Name: Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Poznaj metodę celowanego leczenia potworniaków pochodzących z komórek macierzystych u myszy za pomocą promieniowania wiązki zewnętrznej. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanek otaczających i ma potencjał zastosowania klinicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować National Institutes of Health R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) i 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); oraz Stanford Cardiovascular Institute (ASL) za wsparcie.

Ten eksperyment na zwierzętach został zatwierdzony i przeprowadzony przez Institutional Review Board oraz Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi na Uniwersytecie Stanforda.
1. Hodowla komórkowa iPSC
<ol>
	<li>Hoduj ludzkie iPSC pochodzące z przeprogramowania lentiwirusa na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej (np. Matrigel, zwaną dalej matrycą).</li>
	<li>Codziennie zmieniaj pożywki iPSC za pomocą wzbogaconej pożywki hodowlanej (patrz tabela materiałów) inkubując w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80–90% konfluencji (mniej więcej co 4 dni), dodać 1 ml rekombinowanego enzymu dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Po 5 minutach oddzielić komórki od studzienki przez pipetowanie, przenieść je do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy we wzbogaconej pożywce hodowlanej (patrz tabela materiałów) wzbogaconej inhibitorem Y27632 w rozcieńczeniu 1:1,000.</li>
	<li>Przeprowadzić zliczanie zdysocjowanych komórek i ponownie poszczepić komórki na pokrytych matrycą płytkach 6-dołkowych o gęstości od 2 x 105 do 4 x 105.</li>
</ol>
2. Transdukcja iPSC za pomocą genu reporterowego podwójnej fuzji
<ol>
	<li>Pasaż iPSC w płytkach 6-dołkowych zgodnie z procedurą i dodać wzbogaconą pożywkę hodowlaną (patrz tabela materiałów) zawierającą 6 μg/ml bromku heksadimetryny. 
	nuta: Idealna wielkość kolonii to 200–400 komórek/kolonię, aby uzyskać najwyższą wydajność transdukcji.</li>
	<li>Koncentrat samoinaktywującego się lentiwirusa przenoszącego lucyferazy świetlika i białko zielonej fluorescencji (FLuc-eGFP) napędzany ludzkim promotorem ubikwityny-C przez wirowanie osadu za pomocą wirnika SW-29 przy 50 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać koncentrat wirusa do iPSC na 6-dołkowej płytce przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, 
	nuta: Wielokrotność infekcji określono na podstawie ekspresji monomerycznego białka fluorescencyjnego analizowanego za pomocą skanu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).</li>
	<li>Następnego dnia usunąć wirusa przez odwirowanie 6-dołkowych płytek iPSC o sile 300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Codziennie zmieniaj pożywkę za pomocą wzbogaconej pożywki hodowlanej (patrz tabela materiałów) i pasażu zgodnie z protokołem. Wykorzystaj mikroskop fluorescencyjny, aby określić przybliżoną wydajność transdukcji dla eGFP.</li>
	<li>Wydajność 30–40% jest wystarczająca do sortowania FACS. Przejdź do FACS hiPSC eksprymujących eGFP, jeśli co najmniej 30-40% komórek wykazuje ekspresję eGFP.</li>
	<li>Aby potwierdzić aktywność FLuc ex vivo, należy płytkować komórki wyrażające GFP posortowane przez FACS w gęstości 5,000 komórek na studzienkę.</li>
	<li>Inkubować transdukowane komórki i nietransdukowane komórki (które będą służyć jako kontrola ujemna) za pomocą bioluminescencyjnej sondy reporterowej D-lucyferyny (100 μmol/l) przez 6 godzin. Zmierz bioluminescencję za pomocą spektrofluorometru mikropłytki.</li>
</ol>
3. Przeszczepienie PSC w bok grzbietowy w celu powstania potworniaka u myszy z niedoborem odporności
<ol>
	<li>Dodać 1 ml rekombinowanej mieszaniny enzymów dysocjacji komórek na 6-dołkową płytkę zawierającą ludzkie iPSC transdukowane genem reporterowym podwójnej fuzji (FLuc-GFP) w hodowli (patrz sekcja 2) i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Po okresie inkubacji rozproszyć komórki przez aspirację pipetą i ekspresję. Dodać równą objętość pożywki hodowlanej, a następnie odwirować przy 250 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Po zakończeniu wirowania odessać roztwór sklarowanego osadu, ponownie zawiesić osad komórek w 30 μl matrycy i umieścić go na lodzie, aby zachować jego żywotność przed wstrzyknięciem. Potwierdź zbiór 1 x 106 komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>W przypadku korzystania z komórek transfekowanych genem reporterowym o podwójnej fuzji, zawieś podwójnie dodatnie komórki FACS (z sekcji 2) w 30 μl matrycy.</li>
	<li>Wywołaj znieczulenie u 8-10 tygodniowych atymicznych nagich myszy za pomocą 2% izoflurancji z 1 l / min tlenu, a następnie zastosuj 2% izofluranu podtrzymującego z 1 l / min tlenu.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o masie 28,5 g wstrzyknąć zawiesinę mieszaniny komórek/matryc (patrz tabela materiałów) w przestrzeń podskórną po boku, dążąc do wstrzyknięcia łącznie 5 x 103 do 5 x 106 komórek (około 100 ul na wstrzyknięcie).</li>
	<li>Rozważ bardziej doogonowe miejsce wstrzyknięcia, jeśli planujesz utrzymać myszy przez dłuższy czas i przewidujesz wzrost dużego guza. </li>
	<li>Znieczulonym zwierzętom pozwala się na rekonwalescencję na podgrzewanej podkładce do czasu chodzenia (zwykle <1 godzina) z monitorowaniem częstości oddechów, koloru skóry palców u nóg do czasu rozpoczęcia chodzenia. </li>
</ol>
4. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) przeszczepionych komórek w celu oceny przeżycia komórek i wzrostu potworniaka
<ol>
	<li>W pożądanych punktach czasowych po inokulacji wykonaj dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 375 mg / kg sondy reporterowej D-Lucyferyny do myszy.</li>
	<li>10 minut po wstrzyknięciu IP zobrazuj sygnał bioluminescencji u znieczulonych zwierząt (wykonywany zgodnie z opisem w kroku 3.5) przez 30 minut, używając 1-minutowych okien akwizycji w odstępach 5-minutowych. 
	nuta: Zalecane jest cotygodniowe pozyskiwanie obrazu. Znieczulenie jest utrzymywane podczas obrazowania poprzez dostarczanie wziewnego izofluranu przez stożek nosowy.</li>
	<li>W celu analizy danych narysuj obszar zainteresowania (ROI) nad sygnałem BLI, a następnie znormalizuj czas akwizycji, aby określić ilościowo emisje w jednostkach maksymalnych fotonów na sekundę na centymetr kwadratowy na steradian (fotony/s/cm2/sr).</li>
</ol>
5. Napromienianie potworniaka za pomocą przedklinicznego naświetlacza sterowanego obrazem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Znieczulij mysz w pudełku do knockdown za pomocą 2% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min. Po całkowitym znieczuleniu myszy przenieś ją na łóżko przedklinicznego napromiennika sterowanego obrazem (patrz Tabela materiałów). Utrzymuj znieczulenie przez 2% izofluranu w sposób ciągły przez stożek nosowy.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów mikro-CT jako zestawu 400 obrazów projekcyjnych w zakresie 360° przy użyciu wiązki promieniowania rentgenowskiego 40 kVp, 2 mA i rekonstruowanie ich w obrazy wolumetryczne o izotropowym rozmiarze piksela 0,2 mm.</li>
	<li>Zaplanuj radioterapię na podstawie obrazów mikrotomografii komputerowej za pomocą pakietu oprogramowania RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) i wykonaj zabieg. 
	nuta: Zastosowany plan leczenia składa się z dwóch wiązek promieniowania rentgenowskiego o napięciu 225 kVp, zorientowanych tak, aby przechodziły przez powierzchowny potworniak docelowy, omijając powierzchnię reszty myszy i oszczędzając leżące poniżej wnętrzności. Czasy ekspozycji dla wiązek są dostosowywane na podstawie kwartalnych danych kalibracyjnych systemu, tak aby dawka w środku docelowego guza wynosiła 6 Gy.</li>
	<li>Powtórz proces leczenia przez trzy kolejne dni, aby dostarczyć łącznie 18 Gy do guza docelowego.</li>
	<li>Utrzymuj standardową opiekę pozabiegową nad zwierzętami.</li>
</ol>

<ol><li>Sallam, K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+biology%3A+insights+from+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).</li>
<li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLOS Medicine. 6 (2), e1000029(2009).</li>
<li>Kuriyan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+Loss+after+Intravitreal+Injection+of+Autologous+%26%2334%3BStem+Cells%26%2334%3B+for+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous &#34;Stem Cells&#34; for AMD.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).</li>
<li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+%26%2334%3BStem-Cell+Tourism%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &#34;Stem-Cell Tourism&#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).</li>
<li>Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. <a target="_blank" href="https://www.stembook.org/node/723">StemBook</a>. , The Stem Cell Research Community. (2012).</li>
<li>Scott, C. T., Magnus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wrongful+termination%3A+lessons+from+the+Geron+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).</li>
<li>Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geron+trial+resumes%2C+but+standards+for+stem+cell+trials+remain+elusive%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive.</a> Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).</li>
<li>Coghlan, A. <a target="_blank" href="http://connection.ebscohost.com/c/articles/108773320/unexpected-mutations-put-stem-cell-trial-hold">Unexpected mutations put stem cell trial on hold.</a> New Scientist. 227 (3033), 9(2015).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).</li>
<li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cell+number+on+teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells.</a> Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).</li>
<li>Tano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+method+for+detecting+undifferentiated+human+pluripotent+stem+cells+as+impurities+in+cell+therapy+products+using+a+highly+efficient+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system.</a> PLoS One. 9 (10), e110496(2014).</li>
<li>Kuroda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vitro+methods+for+detection+of+residual+undifferentiated+cells+in+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37342(2012).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+embryonic+stem+cell+misbehavior+and+suicide+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).</li>
<li>Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+Mutations%2C+Ganciclovir+Resistance%2C+and+Teratoma+Formation+in+Human+iPSCs+Expressing+an+HSVtk+Suicide+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284(2016).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+susceptibility+to+DNA+damage+of+pluripotent+stem+cells+facilitates+pharmacologic+purging+of+teratoma+risk%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).</li>
<li>Choo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+against+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+by+a+cytotoxic+antibody+recognizing+podocalyxin-like+protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1.</a> Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).</li>
<li>Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+safety+in+external+beam+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">Patient safety in external beam radiation therapy.</a> American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+micro-computed+tomography-based+image-guided+conformal+radiotherapy+system+for+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+%E2%80%A2+Biology+%E2%80%A2+Physics%22%5BJournal%5D)">Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals.</a> International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).</li>
<li>Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subacute+neuropathological+effects+of+microplanar+beams+of+x-rays+from+a+synchrotron+wiggler%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).</li>
<li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Report%3A+External+Beam+Radiation+Therapy+for+the+Treatment+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Teratomas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas.</a> Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).</li>
<li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+%26%2334%3BStem-Cell+Tourism%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &#34;Stem-Cell Tourism&#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).</li>
<li>Swijnenburg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+stem+cells+reveals+patterns+of+survival+and+immune+rejection+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+de+novo+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation.</a> Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).</li>
<li>Priddle, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+human+embryonic+stem+cells+transplanted+in+vivo+in+murine+and+chick+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models.</a> Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).</li>
<li>Dale, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-rate+effects+in+targeted+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Dose-rate effects in targeted radiotherapy.</a> Physics in Medicine & Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dane przedkliniczne i anegdotyczne przypadki ofiar "turystyki komórek macierzystych" potwierdzają, że ryzyko rozwoju potworniaków jest poważną wadą związaną z leczeniem PSC23. Opracowanie ostrożnych metod zapobiegania i leczenia ryzyka nowotworów związanych z terapiami komórkami macierzystymi jest zatem ważnym krokiem w kierunku ułatwienia klinicznego przełożenia terapii regeneracyjnymi komórkami macierzystymi. W artykule opisano metodę terapeutycznego celowania w potworniaki związane z PSC za pom...

Rozwój terapii komórkami macierzystymi do regeneracji tkanek napotkał w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat szereg przeszkód, utrudniając wysiłki na rzecz efektywnego wdrożenia klinicznego. Przeszkody te obejmują słabą retencję komórek w miejscach porodu, immunogenność komórek macierzystych oraz potencjał nowotworowy do tworzenia teratomas1. Ratotwórczość jest szczególnie niekorzystna klinicznie, ponieważ może potencjalnie zaszkodzić biorcom przeszczepów komórek macierzystych2. Przypadki powstawania nowotworów w wyniku niekontrolowanych wstrzyknięć komórek macierzystych zostały już zgłoszone w wielu warunkach klinicznych3,4,5. Możliwość powstawania potworniaków jest najczęściej wymienianym problemem klinicznym w rozwoju pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) i doprowadziła do opóźnień i anulowań wielu głośnych badań klinicznych na embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC)6,7,8,9. W związku z tym istnieje pilna potrzeba przeprowadzenia badań translacyjnych w celu zapewnienia odpowiedniego leczenia, jeśli pojawią się te jatrogenne nowotwory.
Do tej pory większość strategii kontroli niewłaściwego zachowania komórek macierzystych koncentrowała się na zmniejszeniu liczby PSC o potencjale rakotwórczym2,10. Niestety, do powstania potworniaka wymagana jest tylko niewielka liczba komórek resztkowych (np. 1 x 104 do 1 x 105 komórek11), która jest znacznie poniżej granicy wykrywalności podanej przez obecnie dostępne testy12,13. Inne ograniczenia związane ze stosowaniem tych metod wstępnej separacji obejmują niską wydajność i wysokie koszty, poleganie na zawiesinach pojedynczych komórek, które mogą nie być odpowiednie dla nowszych podejść inżynierii tkankowej, oraz potencjalne upośledzenie przeżywalności i wszczepienia komórek.
Niewiele badań dotyczyło możliwości leczenia po powstaniu potworniaka. Być może najlepiej zbadaną strategią jest włączenie genów "samobójczych" do komórek macierzystych14,15. Metoda ta polega na genetycznej manipulacji komórkami macierzystymi w celu włączenia indukowalnego genu aktywującego apoptozę, który może być aktywowany przez stymulację farmakologiczną po wstrzyknięciu, zapewniając w ten sposób podejście ratunkowe, jeśli wstrzyknięte komórki wytwarzają potworniaki. Podejście to ma jednak istotne wady, w tym niezamierzone skutki modyfikacji genetycznych PSC oraz możliwość stopniowego rozwoju oporności na leki16. Podobne podejście wykorzystuje małe cząsteczki do indukowania selektywnej śmierci komórek PSC poprzez hamowanie szlaków antyapoptotycznych17. Inne grupy skupiały się na śmierci komórek PSC za pomocą przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym pluripotencji, takim jak białko podobne do podokalixiny-1 (PODXL)18. Czas podania małych cząsteczek lub przeciwciał może mieć znaczący wpływ na potencjał terapeutyczny PSC, jeśli zostaną dostarczone zbyt wcześnie i mogą nie mieć skuteczności terapeutycznej, jeśli zostaną dostarczone zbyt późno. Ponadto nie badano ogólnoustrojowego działania małych cząsteczek i przeciwciał stosowanych w ten sposób.
Alternatywne podejście do leczenia tych nowotworów polega na użyciu radioterapii wiązką zewnętrzną (EBRT). EBRT jest jedną z podstawowych metod stosowanych obecnie w leczeniu guzów litych19. Innowacje w EBRT, w tym rozwój wiązki protonów i radiochirurgii stereotaktycznej, umożliwiły lepsze celowanie w struktury patologiczne przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia normalnej tkanki, dzięki czemu konforemny EBRT idealnie nadaje się do rozwiązywania problemów związanych z powstawaniem potworniaków w strukturach anatomicznie wrażliwych20. Ponadto metoda ta pozwala uniknąć manipulacji genetycznych lub transdukcji wirusowej komórek macierzystych, które są obarczone dodatkowymi obawami dotyczącymi bezpieczeństwa klinicznego i skuteczności15. Wreszcie, postępy w dziedzinie mikropromienników umożliwiły zastosowanie EBRT u gryzoni21.
W tym artykule pokazujemy, jak stworzyć model powstawania potworniaka dla małych zwierząt, wstrzykując myszom ludzkie iPSC. Następnie pokazujemy, jak stosować EBRT, aby selektywnie wyeliminować te nowotwory in vivo przy minimalnym uszkodzeniu otaczającej tkanki. Podejście to zapewnia celowaną terapię potworniaków pochodzących z PSC, unikając jednocześnie niedocelowych skutków ogólnoustrojowego dostarczania cząsteczek biologicznych i peptydów oraz manipulacji genetycznej PSC. Do celów badawczych oferujemy opcjonalny etap transdukcji komórek macierzystych z genami reporterowymi w celu śledzenia odpowiedzi guza na radioterapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI).

<table><tbody><tr><td>Indukowana pluripotencjalna linia kontroli komórek macierzystych Uniwersytet</td><td>Stanforda</td><td>Nguyen Lab</td><td>Hodowla komórkowa macierzy podstawnej iPSC</td></tr><tr><td>Corning matrigel 354234</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40234</td><td>Hodowla komórkowa pożywki hodowlanej iPSC</td></tr><tr><td>Essential 8</td><td>ATCC-Globalne centrum zasobów biologicznych</td><td>30-2203</td><td>Hodowla komórkowa iPSC</td></tr><tr><td>Tryple E</td><td>Gibco</td><td>12605-036</td><td>Hodowla komórkowa iPSC</td></tr><tr><td>Y27632 inhibitor 2 HCL (inhibitor ROCK)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S104950MG</td><td>Hodowla komórkowa iPSC</td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Cyagen</td><td>P170721-1001cjn</td><td>Transdukcja iPSC z podwójnym genem reporterowym</td></tr> fuzji <tr><td>Odczynnik do infekcji polirbrenem/transfekcji</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>Transdukcja iPSC z podwójnym genem</td></tr> <tr><td>reporterowym fuzyjnymGen reporterowy Fluc-eGFP napędzany przez promotora ubikwityny</td><td>Uniwersytet Stanforda</td><td>Laboratorium Sama Gambhira</td><td>Transdukcja iPSC za pomocą genu reporterowego podwójnej fuzji</td></tr><tr><td>D-lucyferyny</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td>Transdukcja iPSC za pomocą genu reporterowego podwójnej fuzji i</td></tr><tr><td>cytometru przepływowego BLI (BD FACSARIA III)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FACSAria</td><td>Transdukcja iPSC za pomocą</td></tr><tr><td>spektrofluorometru mikropłytek z podwójnym genem reporterowym (Glomax Navigator System)</td><td>Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA</td><td>GM2000</td><td>Transdukcja iPSC z podwójnym genem reporterowym fuzyjnym</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>BLI</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936</td><td>naświetlanie</td></tr><tr><td>promiennik sterowany obrazowo X-Rad SmART&nbsp;</td><td>Precision X-ray Inc., North Branford, pakiet oprogramowania do</td><td>napromieniania</td><td>CT X-Rad SmART</td></tr><tr><td>RT_Image</td><td>Uniwersytet Stanforda (http://rtimage.sourceforge.net/)</td><td>RT_Image v0.2 i beta;</td><td>napromieniowanie</td></tr></tbody></table>

celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Rosnąca liczba ofiar "turystyki komórek macierzystych", nieuregulowanego przeszczepu komórek macierzystych na całym świecie, wzbudziła obawy co do bezpieczeństwa przeszczepu komórek macierzystych. Chociaż przeszczepianie komórek zróżnicowanych, a nie niezróżnicowanych, jest powszechną praktyką, potworniaki mogą nadal powstawać w wyniku obecności szczątkowych niezróżnicowanych komórek macierzystych w momencie przeszczepu lub w wyniku spontanicznych mutacji w zróżnicowanych komórkach. Ponieważ terapie komórkami macierzystymi są często dostarczane do anatomicznie wrażliwych miejsc, nawet małe guzy mogą być klinicznie wyniszczające, powodując ślepotę, paraliż, nieprawidłowości poznawcze i dysfunkcję układu krążenia. Dostęp chirurgiczny do tych miejsc może być również ograniczony, co pozostawia pacjentów z niewielkimi opcjami terapeutycznymi. Kontrolowanie niewłaściwego zachowania komórek macierzystych ma zatem kluczowe znaczenie dla klinicznego przełożenia terapii komórkami macierzystymi.
Zewnętrzne promieniowanie wiązką oferuje skuteczny sposób dostarczania ukierunkowanej terapii w celu zmniejszenia obciążenia potworniaka przy jednoczesnym zminimalizowaniu uszkodzeń otaczających narządów. Ponadto metoda ta pozwala uniknąć manipulacji genetycznych lub transdukcji wirusowej komórek macierzystych, co wiąże się z dodatkowymi obawami dotyczącymi bezpieczeństwa klinicznego i skuteczności. W tym miejscu opisujemy protokół tworzenia pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych u myszy i stosowania radioterapii wiązką zewnętrzną w celu selektywnej ablacji tych guzów in vivo.

U myszy po iniekcji zazwyczaj obserwuje się wzrost teratoma po 4–8 tygodniach, co potwierdzono obrazowaniem BLI (Rysunek 2). Guzy ulegają gwałtownemu zmniejszeniu po napromieniowaniu dawką skumulowaną 18 Gy podaną miesiąc po wprowadzeniu komórek, co skutkuje znacznym spadkiem sygnału lucyferazy (Rysunek 2). Co ważne, tkanki prawidłowe pobrane z odległości 5 mm od miejsca napromieniowania nie wykazują żadnych istotnych uszkodzeń (...

Badania nad strategiami leczenia pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych są ważne dla klinicznego przełożenia terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu opisujemy protokół, aby najpierw wygenerować potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy, a następnie selektywnie celować i leczyć te nowotwory in vivo za pomocą napromieniacza dla małych zwierząt.

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Ogólnym celem tej procedury jest selektywne celowanie w potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy w celu oceny skuteczności in vivo radioterapii wiązką zewnętrzną małych zwierząt. Główną zaletą terapii wiązką promieniowania zewnętrznego jest to, że jest to terapia celowana w teramtomiach związanych z komórkami macierzystymi, która pozwala uniknąć niepożądanych skutków terapii podawanych ogólnoustrojowo. Postępy w radioterapii wiązką zewnętrzną umożliwiły specyficzne celowanie w małe potworniaki przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia normalnych tkanek, dzięki czemu terapia ta jest idealna do leczenia potworniaków wrażliwych na promieniowanie.Metoda ta może nie tylko zapewnić wgląd w strategie optymalizacji terapii komórkowych, ale ma również potencjał, aby stać się klinicznie stosowana w terapiach u ludzi. Rozpocznij od pobrania sześciodołkowej płytki zawierającej iPSC. Aby wywołać tworzenie się tetratomy u zwierząt z niedoborem odporności, dodaj jeden mililitr mieszanki enzymów dysocjacji komórek rekombinowanych na dołek 6-dołkowej płytki zawierającej ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste transdukowane genem reporterowym podwójnej fuzji przez pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji rozproszyć komórki przez pipetowanie i zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając równą objętość pożywki do hodowli komórkowej do każdego dołka. Wyciągnij zawiesiny jednokomórkowe do 15-mililitrowej stożkowej rurki do liczenia. Po zakończeniu wirowania odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 mikrolitrach roztworu matrycowego Matrigel i umieścić probówkę na lodzie.W przypadku wykorzystania komórek transfekowanych z podwójnym raportagenem fuzyjnym, te komórki o podwójnym pozytywnym wpływie powinny być również zawieszone w 30 mikrolitrach matrycy. Następnie załaduj każdą populację komórek do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 28,5 i potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u każdego znieczulonego ośmio- do 10-tygodniowego atymicznego nagiego biorcy myszy. Następnie wstrzyknąć podskórnie jedną mieszaninę macierzy komórkowej w grzbietowy bok każdego biorcy.W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym po inokulacji wstrzyknąć dootrzewnowo każdemu biorcy 375 miligramów na kilogram delucyferonu. Po 10 minutach zobrazuj sygnał bioluminescencji w każdej znieczulonej sondzie reporterowej, której wstrzyknięto zwierzęciu przez 30 minut, używając jednominutowych okien akwizycji w odstępach pięciominutowych, zgodnie ze standardowymi protokołami obrazowania bioluminescencyjnego. W przypadku napromieniania potworniaka, w odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym, najpierw umieść znieczulone zwierzę biorcy na łóżku przedklinicznego promiennika sterowanego obrazem i uzyskaj zestaw 400 projekcyjnych obrazów tomografii mikrokomputerowej w zakresie 360 stopni przy użyciu 40 szczytowych kilonapięciowych, 2-miliamperowej wiązki promieniowania rentgenowskiego i zrekonstruuj obraz w obrazy wolumetryczne o izotropowym rozmiarze piksela 0,2 milimetra.Bardzo ważne jest zrekonstruowanie obrazów wolumetrycznych potwornych. Obrazy te pomogą zaplanować radioterapię pod kątem konkretnego dostarczania terapii tylko do potworniaków, jednocześnie minimalizując promieniowanie otaczających tkanek poza celem. Następnie skorzystaj z obrazów mikrotomografii komputerowej i pakietu oprogramowania do obrazowania RT, aby zaplanować protokół radioterapii.Lek należy podawać przez trzy kolejne dni, aby dostarczyć w sumie 18 szarych komórek do guza docelowego. Myszy, którym wstrzyknięto implanty, zazwyczaj wykazują powstawanie potworniaka od czterech do ośmiu tygodni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, co potwierdza obrazowanie bioluminescencyjne. Po napromieniowaniu skumulowaną liczbą 18 grejów w ciągu miesiąca po dostarczeniu komórek, guzy dramatycznie się zmniejszą, co spowoduje znaczny zbieżny spadek sygnału lucyferazy.Co ważne, jak pokazują te obrazy, normalne biopsje tkanek pobrane z napromieniowanego miejsca nie wydają się doznawać żadnych znaczących uszkodzeń. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak tworzyć potworniaki pochodzące z komórek macierzystych in vivo oraz skutecznie i bezpiecznie leczyć je promieniowaniem wiązką zewnętrzną. To proste podejście wymaga pozyskania obrazów CT o wysokiej rozdzielczości pacjenta, po czym można przepisać serię terapii wiązką promieniowania w celu napromieniowania docelowych guzów, unikając jednocześnie sąsiednich tkanek.Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich osłon.

targeted-selective-treatment-pluripotent-stem-cell-derived-teratomas

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mają potencjał do leczenia wielu różnych chorób. Użyteczność tych komórek wynika z faktu, że mogą one różnicować się w każdy typ komórek w organizmie. W niniejszym materiale opisujemy test teratomiowy, który służy do wykazania pluripotencji hPSCs.

Generowanie potworniaków w torebce jądra

Celem niniejszego artykułu jest opis zastosowania ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego w badaniach nad chemoradioterapią. Artykuł ten obejmuje procesy przetwarzania komórek, implantację oraz radioterapię myszy z wykorzystaniem modelu wewnątrzczaszkowego.

Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Ten film opisuje technikę precelowanej radioimmunoterapii lub PRIT, w której do leczenia nowotworów podaje się immunokoniugaty, a następnie radioligandy. Ta radioimmunoterapia zmniejsza dawki promieniowania do zdrowych tkanek i wykorzystuje radionuklidy o bardzo krótkim okresie półtrwania, niezgodne z wektorami opartymi na przeciwciałach.

Radioimmunoterapia pretargetowana: metoda celowanego dostarczania terapeutycznych radionuklidów do nowotworów

Opracowaliśmy nowe, wielofunkcyjne nanopęcherzyki zwane porfisomami, które mają zależne od struktury samowygaszanie fluorescencji i unikalne właściwości fototermiczne, dzięki czemu działają jako silne środki terapii fototermicznej. Opracowaliśmy porfisomy za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem i zbadaliśmy ich skuteczność terapii fototermicznej w modelu guza ksenoprzeszczepu.

Jednominutowa, sub-jednowatowa fototermiczna ablacja guza przy użyciu porfisomów, wewnętrznych wielofunkcyjnych nanopęcherzyków

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

W przeszłości, napromienianie małych zwierząt było zazwyczaj wykonywane bez możliwości celowania w dobrze zdefiniowaną objętość guza. Celem było naśladowanie leczenia glejaka u ludzi u szczurów. Korzystając z platformy do napromieniania małych zwierząt, przeprowadziliśmy konforemne napromienianie 3D pod kontrolą MRI ze zwiększeniem podobjętości na podstawie PET w warunkach przedklinicznych.

Napromienianie pod kontrolą PET i MRI szczurzego modelu glejaka przy użyciu mikropromiennika

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Ten protokół opisuje syntezę i charakterystykę przeciwciała modyfikowanego trans-cyklooctenem (TCO) oraz 177znakowanego Lu radioligandu tetrazyny (Tz) do radioterapii pretargetowanej (PRIT). Ponadto szczegółowo opisano zastosowanie tych dwóch konstruktów w badaniach biodystrybucji in vivo i terapii podłużnej w mysim modelu raka jelita grubego.

Precelowana radioimmunoterapia oparta na odwróconej reakcji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronowe

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia przedklinicznej radioterapii opartej na pozytonowej tomografii emisyjnej w modelu glejaka szczurzego przy użyciu opracowanych przez nas algorytmów w celu optymalizacji dokładności i wydajności.

Radioterapia oparta na pozytonowej tomografii emisyjnej w modelu szczura glejaka przy użyciu platformy badawczej promieniowania małych zwierząt

Glejak jest wyniszczającą formą pierwotnego raka mózgu, a laserowa śródmiąższowa terapia termiczna staje się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej chirurgicznej resekcji nieoperacyjnego glejaka. Protokół ten opisuje zoptymalizowany przedkliniczny model myszy, który można wykorzystać do badania efektów leczenia lub leczenia uzupełniającego i skojarzonego.

Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

Poznaj metodę celowanego leczenia potworniaków pochodzących z komórek macierzystych u myszy za pomocą promieniowania wiązki zewnętrznej. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanek otaczających i ma potencjał zastosowania klinicznego.

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia (Wideo) | JoVE Journal

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Przeglądaj więcej filmów