Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-
17 października 2018
Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.
Podczas zakażenia wirusem Zika limfocyty T mogą infiltrować narządy o podwyższonej odporności w celu eliminacji wirusa, ale mogą również przyczyniać się do immunopatogenezy, takiej jak zespół Guillaina-Barrégo lub uszkodzenie jąder. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona oparte na tetramerach wykrywanie limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach z uprawnieniami immunologicznymi, zarówno podczas infekcji wirusem Zika, jak i po szczepieniu. W tym modelu zakażenie wirusem Zika jest inicjowane u myszy z nokautem receptora interferonu alfa/beta, co umożliwia śledzenie limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w mózgu, jądrach i śledzionie.
Stosując metodę barwienia tetramerami, możliwe jest zbadanie tylko cech narządu z upośledzeniem immunologicznym naciekających limfocyty T specyficzne dla wirusa Zika, aby zbadać wkład limfocytów T w immunoprotekcję i komórki immunopatogenne. W przypadku zakażenia wirusem Zika należy dostarczyć jeden razy 10 do czterech jednostek tworzących ogniskowanie wirusa Zika w 100 mikrolitrach PBS poprzez inokulację retroorbitalną do sześcio- do ośmiotygodniowych myszy z nokautem receptora interferonu alfa/beta. Następnie należy codziennie przez 15 dni monitorować masę ciała i objawy kliniczne zakażonych zwierząt.
Siedem dni po zaszczepieniu zabezpiecz zakażone zwierzę w pozycji leżącej na piance chirurgicznej i za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej brzucha. Użyj nożyczek, aby otworzyć mięśnie brzucha i delikatnie wydobyć wątrobę. Następnie usuń śledzionę i przepłucz tkankę trzy razy w PBS, aby usunąć krew.
Po ostatnim praniu umieść śledzionę na 1,5 mililitra lodowatego podłoża RPMI na lodzie, aż wszystkie śledziony zostaną zebrane. Aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową, umieść śledziony w sterylnym sitku do komórek o siatce 40 mikrometrów na 50-mililitrowej probówce i dodaj do sitka dwa mililitry lodowatej pożywki RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Następnie użyj tłoka pięciomililitrowej strzykawki, aby zmacerować tkankę przez filtr, używając świeżej pożywki do przepłukania uwolnionych komórek przez siatkę.
Przenieś zawiesinę jednokomórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek. Po pięciu do sześciu minutach w temperaturze pokojowej przerwij lizę za pomocą 10 mililitrów lodowatego RPMI plus FBS do drugiego odwirowania i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach kompletnego podłoża do liczenia. Siedem dni po zaszczepieniu unieruchom unieruchomiony, zarażony samiec myszy w pozycji leżącej na desce do krojenia i zabezpiecz skórę głowy prostymi kleszczami o wymiarach jeden na dwa zęby.
Użyj nożyczek do tęczówki, aby wykonać nacięcie w linii środkowej na skórze głowy, odsłaniając czaszkę, i użyj ostrej pęsety, aby zacisnąć obie strony oczodołów ostrymi pęsetami, mocując mózg. Umieszczając jedną końcówkę ostrych nożyczek tęczówki w otworze wielkim, naciąć bocznie w czaszce z każdej strony. Ostrożnie wytnij od tej samej wnęki w górę linii środkowej, w kierunku nosa, utrzymując końcówki nożyczek tak powierzchownie, jak to możliwe, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.
Podnieś mózg kleszczami i użyj ostrych nożyczek do tęczówki, aby dokładnie wypreparować włókna nerwowe czaszki. Następnie użyj kleszczy, aby przenieść mózg do 15-mililitrowej rurki zawierającej pięć mililitrów lodowatego RPMI plus FBS. Aby wyizolować jądra, podnieś skórę brzucha za pomocą kleszczy i użyj nożyczek do tęczówki, aby wykonać podłużne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha oraz odsłonić najniższą część brzucha.
Popchnij jądra do nacięcia i użyj pęsety, aby delikatnie pociągnąć warstwę tłuszczu, aby odsłonić kuliste jądro po obu stronach. Użyj nożyczek do tęczówki, aby dokładnie wypreparować warstwę tłuszczu i najądrza, a następnie przenieś jądra do 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów lodowatego RPMI plus FBS. Aby wygenerować zawiesinę jednokomórkową z którejkolwiek z pobranych tkanek, umieść narząd na sterylnym sitku do komórek z siatką o wielkości 100 mikronów na wierzchu 50-mililitrowej probówki i dodaj do sitka dwa mililitry lodowatego RPMI plus FBS.
Używając tłoka z pięciomililitrowej strzykawki, rozgnieć tkankę i umyj filtr świeżym podłożem, aż narząd zostanie całkowicie zmielony przez siatkę. Przenieś zawiesinę jednokomórkową do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawieś granulat w pięciu mililitrach pożywki o gradiencie gęstości 30%. Ostrożnie ułóż roztwór komórek na dwóch mililitrach pożywki o gradinie gęstości 70% w nowej 15-mililitrowej probówce i oddziel komórki przez wirowanie w gradionym gradinie gęstości.
Następnie przenieś komórki z interfazy między dwoma gradientami gęstości do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów zimnego RPMI plus FBS do kolejnego odwirowania i ponownie zawieś granulkę w 10 mililitrach lodowatego RPMI/FBS do liczenia. Aby przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, rozcieńczyć komórki do pięć razy 10 do sześciu komórek na 100 mikrolitrów stężenia buforu FACS i inkubować próbki komórek z 10 mikrolitrami przeciwciała blokującego anty-mysie CD16 / CD32 na próbkę. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej dodać 20 mikrolitrów komórek do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki okrągłodennej zgodnie z protokołem barwienia eksperymentalnej cytometrii przepływowej i dodać 20 mikrolitrów mieszanki tetrametu białka E do każdej studzienki na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej w ciemności.
Pod koniec inkubacji dodaj do komórek interesujące nas przeciwciała na powierzchni komórki na 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnie umyj komórki dwa razy 200 mikrolitrami buforu FACS na pranie i ostrożnie ponownie zawieś komórki w każdej studzience za pomocą 200 mikrolitrów świeżego buforu FACS. Następnie przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem, do czasu ich analizy na cytometrze przepływowym.
Patologiczne objawy przedmiotowe i przedmiotowe, takie jak mielooparaliza i niedowład ruchowy, obserwuje się u myszy z nokautem interferonu alfa/beta receptor 1 siedem dni po inokulacji wirusem Zika. Zmiany masy ciała u zakażonych zwierząt z nokautem receptora alfa/beta 1 interferonu monitorowano przez 15 dni, przy czym utratę masy ciała zaobserwowano po raz pierwszy cztery dni po zakażeniu, a powrót do masy ciała rozpoczął się w siódmym dniu po zakażeniu. Reprezentatywne obrazy zakażonych mózgów myszy ujawniają oczywisty obrzęk i przekrwienie siedem dni po zaszczepieniu wirusem Zika.
Reprezentatywne obrazy mysich jąder zakażonych wirusem Zika wykazują stopniowe kurczenie się od siódmego dnia do 30 dni po zakażeniu. Analiza histopatologiczna wycinków mózgu i jąder zakażonych wirusem Zika również ilustruje wpływ destrukcyjnych zmian patologicznych w porównaniu z niezakażonymi grupą kontrolną. Zgodnie z przewidywaniami wynikającymi z analiz makro i histopatologicznych, wysokie miano wirusa wykrywa się również w mózgu i jądrach myszy zakażonych wirusem Zika poprzez barwienie immunologiczne.
Towarzyszy temu silna infiltracja limfocytów T CD3-dodatnich do mózgu po zakażeniu wirusem Zika. Specyficzne dla wirusa Zika limfocyty T CD3-dodatnie i CD8-dodatnie są wykrywane zarówno u myszy zakażonych wirusem Zika, jak i uodpornionych szczepionką przez barwienie tetramerem białka E. Limfocyty T CD8-dodatnie specyficzne dla tetrameru białka E można również wykryć w mózgu i testach siedem dni po inokulacji wirusem Zika.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w badaniach nad charakterystyką specyficznych dla patogenu limfocytów T w narządach immunoprewalentnych podczas naturalnych infekcji w modelach zwierzęcych. Metoda ta może być również stosowana do innych narządów immunologicznych, takich jak łożysko czy oko, a także do infekcji wirusowych i nowotworów. Po tej procedurze tetramery MHC-I mogą być używane do immunohistochemicznego lub immunofluorescencyjnego wykrywania limfocytów T specyficznych dla patogenu, aby uzyskać dostęp do dystrybucji limfocytów T naciekających mózg lub jądra.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunuprzywilejowanych z wykorzystaniem mysiego modelu Ifnar1 -/- w infekcji wirusem Zika. Metoda ta jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów komórkowych zaangażowanych w skuteczność szczepionek przeciwko wirusowi Zika oraz w immunopatogenezę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Wirusologia
- Neuronauka
Wstęp
- Wirus Zika może powodować ciężkie schorzenia neurologiczne, w tym zespół Guillain-Barre.
- Limfocyty T pełnią podwójną rolę w eliminacji wirusa oraz w potencjalnej immunopatogenezie.
- Organy immunouprzywilejowane są kluczowymi miejscami badania odpowiedzi limfocytów T podczas infekcji.
- Mysi model Ifnar1 -/- umożliwia śledzenie limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika.
Cel badania
- Ocena odpowiedzi limfocytów T w narządach immunologicznie uprzywilejowanych podczas zakażenia wirusem Zika.
- Badanie udziału limfocytów T w immunoprotekcji i immunopatogenezie.
- Ocena skuteczności szczepionek przeciwko wirusowi Zika.
Zastosowane metody
- Inokulacja myszy Ifnar1 -/- wirusem Zika.
- Pobieranie tkanek (mózgu, jąder, śledziony) do analizy.
- Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek i analiza cytometryczna w celu charakterystyki limfocytów T.
- Monitorowanie objawów klinicznych i zmian masy ciała u zainfekowanych myszy.
Główne wyniki
- Skuteczna detekcja limfocytów T specyficznych dla antygenu w organach immunologicznie uprzywilejowanych.
- Identyfikacja charakterystyk limfocytów T przyczyniających się do immunopatogenezy.
- Obserwacja objawów patologicznych u zakażonych myszy.
- Wykazanie użyteczności metody w ocenie skuteczności szczepionek.
Wnioski
- Protokół dostarcza informacji na temat dynamiki limfocytów T podczas zakażenia wirusem Zika.
- Podkreśla on znaczenie organów immunologicznie uprzywilejowanych w odpowiedziach wirusowych.
- Metoda ta może pomóc w opracowaniu skutecznych szczepionek przeciwko wirusowi Zika.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie dynamiki limfocytów T w organach immunologicznie uprzywilejowanych jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanych z kandydatami na szczepionki oraz szlakami mechanistycznymi w opracowywaniu leków przeciwwirusowych. Metoda ta umożliwia bezpośrednią ocenę udziału antygenowo swoistych limfocytów T zarówno w ochronie, jak i w patologii, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnych fazach programów immunologicznych. Poprzez powiązanie infiltracji limfocytów T z wynikami funkcjonalnymi w tkankach mózgu i jąder, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla wirusów neurotropowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących eliminacji wirusów za pośrednictwem limfocytów T w przeciwieństwie do immunopatogenezy w miejscach sanktuarium.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny schemat postępowania w celu izolacji i charakteryzacji infiltrujących limfocytów T z tkanek mózgu, jąder oraz śledziony.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez powiązanie odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu z następstwami patologicznymi, takimi jak zanik jąder i neurostan zapalny.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie zestandaryzowanych zawiesin pojedynczych komórek z narządów immunuprzywilejowanych w celu zapewnienia spójności analizy cytometrycznej.
- Wynik ilościowy: Umożliwia precyzyjny pomiar komórek T CD8+ tetramer-dodatnich jako funkcjonalny wskaźnik odpowiedzi swoistej dla antygenu.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Metoda barwienia tetramerami może zostać zaadaptowana do innych antygenów wirusowych lub epitopów związanych z nowotworami w modelach przedklinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje neuropatogenezę wirusa Zika oraz uszkodzenia jąder u ludzi poprzez mierzalną infiltrację limfocytów T i patologię tkanek.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odpowiedzi limfocytów T indukowane szczepionką w śledzionie z funkcjami efektorowymi w mózgu i jądrach, wspierając spójność biomarkerów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Pomaga odróżnić protekcyjne od patogennych fenotypów limfocytów T, co dostarcza informacji niezbędnych do wyboru kandydatów i strategii dawkowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów immunomodulacyjnych przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dualizmu limfocytów T w infekcjach wirusowych poprzez śledzenie komórek swoistych dla antygenu w tkankach docelowych.
- Screening: Dostarcza zawiesiny tkankowe gotowe do analizy, z wystandaryzowanymi protokołami oceny żywotności i barwienia, zapewniając wysoką wiarygodność cytometrii przepływowej.
- Analityka: Generuje ilościowe, multiparametryczne dane na temat fenotypu, częstości występowania i potencjału funkcjonalnego limfocytów T za pomocą barwienia tetramerami i markerami powierzchniowymi.
- Badania translacyjne: Łączy proces primingu immunologicznego w śledzionie z aktywnością efektorowych limfocytów T w miejscach immunologicznie uprzywilejowanych, co ma znaczenie dla przewidywania skuteczności szczepionek.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy modułową platformę do badania swoistych dla patogenów limfocytów T w tkankach OUN, układzie rozrodczym lub tkankach oka w ramach programów dotyczących chorób zakaźnych i onkologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w immunopatogenezie poprzez rozróżnienie nacieku limfocytów T swoistych dla antygenu od komórek typu bystander.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury przetwarzania tkanek, izolacji komórek i barwienia w różnych laboratoriach w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesną identyfikację nieochronnych lub szkodliwych odpowiedzi immunologicznych w fazie rozwoju przedklinicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na szczepionki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zdolność do wywoływania korzystnych odpowiedzi limfocytów T bez nasilania uszkodzeń tkanek.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w sekcji tkanek mysich, cytometrii przepływowej oraz pracy z odczynnikami tetramerowymi.
- Zależne od dostępu do myszy Ifnar1-/- oraz laboratoriów o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) do pracy z wirusem Zika.
- Wymaga standaryzacji protokołów trawienia tkanek i gradientów gęstości w celu zapewnienia powtarzalnej wydajności pozyskiwania leukocytów.
- Należy uwzględnić zmienność efektywności barwienia tetramerami w preparatach komórkowych pochodzących z różnych organów.
- Ograniczone przez zdolność modelu mysiego do pełnego odtworzenia architektury organów immunologicznie uprzywilejowanych oraz kinetyki odpowiedzi immunologicznej człowieka.
