Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie centrioli, takie jak lokalizacja białka w określonym regionie centrioli. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewniamy środki do koncentracji centrioli, aby uzyskać je w wielu orientacjach. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat biologii Chlamydomonas centriole, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak izolowane centriole ludzkie i pantofelki.

Procedurę zademonstrują doktorant Nikolai Klena, inna doktorantka Maeva Le Guennec oraz postdoc w laboratorium Davide Gambarotto. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw przygotuj wszystkie pożywki i posaz komórki C.Reinhardtii zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś przygotowane komórki do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj je 600 razy g przez 10 minut.

Umyj granulkę raz 50 mililitrami 1x PBS i ponownie wiruj komórki z prędkością 600 razy g przez 10 minut. Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad w 100 mililitrach buforu deflagellacyjnego o temperaturze pokojowej. Umieścić zlewkę na mieszadle magnetycznym i powoli dodawać 0,5 molowego kwasu octowego do końcowego pH 4,5 do 4,7.

Pozwól tej mieszaninie inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Następnie powoli dodawaj krople jednego normalnego wodorotlenku potasu, aby przywrócić pH do 7,0, przenieś komórki do 50 mililitrowych probówek i odwiruj je z prędkością 600 razy g przez 10 minut, aby usunąć oderwaną wici. Wyrzucić supernatant i przechowywać osad na lodzie do momentu, gdy będzie gotowy do umycia.

Gdy będzie gotowy, umyj granulkę dwukrotnie, używając 50 mililitrów 1x PBS w czterech stopniach Celsjusza na pranie. Wiruj umyty granulat pod ciśnieniem 600 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zawiesić granulat w 30 mililitrach 1x PBS.

Następnie powoli załaduj zawiesinę na 20-mililitrową poduszkę z 25% sacharozy, bez mieszania. Wirować 600 razy g i cztery stopnie Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć resztki wici i rozprowadzić komórki w sacharozy. Za pomocą aspiratora ostrożnie zassać supernatant, zachowując tylko 20 mililitrów na dole.

Umyj pozostałą sacharozę, dodając 20 mililitrów zimnego 1x PBS. Wirować w temperaturze 600 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach 1x PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewniając się, że w roztworze nie ma grudek.

Przenieś zawieszony osad do nowej butelki o pojemności 250 mililitrów, dodaj bufor do lizy, uzupełniony 5 000 jednostek DNazy, do butelki zawierającej komórki. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę, mieszając co 15 minut, ostrożnie odwracając butelkę. Przenieś lizowane komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj w temperaturze 600 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Za pomocą pipety zebrać supernatant i załadować go do 30-mililitrowej probówki okrągłodennej na lodzie zawierającej dwa mililitry 60% poduszki sacharozy. Odwiruj to w temperaturze 10 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać supernatant do jednego mililitra powyżej poduszki sacharozy.

Zwróć uwagę na żółty interfejs między jednym mililitrem pozostałego supernatantu a dwoma mililitrami poduszki sacharozy. Za pomocą przeciętej końcówki P1000 delikatnie wymieszaj pozostały supernatant z sacharozą. Zbierz wszystkie poduszki z sacharozą i przechowuj je na lodzie.

Następnie przygotuj gradient sacharozy od 40% do 70% w cienkościennej tubie polipropylenowej o pojemności 38,5 mililitra, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Powoli załaduj interfejsy w puli do gradientu. Zrównoważyć probówki 10-milimolowym buforem K-PIPES i odwirować w temperaturze 68, 320 razy g i czterech stopni Celsjusza przez 75 minut.

Następnie użyj igły o średnicy 0,8 milimetra, aby zrobić otwór w dnie tubki, uważając, aby nie naruszyć różnych warstw sacharozy. Użyj tego otworu, aby zebrać 12 500 mikrolitrowych frakcji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą przeciętej końcówki P200 przygotuj dodatkową 10 mikrolitrową porcję z każdej frakcji, która ma być użyta podczas immunofluorescencji.

Następnie zamroź frakcje w ciekłym azocie. Na początek umieść sterylne 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na wgłębionym dolnym końcu koncentratora, upewniając się, że strona pokryta PDL jest skierowana w dół. Umieść adapter bezpośrednio na górze, aby zakryć szkiełko nakrywkowe.

Następnie odwróć rurkę z okrągłym dnem i umieść ją na koncentratorze, szkiełku nakrywkowym i adapterze. Za pomocą pęsety delikatnie popchnij zestaw, aż dotrze do dna tuby, a następnie odwróć rurkę. Dodać 10 milimolów buforu K-PIPES, aż dotrze do górnej części koncentratora.

Upewnij się, że w centralnym cylindrze koncentratora nie ma pęcherzyków powietrza. Delikatnie dodać 100 mikrolitrów 10-milimolowego buforu K-PIPES do jednej z podwielokrotności wzbogaconej frakcji dośrodkowej i dokładnie wymieszać za pomocą pipety P200. Następnie należy usunąć 100 mikrolitrów buforu K-PIPES z pustego środka koncentratora i dodać 100 mikrolitrów mieszaniny frakcji buforowej, upewniając się, że zawartość pozostaje w pustym środku koncentratora.

Wirować z prędkością 10 000 g przez 10 minut w wirówce wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj pęsety, aby wyjąć koncentrator. Włóż ręcznie wykonane haczykowate urządzenie do otworu znajdującego się w szczelinowej krawędzi adaptera i delikatnie podnieś, aby odzyskać szkiełko nakrywkowe.

Gdy dotrze do górnej części tuby, użyj palca w rękawiczce, aby przytrzymać krawędź adaptera i użyj pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe, zwracając uwagę na to, po której stronie szkiełka nakrywkowego znajdują się centriole. Następnie należy wykonać utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne skoncentrowanych centrioli. Na początek inkubuj szkiełka nakrywkowe z centriolami w przygotowanym pudełku laboratoryjnym z krystalicznego polistyrenu wypełnionego 100% metanolem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 5 minut.

Za pomocą pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe do przezroczystego pudełka laboratoryjnego wypełnionego 50 mililitrami 1x PBS. Pozwól szkiełkom myć się w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odpipetować 60 mikrolitrów przeciwciała pierwotnego wymieszać na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej w wilgotnej komorze.

Ostrożnie ułożyć szkiełka nakrywkowe na wierzchu mieszaniny przeciwciał z centriolami skierowanymi bezpośrednio w kroplę. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do inkubacji przez 45 minut. Następnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je w pudełku zawierającym PBS przez pięć minut.

Inkubować umyte szkiełka nakrywkowe przez 45 minut z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS 1% BSA i 0,05% Tween-20. Usunąć szkiełka nakrywkowe i myć je przez pięć minut w pudełku zawierającym PBS. Używając zwykłego środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku.

Następnie zobrazuj izolowane centriole pod mikroskopem konfokalnym przy obiektywie olejowym 63X z NA1,4, stosując dekonwolucję. Ustaw górną i dolną pozycję stosu Z odpowiednio powyżej i poniżej sygnału centrioli i uzyskaj duży stos obrazów składających się na całkowity sygnał centrioli. Rzutuj stos i wykonaj uśrednianie pojedynczych cząstek, jak opisano w protokole tekstowym.

Reprezentatywna immunofluorescencja ujawnia, że sześć frakcji jest wzbogaconych dla izolowanych centrioli, z pikiem dla frakcji numer trzy, podczas gdy ostatnie dwie frakcje nie są, co wskazuje, że oczyszczanie zakończyło się sukcesem. W każdym polu widzenia bez koncentratora widocznych jest tylko około 30 centrioli, podczas gdy w przypadku koncentratora widać 183 centriole. Pokazuje to, że etap koncentratora jest udany i pozwala na sześciokrotne wzbogacenie centrioli w określonym obszarze, co ułatwia ich wykrywanie i obrazowanie.

Mikroskopia superrozdzielcza jest następnie wykorzystywana do obrazowania centrioli wybarwionych na obecność monoglutamylowanej tubuliny, a oprogramowanie jest wykorzystywane do generowania prawie idealnej średniej dla każdej wybranej orientacji. Po pięciu iteracjach wygenerowano dwie klasy średnich monoglutamylowanych centrioli: widok z góry z 63 obiektów i widok z boku z 98 cząstek. Średnia długość klasy bocznej wynosi 260 nanometrów przy średnicy 250 nanometrów, co jest porównywalne z zmierzonym sygnałem monoglutamylowanej tubuliny, który jest widoczny jako zlokalizowany w rdzeniu centrioli.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby izolowaną centriorolę trzymać na lodzie i zamrozić ją po izolacji. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia krioelektronowa i spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak natywna architektura centrioli lub skład białka centrioli.