Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Ogólnym celem tej procedury jest selektywne celowanie w potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy w celu oceny skuteczności in vivo radioterapii wiązką zewnętrzną małych zwierząt. Główną zaletą terapii wiązką promieniowania zewnętrznego jest to, że jest to terapia celowana w teramtomiach związanych z komórkami macierzystymi, która pozwala uniknąć niepożądanych skutków terapii podawanych ogólnoustrojowo. Postępy w radioterapii wiązką zewnętrzną umożliwiły specyficzne celowanie w małe potworniaki przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia normalnych tkanek, dzięki czemu terapia ta jest idealna do leczenia potworniaków wrażliwych na promieniowanie.

Metoda ta może nie tylko zapewnić wgląd w strategie optymalizacji terapii komórkowych, ale ma również potencjał, aby stać się klinicznie stosowana w terapiach u ludzi. Rozpocznij od pobrania sześciodołkowej płytki zawierającej iPSC. Aby wywołać tworzenie się tetratomy u zwierząt z niedoborem odporności, dodaj jeden mililitr mieszanki enzymów dysocjacji komórek rekombinowanych na dołek 6-dołkowej płytki zawierającej ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste transdukowane genem reporterowym podwójnej fuzji przez pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji rozproszyć komórki przez pipetowanie i zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając równą objętość pożywki do hodowli komórkowej do każdego dołka. Wyciągnij zawiesiny jednokomórkowe do 15-mililitrowej stożkowej rurki do liczenia. Po zakończeniu wirowania odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 mikrolitrach roztworu matrycowego Matrigel i umieścić probówkę na lodzie.

W przypadku wykorzystania komórek transfekowanych z podwójnym raportagenem fuzyjnym, te komórki o podwójnym pozytywnym wpływie powinny być również zawieszone w 30 mikrolitrach matrycy. Następnie załaduj każdą populację komórek do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 28,5 i potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u każdego znieczulonego ośmio- do 10-tygodniowego atymicznego nagiego biorcy myszy. Następnie wstrzyknąć podskórnie jedną mieszaninę macierzy komórkowej w grzbietowy bok każdego biorcy.

W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym po inokulacji wstrzyknąć dootrzewnowo każdemu biorcy 375 miligramów na kilogram delucyferonu. Po 10 minutach zobrazuj sygnał bioluminescencji w każdej znieczulonej sondzie reporterowej, której wstrzyknięto zwierzęciu przez 30 minut, używając jednominutowych okien akwizycji w odstępach pięciominutowych, zgodnie ze standardowymi protokołami obrazowania bioluminescencyjnego. W przypadku napromieniania potworniaka, w odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym, najpierw umieść znieczulone zwierzę biorcy na łóżku przedklinicznego promiennika sterowanego obrazem i uzyskaj zestaw 400 projekcyjnych obrazów tomografii mikrokomputerowej w zakresie 360 stopni przy użyciu 40 szczytowych kilonapięciowych, 2-miliamperowej wiązki promieniowania rentgenowskiego i zrekonstruuj obraz w obrazy wolumetryczne o izotropowym rozmiarze piksela 0,2 milimetra.

Bardzo ważne jest zrekonstruowanie obrazów wolumetrycznych potwornych. Obrazy te pomogą zaplanować radioterapię pod kątem konkretnego dostarczania terapii tylko do potworniaków, jednocześnie minimalizując promieniowanie otaczających tkanek poza celem. Następnie skorzystaj z obrazów mikrotomografii komputerowej i pakietu oprogramowania do obrazowania RT, aby zaplanować protokół radioterapii.

Lek należy podawać przez trzy kolejne dni, aby dostarczyć w sumie 18 szarych komórek do guza docelowego. Myszy, którym wstrzyknięto implanty, zazwyczaj wykazują powstawanie potworniaka od czterech do ośmiu tygodni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, co potwierdza obrazowanie bioluminescencyjne. Po napromieniowaniu skumulowaną liczbą 18 grejów w ciągu miesiąca po dostarczeniu komórek, guzy dramatycznie się zmniejszą, co spowoduje znaczny zbieżny spadek sygnału lucyferazy.

Co ważne, jak pokazują te obrazy, normalne biopsje tkanek pobrane z napromieniowanego miejsca nie wydają się doznawać żadnych znaczących uszkodzeń. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak tworzyć potworniaki pochodzące z komórek macierzystych in vivo oraz skutecznie i bezpiecznie leczyć je promieniowaniem wiązką zewnętrzną. To proste podejście wymaga pozyskania obrazów CT o wysokiej rozdzielczości pacjenta, po czym można przepisać serię terapii wiązką promieniowania w celu napromieniowania docelowych guzów, unikając jednocześnie sąsiednich tkanek.

Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich osłon.