Izolacja i identyfikacja pozanaczyniowych komórek odpornościowych serca
August 23rd, 2018
Ten protokół przedstawia prostą i efektywną metodę izolacji, identyfikacji i ilościowego oznaczania komórek odpornościowych znajdujących się w mięśniu sercowym myszy podczas stanu stacjonarnego lub zapalnego. Protokół łączy trawienie enzymatyczne i mechaniczne w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, która może być dalej analizowana za pomocą cytometrii przepływowej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące składu podzbiorów komórek odpornościowych w sercu, zarówno w stanie stacjonarnym, jak i chorobowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do dokładnego immunofenotypowania populacji komórek odpornościowych serca, w tym bardzo rzadkich podzbiorów. Ten protokół jest stosunkowo prosty.
Jednak zastrzyki do żyły ogonowej mogą być trudne, dlatego ważne jest, aby ćwiczyć tę technikę, dopóki nie poczujesz się komfortowo przed użyciem zwierząt doświadczalnych. Aby oznaczyć krążące leukocyty, załaduj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego mysiego przeciwciała anty-CD45 sprzężonego z fluoroforem w PBS do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 i ogrzej osiem 12-tygodniowych myszy na krążącym kocu wodnym ustawionym na 35 do 41 stopni Celsjusza przez pięć do dziesięciu minut. Gdy żyła ogonowa rozszerzy się, należy unieruchomić pierwsze zwierzę w pozycji mostkowej za pomocą odpowiedniego urządzenia krępującego.
Jeśli żyły ogonowe nie są wystarczająco rozszerzone, zanurz ogon w wodzie o temperaturze od 36 do 40 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut. Gdy żyły ogonowe są gotowe, przetrzyj obszar wstrzyknięcia gazą nasączoną 70% etanolem i unieruchamij podstawę ogona palcami wskazującym i środkowym oraz środkową część ogona kciukiem i palcem serdecznym. Trzymając igłę skośnie do góry i równolegle do żyły, wprowadzić igłę do rozszerzonej żyły ogonowej i dożylnie wstrzyknąć całą objętość przeciwciała.
Następnie pozwól przeciwciału krążyć przez pięć minut przed humanitarną eutanazją. Aby zebrać serce, spryskaj mysz 70% etanolem i unieś skórę brzucha, aby otworzyć brzuch wzdłuż brzusznej linii środkowej od bioder do mostka. Otwórz otrzewną i przesuń wątrobę, aby odsłonić przeponę.
Przetnij przeponę i żebra po obu stronach linii środkowej, uważając, aby nie przebić płuc i serca. Oderwij żebra, aby odsłonić serce przed nacięciem lewego i prawego przedsionka. Delikatnie chwytając podstawę serca kleszczami, włóż igłę o rozmiarze 21 przymocowaną do 60-mililitrowej strzykawki do lewej komory w pobliżu wierzchołka i przeprowadź perfuzję serca 15 do 20 mililitrami zimnego PBS.
Prawidłowa perfuzja serca jest niezbędna, aby uniknąć zanieczyszczeń wewnątrznaczyniowych. Dlatego należy zadbać o to, aby po eutanazji przeprowadzić sekcję i perfuzję serca, aby uniknąć zanieczyszczenia spowodowanego zakrzepłą krwią. Po perfuzji prawej komory, jak właśnie pokazano, należy zaobserwować białe płuca i bladą wątrobę.
Trzymając podstawę serca kleszczami, delikatnie pociągnij serce do góry i przetnij główne tętnice i żyły płucne, aortę i worek osierdziowy, aby odłączyć tkankę serca. Delikatnie trzymając serce między kciukiem a palcem wskazującym, ostrożnie oczyść serce czystym, niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym i użyj kleszczy, aby usunąć przedsionki i wszelkie pozostałości głównych tętnic i żył lub innych zanieczyszczeń. Umieść oczyszczone serce w pięciocentymetrowym plastikowym naczyniu i dodaj 50 mikrolitrów zimnego PBS.
Za pomocą zakrzywionych nożyczek preparacyjnych miel serce, aż nie będzie żadnych widocznych kawałków, a tkanka będzie miała gładką, gęstą konsystencję. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby przenieść tkankę do dwumililitrowych probówek wirówkowych zawierających 800 mikrolitrów zimnego DMEM. Uzupełnij kolagenazą, DNazą i hialuronidazą i inkubuj przez 45 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 50 obr./min.
Pod koniec trawienia należy wirować próbki przez 20 sekund i natychmiast umieścić je na lodzie. Próbka powinna być zawsze przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chyba że określono inaczej, ponieważ niektóre antygeny powierzchniowe mogą zostać zinternalizowane, jeśli zostaną pozostawione w temperaturze pokojowej. Następnie wstępnie zwilżyć sitko o pojemności 140 mikrolitrów w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów na próbkę z jednym mililitrem zimnego HBB.
Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra pipetować próbki, aż zawiesiny tkanek staną się jednorodne i nie zatkają końcówki pipety, a następnie dodać homogenizowane próbki do filtrów. Powoli przemyj próbki przez filtry z 12 do 14 mililitrami zimnego HBB na próbkę i przenieś przefiltrowane próbki do oznakowanej 15-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie. O dobrym trawieniu świadczy brak resztek serca w filtrze.
Pobrać próbki przez odwirowanie i usunąć supernatant. Dodać jeden mililitr buforu do lizy potasu chlorku amonu do każdej próbki. Ponownie zawiesić próbki za pomocą krótkiego wirowania, a następnie pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej.
Następnie przerwij hemolizę za pomocą pięciu do ośmiu mililitrów zimnego HBSS. Zebrać próbki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze aktywowanego fluorescencją sortowania komórek lub buforze FACS i przenieść do indywidualnych 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek w celu ponownego odwirowania. Aby przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach przeciwciała anty-CD16 / CD32 i blokera monocytów w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciał przez 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Bez mycia dodać 50 mikrolitrów głównej mieszanki przeciwciał do każdej próbki z mieszaniem przez 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronioną przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki 600 mikrolitrami buforu FACS na probówkę i ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach świeżego buforu FACS lub 1% paraformaldehydu. Następnie przeanalizuj leukocyty serca za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami analizy przepływu.
Analiza zawiesiny pojedynczej komórki serca za pomocą cytometrii przepływowej wymaga wstępnego bramkowania CD45 w celu odróżnienia komórek odpornościowych od nieimmunologicznych komórek serca, a następnie bramkowania pojedynczej komórki i wykluczenia o małych rozmiarach. Makrofagi, identyfikowane na podstawie ekspresji CD64, są główną populacją komórek odpornościowych serca, stanowiąc od 60 do 70% wszystkich komórek odpornościowych. Konwencjonalne sercowe komórki dendrytyczne to komórki CD64-ujemne, które wyrażają wysokie poziomy MHC klasy II i CD11c.
Komórki te można dalej dzielić na podstawie ekspresji CD103 lub CD11b i reprezentują znacznie mniejszą subpopulację serca w porównaniu z makrofagami. Zastosowanie cytometrii przepływowej zawiesiny pojedynczej komórki mięśnia sercowego pozwala na badanie małych subpopulacji leukocytów w sercu. Na przykład, stosując analizę cytometrii przepływowej w celu porównania komórek odpornościowych mięśnia sercowego typu dzikiego z myszami z niedoborem Batf3, można potwierdzić brak komórek dendrytycznych CD103-dodatnich u zwierząt z nokautem.
Ponadto analiza ta wykazała brak znaczących zmian w składzie innych populacji serca u zwierząt z niedoborem Batf3, co pokazuje stopień czułości, jaki można osiągnąć przy użyciu tej połączonej metody trawienia enzymatycznego i mechanicznego w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby zawsze brać pod uwagę żywotność izolatu komórkowego. Dlatego zalecamy optymalizację czasu i stężenia enzymów w trawieniu zgodnie z warunkami eksperymentalnymi.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, testy funkcjonalne i izolacja kulek magnetycznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcji izolowanych komórek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia prostą i efektywną metodę izolowania, identyfikowania i ilościowego określania komórek odpornościowych znajdujących się w mięśniu sercowym myszy w stanie stacjonarnym lub podczas stanu zapalnego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące składu podzbiorów komórek odpornościowych w sercu zarówno w stanie stacjonarnym, jak i chorobowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Kardiologia
- Cytometria przepływowa
Tło
- Serce zawiera różne populacje komórek odpornościowych.
- Rozumienie tych populacji jest kluczowe dla zdrowia serca.
- Dokładne immunofenotypyzacja jest konieczna do badania rzadkich podzbiorów odpornościowych.
- Wstrzyknięcia do żyły ogonowej są powszechną metodą oznakowywania krążących leukocytów.
Cel badania
- Izolowanie i ilościowe określenie komórek odpornościowych w mięśniu sercowym.
- Analiza podzbiorów komórek odpornościowych w różnych stanach fizjologicznych.
- Ulepszenie technik badania odpowiedzi odpornościowych serca.
Zastosowanie metod
- Trawienie enzymatyczne i mechaniczne w celu stworzenia pojedynczej zawiesiny komórek.
- Cytometria przepływowa do analizy populacji komórek odpornościowych.
- Wstrzyknięcia do żyły ogonowej przeciwciała przeciwko CD45 sprzężonego z fluoroforem.
- Podgrzewanie myszy w celu ułatwienia dostępu do żyły ogonowej.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja komórek odpornościowych z mięśnia sercowego myszy.
- Identyfikacja różnych podzbiorów komórek odpornościowych.
- Wykazanie skuteczności techniki zarówno w stanie stacjonarnym, jak i zapalnym.
- Podkreślenie znaczenia ćwiczeń dla udanych wstrzyknięć do żyły ogonowej.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę badania komórek odpornościowych serca.
- Zwiększa zrozumienie odpowiedzi odpornościowych w sercu.
- Technika ta jest dostępna dla badaczy z odpowiednim szkoleniem.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate profiling of cardiac immune cell subsets enables mechanistic de-risking in cardiovascular target validation by clarifying inflammatory pathways and immune-mediated mechanisms of action. This method supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible immunophenotyping data that informs go/no-go decisions in early discovery. The approach addresses a critical gap in studying rare but functionally significant immune populations during steady-state conditions, enhancing translational relevance for immuno-cardiology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell composition and functional compartmentalization in the myocardium.
- Operational Value: Provides a reliable method to distinguish true tissue-resident immune signals from intravascular contamination, improving data integrity.
- Strategic Value: Supports target de-risking through precise identification of macrophage and dendritic cell subsets implicated in cardiac inflammation and fibrosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a standardized single-cell suspension suitable for high-dimensional flow cytometry panels, enabling consistent immunophenotyping across experiments.
- Operational Value: Combines enzymatic and mechanical digestion with vascular labeling to achieve high viability and purity, reducing assay variability.
- Strategic Value: Establishes a reproducible workflow for immune cell isolation that can be adapted across disease models and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates longitudinal immune monitoring from steady state to inflammatory conditions, supporting biomarker discovery and mechanistic insight.
- Operational Value: Outputs are compatible with downstream applications such as FACS sorting, magnetic bead separation, and single-cell RNA sequencing for functional validation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by confirming target engagement and immune modulation in relevant preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing immune profiling data that informs mechanism of action and safety assessment in cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of key immune subsets like CD64+ macrophages and CD11c+ MHC-IIhi dendritic cells in the heart.
- Screening: Delivers quantitative, flow-cytometry-ready single-cell suspensions that allow comparison of immune composition across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Generates multi-parametric immune phenotypes (e.g., CD103+ vs CD11b+ dendritic cell ratios) that help de-risk targets by revealing subset-specific responses.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics to disease progression, supporting biomarker alignment in models of cardiac inflammation and remodeling.
- Enterprise Reuse: The core isolation and labeling strategy is adaptable to other organs and disease areas, promoting cross-platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling confident identification of rare immune subsets that drive cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Standardizes immune cell isolation through defined enzymatic digestion, vascular labeling, and flow cytometry gating strategies.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by providing immune-mediated mechanism data that informs combination therapy and patient stratification strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making through reproducible quantification of immune cell changes in preclinical efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, tail vein injection techniques, and aseptic tissue dissection to ensure sample quality.
- Dependent on access to flow cytometry equipment, fluorescence-conjugated antibodies, and enzymatic reagents (collagenase, hyaluronidase, DNAse).
- Necessitates standardization of perfusion, digestion, and lysis timing across operators to minimize variability in immune cell yield and viability.
- Requires optimization of enzyme concentration and incubation time based on heart size, age, and disease state to preserve epitope integrity.
- Limited by the need for immediate processing post-excision to prevent surface antigen internalization and maintain staining fidelity.
