjach. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat biologii Chlamydomonas centriole, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak izolowane centriole ludzkie i pantofelki.Procedurę zademonstrują doktorant Nikolai Klena, inna doktorantka Maeva Le Guennec oraz postdoc w laboratorium Davide Gambarotto. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw przygotuj wszystkie pożywki i posaz komórki C.Reinhardtii zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś przygotowane komórki do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj je 600 razy g przez 10 minut.Umyj granulkę raz 50 mililitrami 1x PBS i ponownie wiruj komórki z prędkością 600 razy g przez 10 minut. Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad w 100 mililitrach buforu deflagellacyjnego o temperaturze pokojowej. Umieścić zlewkę na mieszadle magnetycznym i powoli dodawać 0,5 molowego kwasu octowego do końcowego pH 4,5 do 4,7.Pozwól tej mieszaninie inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Następnie powoli dodawaj krople jednego normalnego wodorotlenku potasu, aby przywrócić pH do 7,0, przenieś komórki do 50 mililitrowych probówek i odwiruj je z prędkością 600 razy g przez 10 minut, aby usunąć oderwaną wici. Wyrzucić supernatant i przechowywać osad na lodzie do momentu, gdy będzie gotowy do umycia.Gdy będzie gotowy, umyj granulkę dwukrotnie, używając 50 mililitrów 1x PBS w czterech stopniach Celsjusza na pranie. Wiruj umyty granulat pod ciśnieniem 600 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zawiesić granulat w 30 mililitrach 1x PBS.Następnie powoli załaduj zawiesinę na 20-mililitrową poduszkę z 25% sacharozy, bez mieszania. Wirować 600 razy g i cztery stopnie Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć resztki wici i rozprowadzić komórki w sacharozy. Za pomocą aspiratora ostrożnie zassać supernatant, zachowując tylko 20 mililitrów na dole.Umyj pozostałą sacharozę, dodając 20 mililitrów zimnego 1x PBS. Wirować w temperaturze 600 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach 1x PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewniając się, że w roztworze nie ma grudek.Przenieś zawieszony osad do nowej butelki o pojemności 250 mililitrów, dodaj bufor do lizy, uzupełniony 5 000 jednostek DNazy, do butelki zawierającej komórki. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę, mieszając co 15 minut, ostrożnie odwracając butelkę. Przenieś lizowane komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj w temperaturze 600 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Za pomocą pipety zebrać supernatant i załadować go do 30-mililitrowej probówki okrągłodennej na lodzie zawierającej dwa mililitry 60% poduszki sacharozy. Odwiruj to w temperaturze 10 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać supernatant do jednego mililitra powyżej poduszki sacharozy.Zwróć uwagę na żółty interfejs między jednym mililitrem pozostałego supernatantu a dwoma mililitrami poduszki sacharozy. Za pomocą przeciętej końcówki P1000 delikatnie wymieszaj pozostały supernatant z sacharozą. Zbierz wszystkie poduszki z sacharozą i przechowuj je na lodzie.Następnie przygotuj gradient sacharozy od 40% do 70% w cienkościennej tubie polipropylenowej o pojemności 38,5 mililitra, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Powoli załaduj interfejsy w puli do gradientu. Zrównoważyć probówki 10-milimolowym buforem K-PIPES i odwirować w temperaturze 68, 320 razy g i czterech stopni Celsjusza przez 75 minut.Następnie użyj igły o średnicy 0,8 milimetra, aby zrobić otwór w dnie tubki, uważając, aby nie naruszyć różnych warstw sacharozy. Użyj tego otworu, aby zebrać 12 500 mikrolitrowych frakcji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą przeciętej końcówki P200 przygotuj dodatkową 10 mikrolitrową porcję z każdej frakcji, która ma być użyta podczas immunofluorescencji.Następnie zamroź frakcje w ciekłym azocie. Na początek umieść sterylne 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na wgłębionym dolnym końcu koncentratora, upewniając się, że strona pokryta PDL jest skierowana w dół. Umieść adapter bezpośrednio na górze, aby zakryć szkiełko nakrywkowe.Następnie odwróć rurkę z okrągłym dnem i umieść ją na koncentratorze, szkiełku nakrywkowym i adapterze. Za pomocą pęsety delikatnie popchnij zestaw, aż dotrze do dna tuby, a następnie odwróć rurkę. Dodać 10 milimolów buforu K-PIPES, aż dotrze do górnej części koncentratora.Upewnij się, że w centralnym cylindrze koncentratora nie ma pęcherzyków powietrza. Delikatnie dodać 100 mikrolitrów 10-milimolowego buforu K-PIPES do jednej z podwielokrotności wzbogaconej frakcji dośrodkowej i dokładnie wymieszać za pomocą pipety P200. Następnie należy usunąć 100 mikrolitrów buforu K-PIPES z pustego środka koncentratora i dodać 100 mikrolitrów mieszaniny frakcji buforowej, upewniając się, że zawartość pozostaje w pustym środku koncentratora.Wirować z prędkością 10 000 g przez 10 minut w wirówce wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj pęsety, aby wyjąć koncentrator. Włóż ręcznie wykonane haczykowate urządzenie do otworu znajdującego się w szczelinowej krawędzi adaptera i delikatnie podnieś, aby odzyskać szkiełko nakrywkowe.Gdy dotrze do górnej części tuby, użyj palca w rękawiczce, aby przytrzymać krawędź adaptera i użyj pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe, zwracając uwagę na to, po której stronie szkiełka nakrywkowego znajdują się centriole. Następnie należy wykonać utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne skoncentrowanych centrioli. Na początek inkubuj szkiełka nakrywkowe z centriolami w przygotowanym pudełku laboratoryjnym z krystalicznego polistyrenu wypełnionego 100% metanolem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 5 minut.Za pomocą pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe do przezroczystego pudełka laboratoryjnego wypełnionego 50 mililitrami 1x PBS. Pozwól szkiełkom myć się w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odpipetować 60 mikrolitrów przeciwciała pierwotnego wymieszać na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej w wilgotnej komorze.Ostrożnie ułożyć szkiełka nakrywkowe na wierzchu mieszaniny przeciwciał z centriolami skierowanymi bezpośrednio w kroplę. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do inkubacji przez 45 minut. Następnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je w pudełku zawierającym PBS przez pięć minut.Inkubować umyte szkiełka nakrywkowe przez 45 minut z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS 1% BSA i 0,05% Tween-20. Usunąć szkiełka nakrywkowe i myć je przez pięć minut w pudełku zawierającym PBS. Używając zwykłego środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku.Następnie zobrazuj izolowane centriole pod mikroskopem konfokalnym przy obiektywie olejowym 63X z NA1,4, stosując dekonwolucję. Ustaw górną i dolną pozycję stosu Z odpowiednio powyżej i poniżej sygnału centrioli i uzyskaj duży stos obrazów składających się na całkowity sygnał centrioli. Rzutuj stos i wykonaj uśrednianie pojedynczych cząstek, jak opisano w protokole tekstowym.Reprezentatywna immunofluorescencja ujawnia, że sześć frakcji jest wzbogaconych dla izolowanych centrioli, z pikiem dla frakcji numer trzy, podczas gdy ostatnie dwie frakcje nie są, co wskazuje, że oczyszczanie zakończyło się sukcesem. W każdym polu widzenia bez koncentratora widocznych jest tylko około 30 centrioli, podczas gdy w przypadku koncentratora widać 183 centriole. Pokazuje to, że etap koncentratora jest udany i pozwala na sześciokrotne wzbogacenie centrioli w określonym obszarze, co ułatwia ich wykrywanie i obrazowanie.Mikroskopia superrozdzielcza jest następnie wykorzystywana do obrazowania centrioli wybarwionych na obecność monoglutamylowanej tubuliny, a oprogramowanie jest wykorzystywane do generowania prawie idealnej średniej dla każdej wybranej orientacji. Po pięciu iteracjach wygenerowano dwie klasy średnich monoglutamylowanych centrioli: widok z góry z 63 obiektów i widok z boku z 98 cząstek. Średnia długość klasy bocznej wynosi 260 nanometrów przy średnicy 250 nanometrów, co jest porównywalne z zmierzonym sygnałem monoglutamylowanej tubuliny, który jest widoczny jako zlokalizowany w rdzeniu centrioli.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby izolowaną centriorolę trzymać na lodzie i zamrozić ją po izolacji. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia krioelektronowa i spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak natywna architektura centrioli lub skład białka centrioli.

isolation-fluorescence-imaging-for-single-particle-reconstruction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje standardową metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (EM) z barwieniem negatywowym. W tym protokole wyjaśniamy, jak uzyskać strukturę 3D kompleksu egzosomu Saccharomyces cerevisiae w średniej rozdzielczości, stosując metodę rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym (RCT).

Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Opisana jest metoda oparta na białku fluorescencyjnym żywych komórek do oświetlania wakuoli komórkowych (inkluzji) zawierających Chlamydię. Strategia ta umożliwia szybkie, zautomatyzowane określenie zakaźności Chlamydii w próbkach i może być wykorzystana do ilościowego badania dynamiki wzrostu inkluzji.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Opisane są protokoły badania dynamiki zrębów chloroplastowych, kanalików wypełnionych zrębem, które rozciągają się od powierzchni chloroplastów.

Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.

Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Poznaj metodę izolacji i fluorescencyjnego obrazowania centrioli Chlamydomonas do rekonstrukcji pojedynczych cząstek. Technika umożliwia lokalizację białek w określonych regionach centrioli z wykorzystaniem mikroskopii superrozdzielczej.

Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

Przeglądaj więcej filmów