Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej
26 listopada 2018
Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące generowania unaczynionych rusztowań, które są naprawdę Świętym Graalem w dziedzinie inżynierii tkankowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że worek ciśnieniowy w orientacji odwróconej poprawia decelularyzację narządów ludzkich nienadających się do przeszczepu i pozwala nam to zrobić w sterylny sposób w odpowiednich ramach czasowych. Aby przygotować serce do decelularyzacji, najpierw wykonaj wewnętrzną inspekcję pod kątem ewentualnych wad.
Jeśli występuje ubytek w przegrodzie nosowej, należy skorygować ubytek za pomocą odpowiednich szwów. Następnie podwiąż żyły górne i dolne za pomocą jedwabnego szwu 2-0. Zszyj prawą ścianę przedsionka 5-0 PROLENEM i wypreparuj aortę z dala od głównej tętnicy płucnej w celu późniejszej kaniulacji.
Włóż łączniki, zgodnie ze średnicą naczynia, do aorty i tętnicy płucnej i zabezpiecz łączniki jedwabnymi szwami 2-0. Za pomocą jednego z otworów żyły płucnej wprowadzić rurkę przez lewy przedsionek w kierunku lewej komory i podłączyć przewód infuzyjny do łącznika w aorcie i przewód odpływowy do łącznika w tętnicy płucnej. Umieść przygotowane serce w poliestrowej torebce w odwróconej orientacji i umieść saszetkę w pojemniku perfuzyjnym.
Podłącz każdą z linii do odpowiednich portów w gumowym korku, zgodnie ze średnicą pojemnika, i włóż korek do pokrywy pojemnika perfuzyjnego, aby uszczelnić poliestrową torebkę. Następnie należy wykonać perfuzję PBS przez port infuzyjny gumowego korka, aby sprawdzić odpływ z tętnicy płucnej i z linii wprowadzonej do lewej komory, wykorzystując ten przepływ do oczyszczenia narządu z wszelkich pozostałości krwi w układzie naczyniowym. Gdy serce jest gotowe, umieść zmontowany bioreaktor w pozycji pionowej i podłącz przewód infuzyjny, przewód głowicy ciśnieniowej, przewód odpływowy z tętnicy płucnej i przewód drenujący bioreaktor z portami powierzchniowymi gumowej nasadki na górze bioreaktora perfuzyjnego.
Następnie decelularyzacja serca przez cztery godziny roztworem hipertonicznym, dwie godziny roztworem hipotonicznym, 120 godzin dodecylosiarczanem sodu lub SDS i końcowe płukanie 120 litrami PBS, wszystko pod stałym ciśnieniem rtęci 120 milimetrów mierzonym w korzeniu aorty. Podczas ostatnich 10 litrów płukania PBS dodaj 500 mililitrów sterylnego 2,1% roztworu kwasu nadoctowego zneutralizowanego 10 normalnym wodorotlenkiem sodu do roztworu perfuzyjnego, aby wysterylizować rusztowanie. Zazwyczaj szybkość przepływu do aorty podczas procesu decelularyzacji stopniowo maleje, gdy roztwór perfuzyjny zmienia się z hipertonicznego na hipotoniczne.
Natomiast natężenie przepływu wzrasta, gdy roztwór perfuzyjny jest zmieniany z roztworu hipotonicznego na SDS, w którym to momencie natężenie przepływu infuzji wykazuje wahania. Szybkość odpływu z tętnicy płucnej wykazuje podobny trend w przypadku roztworów hiper- i hipotonicznych. Jednak szybkość odpływu podczas perfuzji SDS wykazuje ogólny spadek.
Skuteczność perfuzji wieńcowej również zmniejsza się z czasem, ponieważ różne odczynniki są perfundowane przez naczynia krwionośne. Ponieważ odpływ perfuzatu z tętnicy płucnej i lewej komory jest jednocześnie zbierany, zawartość ich szczątków można porównać za pomocą spektroskopii. Zmętnienie ścieków z obu naczyń zmniejsza się z czasem podczas perfuzji, chociaż zmętnienie z tętnicy płucnej wykazuje bardziej gwałtowną zmianę koloru w porównaniu do obserwowanej z lewej komory w początkowym okresie perfuzji.
Ocena korelacji między zmętnieniem odpływu a szczątkami komórek za pomocą testu białka kwasu bicinchoninowego z sześciu pozbawionych komórek ludzkich serc ujawnia liniową korelację między stężeniem białka a zmętnieniem ścieków. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby monitorować natężenie przepływu i okresowo zbierać perfuzat, aby faktycznie monitorować proces perfuzji. Po tej procedurze można zastosować inne techniki, takie jak ocena mechaniczna lub badanie sterylności, aby ocenić wierność rusztowania i jego potencjalne zastosowanie do recelularyzacji w celu wytworzenia funkcjonalnej tkanki serca.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej do zbadania generacji całych unaczynionych narządów, dosłownie zmieniając pole przeszczepów narządów stałych. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi narządami i tkankami oraz chemikaliami, takimi jak SDS, może być niezwykle niebezpieczna i zawsze noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda ta umożliwia decelularyzację złożonych organów litych, a konkretnie ludzkich serc, przy użyciu prostego protokołu, który minimalizuje uszkodzenia macierzy organu. Technika ta wykorzystuje ciśnieniową torebkę do monitorowania w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu oraz wypływu pozostałości komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Decelularyzacja organów
- Badania sercowo-naczyniowe
Wstęp
- Decelularyzacja jest kluczowa dla tworzenia unaczynionych rusztowań w inżynierii tkankowej.
- Obecne metody często prowadzą do naruszenia macierzy narządu.
- Konieczne jest opracowanie ulepszonych technik dla ludzkich organów nienadających się do przeszczepu.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym może usprawnić proces decelularyzacji.
Cel badania
- Opracowanie nowej techniki decelularyzacji ludzkich serc.
- Poprawa sterylności i wydajności procesu decelularyzacji.
- Ułatwienie generowania unaczynionych rusztowań.
Zastosowane metody
- Wewnętrzna inspekcja serca pod kątem wad.
- Korekcja wad przegrodowych za pomocą szwów.
- Podwiązanie żył głównych górnej i dolnej.
- Preparowanie aorty w celu kanulacji.
Główne wyniki
- Woreczek ciśnieniowy zwiększa wydajność decelularyzacji.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym pozwala na lepszą kontrolę procesu.
- Osiągnięto minimalne naruszenie macierzy narządu.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w środowisku sterylnym.
Wnioski
- Technika ta stanowi znaczący postęp w dziedzinie decelularyzacji organów.
- Daje ona nadzieję na przyszłe zastosowania w inżynierii tkankowej.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie na inne rodzaje organów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Decelularyzacja całych ludzkich serc z wykorzystaniem ciśnieniowej torby w orientacji odwróconej umożliwia generowanie unaczynionych rusztowań do inżynierii tkanki serca, odpowiadając na krytyczną potrzebę uzyskania organów do transplantacji. Metoda ta wspiera predykcyjną minimalizację ryzyka poprzez zachowanie architektury macierzy zewnątrzkomórkowej oraz umożliwienie monitorowania dynamiki perfuzji w czasie rzeczywistym, co pozwala ocenić jakość rusztowania i potencjał recelularyzacji. Technika ta stanowi fundamentalną zdolność w rozwoju bio-sztucznych serc i zmniejszaniu zależności od organów od dawców.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie składu macierzy pozakomórkowej serca oraz architektury naczyniowej w celu walidacji celów terapeutycznych w leczeniu niewydolności serca.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę rusztowaniową do badań mechanistycznych nad oddziaływaniami między komórkami a macierzą w tkance chorobowej w porównaniu z tkanką zdrową.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zestandaryzowanych rusztowań pochodzenia ludzkiego do ilościowej oceny wysiewu komórek, ich proliferacji oraz integracji funkcjonalnej w modelach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera przygotowanie testów poprzez monitorowanie mętności i korelacji białek w czasie rzeczywistym, co umożliwia kontrolę procesu i zapewnia spójność między partiami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia ciągłość translacyjną poprzez zapewnienie istotnego dla danej choroby ludzkiego rusztowania serca do oceny strategii recelularyzacji i dojrzewania elektromechanicznego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka dzięki analizie korelacyjnej mętności odpływu i usuwania szczątków komórkowych jako odczytu kontroli jakości.
Integracja potoków przetwarzania i przepływu pracy
Metoda ta integruje kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – poprzez zapewnienie platformy w postaci rusztowania unaczynionego pochodzenia ludzkiego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących celów w zewnątrzkomórkowej macierzy serca oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez zachowanie natywnej architektury tkankowej.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki mierzalnej mętności wypływu oraz korelacji z testem białkowym kwasem bicinchoniniowym w celu monitorowania wydajności decelularyzacji.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych wyników, w tym dynamiki przepływu, gradientów ciśnienia i profili wypływu zanieczyszczeń, które służą do optymalizacji procesu i podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez dostarczenie rusztowania odpowiedniego do recelularyzacji i oceny funkcjonalnej w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego generowania rusztowań, którą można zastosować w wielu programach naprawy i regeneracji serca.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie wierności rusztowania dzięki zachowaniu trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej i naczyń krwionośnych, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w inżynierii tkanki serca.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność osiągnięta dzięki systemowi ciśnieniowych woreczków, umożliwiającemu sterylną i monitorowaną decelularyzację w wydłużonych ramach czasowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go w oparciu o monitorowanie perfuzji w czasie rzeczywistym i wskaźniki usuwania zanieczyszczeń, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach w portfolio medycyny regeneracyjnej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja kandydatów na rusztowania z uwzględnieniem ryzyka, z wykorzystaniem ilościowej korelacji mętności i poziomu białka jako kryterium zwolnienia do procesów recelularyzacji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie perfuzji narządów, obchodzenia się z odczynnikami do decelularyzacji oraz sterylnego przetwarzania tkanek.
- Zależne od infrastruktury bioreaktora do perfuzji, zdolnego do utrzymania stałego ciśnienia 120 mmHg oraz wymiany roztworów z wielu odczynników.
- Wymaga standaryzacji protokołów zbierania odpływu, spektroskopii i analiz białek pomiędzy zespołami w celu spójnej oceny jakości rusztowania.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji do różnych rozmiarów narządów i architektur naczyniowych przy rozszerzaniu metody poza serca ludzkie.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne związane z zagrożeniami wynikającymi z ekspozycji na odczynniki (np. SDS, kwas nadoctowy), co wymaga ścisłego przestrzegania protokołów stosowania Środków Ochrony Indywidualnej i zabezpieczeń.
