Name: Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej. Technika umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i minimalizuje uszkodzenia macierzy organu, wspierając inżynierię tkankową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Houston Endowment i Texas Emerging Technology Fund. Autorzy dziękują agencji LifeGift, Inc. zajmującej się pobieraniem narządów oraz rodzinom dawców za umożliwienie przeprowadzenia tego badania.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komisji etycznej Texas Heart Institute.
1. Przygotowanie organu
UWAGA: We współpracy z LifeGift, non-profit organizacją zajmującą się pozyskiwaniem organów w Teksasie (http://www.lifegift.org), do badań wykorzystano przekazane ludzkie serca nieprzydatne do transplantacji, za zgodą odpowiednich organów.
<ol>
	<li>W celu pozyskania serc, podać dożylnie 30 000 U heparyny do serc. Bezpiecznie zaszyć kaniulę do kardioplegii w aorcie i podłączyć zaklampowaną linię perfuzyjną. Perforować żyłę główną dolną (IVC), aby odpowietrzyć prawą część serca. Przeciąć lewą górną żyłę płucną lub uszek lewego przedsionka, aby odpowietrzyć lewe jamy serca.</li>
	<li>Wprowadzić 1 L kardioplegii lub heparynowanej soli fizjologicznej. Wypreparować odgałęzienia łuku aorty, żyłę główną górną (SVC) i pozostałe żyły płucne, aby uwolnić serce z wszelkich naczyń lub przylegających tkanek. Zanurzyć dobrze heparynowane serce w schłodzonym roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Obejrzeć przekazane ludzkie serce (zarówno od strony przedniej, jak i tylnej, Rysunek 1). Umieścić serce na tacy do sekcji i sprawdzić, czy nie występują uszkodzenia strukturalne lub wady anatomiczne. Jeśli do transplantacji pobrano również wątrobę i/lub płuca, serce może charakteryzować się krótką żyłą główną dolną i/lub brakiem tylnej ściany lewego przedsionka.</li>
	<li>Przeprowadzić inspekcję wewnętrzną w celu wykrycia ewentualnych wad – ubytku w przegrodzie międzyprzedsionkowej (ASD), ubytku w przegrodzie międzykomorowej (VSD) lub wad zastawek (aortalnej, płucnej, mitralnej, trójdzielnej).</li>
	<li>W przypadku wystąpienia ubytku w przegrodzie, skorygować go za pomocą odpowiednich szwów (Rysunek 2A, 2B). Korekcja ubytków w przegrodzie jest niezbędna do monitorowania postępu decelularyzacji poprzez pomiar mętności odpływu z tętnicy płucnej (PA). Korekcja ubytku w przegrodzie eliminuje przeciek z lewej do prawej komory, dzięki czemu odpływ z PA reprezentuje odpływ z krążenia wieńcowego przez zatokę wieńcową.</li>
	<li>Podwiązać żyłę główną górną i dolną szwem jedwabnym 2-0 (Rysunek 2C).</li>
	<li>Wypreparować aortę (Ao) od głównej tętnicy płucnej (PA) (Rysunek 2D) w celu późniejszej kaniulacji.</li>
	<li>Wprowadzić konektory, dopasowane do średnicy naczynia (Rysunek 3), do Ao i PA i zabezpieczyć je szwami jedwabnymi 2-0 (Rysunek 4A).</li>
	<li>Wprowadzić linię z drenem przez lewy przedsionek (Rysunek 4B) w kierunku lewej komory (LV) (Rysunek 3), wykorzystując jeden z ujść żyły płucnej.</li>
	<li>Podłączyć linię infuzyjną do konektora umieszczonego w Ao oraz linię odpływową do konektora w PA (Rysunek 3).</li>
	<li>Umieścić przygotowane serce w poliestrowym worku w orientacji odwróconej (do góry nogami).</li>
	<li>Umieścić worek z sercem w pojemniku do perfuzji i zamknąć pokrywę (Rysunek 4C).</li>
	<li>Podłączyć każdą z linii do odpowiednich portów w gumowym korku (zależnie od średnicy pojemnika) i włożyć go do pokrywy pojemnika do perfuzji, aby uszczelnić poliestrowy worek (Rysunek 4C oraz Rysunek 5B).</li>
	<li>Przeperfundować 1x fosforanem sodowo-potasowym (PBS) (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 oraz 1,8 mM KH2PO4 w wodzie destylowanej, pH 7,4) poprzez port infuzyjny gumowego korka, aby zweryfikować odpływ z PA oraz z linii wprowadzonej do LV.</li>
	<li>Wykorzystać ten przepływ do oczyszczenia narządu z wszelkich pozostałości krwi w naczyniach. Jeśli przepływ nie jest obserwowany, należy dokręcić linie połączeniowe, gdyż mogą być one poluzowane.</li>
</ol>
2. Konfiguracja systemu i procedura decelularyzacji organu
<ol>
	<li>Złożyć bioreaktor i ustawić go w pozycji pionowej (Rysunek 5). System perfuzji składa się z komputera osobistego (PC), kontrolera proporcjonalno-całkująco-różniczkującego (PID), pompy perystaltycznej do infuzji do Ao, bioreaktora perfuzyjnego, zbiornika ciśnieniowego do retencji perfuzatu LV (butelka aspiracyjna 2 L z bocznym wylotem dolnym) oraz pompy perystaltycznej do odprowadzania nadmiaru cieczy ze zbiornika ciśnieniowego i zbierania odpływu z PA.</li>
	<li>Przez gumowy septu połączyć linię infuzji, linię ciśnieniową, linię odpływu PA i linię spustową bioreaktora z portami powierzchniowymi gumowej zatyczki znajdującymi się na górze bioreaktora perfuzyjnego (Rysunek 5A).</li>
	<li>Przeprowadzić decelularyzację serc pod stałym ciśnieniem 120 mmHg mierzone u nasady aorty. Średnie ciśnienie w LV powinno wynosić od 14-18 mmHg przez cały proces decelularyzacji.</li>
	<li>Decelularyzację serc przeprowadzić w następujący sposób: 4 h w roztworze hipertonicznym (500 mM NaCl), 2 h w roztworze hipotonicznym (20 mM NaCl), 120 h w roztworze dodecylosiarczanu sodu (1% SDS) oraz końcowe płukanie 120 L 1X PBS (Rysunek 6A).</li>
	<li>Decelularyzację serc przeprowadzić pod stałą kontrolą ciśnienia (120 mmHg). Szybkość przepływu infuzji do Ao zależy od serca i wynosi średnio 98,06±16,22 mL/min dla roztworu hipertonicznego, 76,14±7,90 mL/min dla roztworu hipotonicznego, 151,50±5,76 mL/min dla SDS oraz 185,24±7,10 mL/min dla PBS. Całkowita zużyta objętość każdego odczynnika wynosi średnio 23,36±5,70 L dla roztworu hipertonicznego i 9,13±1,26 L dla roztworu hipotonicznego.</li>
	<li>Recyrkulować ostatnie 60 L 1% SDS (1 L na gram masy serca) aż do końca perfuzji SDS. Rysunek 6A przedstawia oś czasu procesu decelularyzacji, wskazując punkty końcowe dla gromadzenia danych: monitorowanie szybkości przepływu (Ao i PA) oraz zbieranie odpływu (PA i poza PA) ze zbiornika ciśnieniowego podczas decelularyzacji.</li>
	<li>Ponieważ SVC i IVC są podwiązane, można założyć, że cała ciecz zebrana z PA jest wynikiem rzeczywistej perfuzji wieńcowej (Rysunek 5B). Wyznaczyć wydajność perfuzji wieńcowej poprzez bezpośredni podział szybkości przepływu perfuzatu z PA przez szybkość przepływu infuzji roztworu do Ao: 
	Wydajność perfuzji wieńcowej = <img alt="Równanie stosunku szybkości przepływu, dynamika płynów, analiza wydajności procesu." src="/files/ftp_upload/58123/58123eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> (%).</li>
	<li>Przeprowadzić analizę porównawczą perfuzatu uzyskanego z PA i LV oraz infuzowanych roztworów w dubletach, nanosząc 200 μL na dołek w płytce 96-dołkowej z przezroczystym dnem i odczytując absorbancję przy 280 nm. Wartość absorbancji, dobrana empirycznie po przetestowaniu różnych wartości, okazała się dawać najlepsze wartości znormalizowane.</li>
	<li>Jako kontrolę wykorzystać mętność czystego infuzowanego odczynnika. Mętność odpływowego perfuzatu reprezentuje wypłukiwanie szczątków komórkowych i może być ilościowo określona natychmiast podczas decelularyzacji jako narzędzie do monitorowania procesu.</li>
	<li>Podczas końcowego płukania 10 L 1X PBS dodać 500 mL sterylnego zneutralizowanego 2,1% roztworu kwasu nadoctowego, zneutralizowanego 10N NaOH, co prowadzi do uzyskania 0,1% roztworu kwasu nadoctowego (v/v) w PBS. Użyć tego roztworu do sterylizacji rusztowania.</li>
</ol>
3. Ocena zdecelularyzowanych serc
UWAGA: Po decelularyzacji reprezentatywne serca zostaną wykorzystane do obrazowania angiograficznego tętnic wieńcowych oraz analiz biochemicznych.
<ol>
	<li>Wykonaj angiografię wieńcową reprezentatywnego zdecelularyzowanego ludzkiego serca, aby zbadać integralność naczyń wieńcowych. W skrócie, przy użyciu fluoroskopu, obrazuj zdecelularyzowane ludzkie serce po wstrzyknięciu środka kontrastowego przez kaniulę ujściową tętnic wieńcowych do głównej prawej i lewej tętnicy wieńcowej.</li>
	<li>Przeprowadź sekcję zdecelularyzowanego serca, aby pobrać próbki z 19 obszarów w celu oceny pozostałych poziomów kwasu deoxyrybonukleinowego (DNA), glikozaminoglikanów (GAG) i SDS w zdecelularyzowanych tkankach. Oddziel podstawę serca od komór i podziel komory na 4 równe sekcje (Ryc. 6C). Podziel każdą sekcję na przednią i tylną część prawej komory (RV), przednią i tylną część lewej komory (LV) oraz przegrodę międzykomorową (IVS). Tkankę zawierającą wierzchołek serca podziel na LV i RV w celu pobrania próbek.</li>
	<li>Wytnij próbki tkanki do analiz DNA, GAG i SDS (~15 mg masy mokrej).</li>
	<li>Wyekstrahuj dwuniciowy DNA (dsDNA) poprzez trawienie próbek w 1 M NaOH przez 3 h w 65 °C i dostosuj pH do 7, używając 10x buforu Tris-EDTA (TE) oraz 1 M kwasu solnego (HCl).</li>
	<li>Ilościowo określ dsDNA przy użyciu zestawu dsDNA Assay z użyciem standardu z tymusu cielęcego (patrz Tabela Materiałów). Odczytaj próbki w duplikacie za pomocą fluorescencyjnego czytnika mikropłytek (wzbudzenie przy 480 nm i emisja przy 520 nm). Oblicz procent pozostałego dsDNA w zdecelularyzowanych sercach, porównując stężenie dsDNA w każdej tkance do stężenia w materiale trupim (% cadaveric).</li>
	<li>Przenieś siarczanowane GAG do roztworu poprzez trawienie próbek tkanki w roztworze ekstrakcyjnym papainy (0,2 M bufor fosforanowy sodu z dwusodową solą EDTA, cysteiną HCl, octanem sodu i papainą) w 65 °C przez 3 godziny. Zmierz zawartość GAG (w duplikacie), używając zestawu Glycosaminoglycan Assay Kit.</li>
	<li>Liofilizuj próbki do analizy SDS w podgrzewanej próżni i zmierz masę suchą. Dodaj 200 µL wody ultrapure do każdej wysuszonej próbki i zhomogenizuj, aby wyekstrahować pozostałe SDS do roztworu. Wymieszaj ten roztwór SDS z chloroformem i roztworem błękitu metylenowego (12 mg błękitu metylenowego w 1 L 0,01 M HCl). SDS oddzieli się w warstwie organicznej poprzez wiązanie z barwnikiem błękitu metylenowego.</li>
	<li>Za pomocą fluorescencyjnego czytnika mikropłytek zmierz absorbancję (655 nm) standardów i próbek w duplikacie, aby obliczyć pozostałe SDS. Znormalizuj tę wartość SDS do suchej masy tkanki.</li>
	<li>Obrazuj próbki z obszarów grubych (tj. LV, RV i przegrody) ludzkiego serca za pomocą nielinearnej mikroskopii optycznej (NLOM), aby potwierdzić usunięcie komórek po decelularyzacji. Konfiguracja NLOM została szczegółowo opisana w naszych poprzednich publikacjach18,19,20. NLOM umożliwia obrazowanie komórek, włókien elastyny, kolagenu i miozyny poprzez kanały fluorescencji dwufotonowej (TPF) i generowania drugiej harmonicznej (SHG) bez użycia egzogennych barwników21.</li>
</ol>

<ol><li>Writing Group Members. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26811276">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).</li>
<li>Zia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearts+beating+through+decellularized+scaffolds%3A+whole-organ+engineering+for+cardiac+regeneration+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strip+and+Dress+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Strip and Dress the Human Heart.</a> Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+Using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+human+heart+matrix%3A+A+critical+step+toward+whole+heart+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts.</a> Biomaterials. 61, 279-289 (2015).</li>
<li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+perspectives+in+whole-organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6, 107(2015).</li>
<li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+decellularization+of+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li>
<li>Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+Processes+to+Decellularize+and+Cellularize+Hearts+to+Generate+Functional+Organs+and+Reduce+the+Risk+of+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B-Reviews%22%5BJournal%5D)">Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis.</a> Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).</li>
<li>Lee, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+orientation+improves+decellularization+of+whole+porcine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts.</a> Acta Biomaterialia. , (2016).</li>
<li>Momtahan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+Pressure+Control+Improves+Whole+Porcine+Heart+Decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+a+Perfusion+Decellularization+Porcine+Heart+Model+-+Generation+of+3-Dimensional+Myocardial+Neoscaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds.</a> Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioartificial+heart%3A+A+human-sized+porcine+model--the+way+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead.</a> PLoS One. 9 (11), e111591(2014).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e50059(2012).</li>
<li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Human+Myocardium+on+Native+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix.</a> Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).</li>
<li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+from+acellular+human+heart+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Data from acellular human heart matrix.</a> Data Brief. 8, 211-219 (2016).</li>
<li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+Rapid+production+of+human+heart+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts.</a> Biomaterials. 98, 64-78 (2016).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cardiac+Extracellular+Matrix+from+an+Intact+Porcine+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).</li>
<li>Larson, A. M., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+of+sub-10-fs+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses.</a> Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).</li>
<li>Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy+reveals+invading+endothelial+cells+anisotropically+alter+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices.</a> Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).</li>
<li>Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+responses+are+enhanced+in+mechanically+and+microscopically+characterized%2C+microbial+transglutaminase+crosslinked+collagen+matrices+with+increased+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Ramanathan, T., Skinner, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/bjaed/article/5/2/61/422091">Coronary blood flow.</a> Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).</li>
<li>Murthy, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Quantification+of+Myocardial+Blood+Flow+Using+PET%3A+Joint+Position+Paper+of+the+SNMMI+Cardiovascular+Council+and+the+ASNC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC.</a> Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).</li>
<li>Molina, D. K., DiMaio, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+organ+weights+in+men%3A+Part+I-the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Forensic+Medicine+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal organ weights in men: Part I-the heart.</a> The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).</li>
<li>Molina, D. K., DiMaio, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Organ+Weights+in+Women%3A+Part+I-The+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Forensic+Medicine+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart.</a> The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).</li>
<li>Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0090406">Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix.</a> PLoS One. 9 (2), e90406(2014).</li>
<li>Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29377912">Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology.</a> PLoS One. 13 (1), e0191892(2018).</li>
<li>Baghalishahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+extracellular+matrix+hydrogel+together+with+or+without+inducer+cocktail+improves+human+adipose+tissue-derived+stem+cells+differentiation+into+cardiomyocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).</li>
<li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li>
<li>Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cardiac+extracellular+matrix+hydrogels+for+cultivation+of+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).</li>
<li>Oberwallner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+scaffolds+by+decellularization+of+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).</li>
</ol>

Dr Taylor jest założycielem i udziałowcem Miromatrix Medical, Inc. Relacja ta jest zarządzana zgodnie z zasadami dotyczącymi konfliktu interesów przez University of Minnesota i Texas Heart Institute; Pozostali autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie, które donosi o odwróconej decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z poklatkowym monitorowaniem natężenia przepływu i usuwania resztek komórek. Worek przypominający osierdzie utrzymuje stabilną orientację serca przez cały czas trwania procedury decelularyzacji. Zanurzenie i odwrócenie całych serc w woreczku zapobiega odwodnieniu i minimalizuje nadmierne obciążenie aorty (spowodowane masą serca) w porównaniu z konwencjonalną pionową metodą decelularyzacji perfuzy...

Niewydolność serca prowadzi do wysokiej śmiertelności wśród pacjentów. Ostateczną opcją leczenia schyłkowej niewydolności serca jest allotransplantacja. Jednak lista oczekujących na przeszczep jest długa ze względu na niedobór narządów od dawców, a pacjenci napotykają przeszkody po przeszczepie, które wahają się od trwającej całe życie immunosupresji do przewlekłego odrzucenia narządu1,2. Bioinżynieria funkcjonalnych serc poprzez ponowne zasiedlenie zdecelularyzowanych serc ludzkich własnymi komórkami pacjenta mogłaby obejść te przeszkody3.
Głównym krokiem w "inżynierii" serca jest stworzenie rusztowania o odpowiedniej strukturze, składzie i funkcji naczyniowej i miąższowej, aby kierować wyrównaniem i organizacją dostarczanych komórek. W obecności odpowiedniego szkieletu komórki wysiane na rusztowaniu powinny rozpoznawać środowisko i pełnić oczekiwaną funkcję jako część tego narządu. Naszym zdaniem, bezkomórkowa macierz zewnątrzkomórkowa narządu (dECM) zawiera niezbędne cechy idealnego rusztowania.
Wykorzystując wewnętrzne unaczynienie, można osiągnąć złożoną decelularyzację całego narządu poprzez perfuzję wsteczną lub wsteczną4 w celu usunięcia składników komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu delikatnej macierzy zewnątrzkomórkowej i układu naczyniowego 3D2,5,6,7. Funkcjonalne unaczynienie jest ważne w bioinżynierii całych narządów, tak samo jak in vivo, do dystrybucji składników odżywczych i usuwania odpadów8. Udowodniono, że decelularyzacja perfuzji wieńcowej jest skuteczna w tworzeniu pozbawionych komórek serc ze szczurów4, lub pigs4,7,9,10,11,12,13, oraz humans5,7,14,15,16. Jednak integralność zastawek, przedsionków i innych "cienkich" obszarów może ucierpieć.
Bezkomórkowe rusztowania serca wielkości człowieka można uzyskać od świń za pomocą kontroli ciśnienia7,9,10,11,12 lub kontrola przepływu infuzji13,17 oraz od ludzkich dawców korzystających z kontroli ciśnienia5,7,14,15. Decelularyzacja ludzkich serc dawców zachodzi w ciągu 4-8 dni pod ciśnieniem kontrolowanym na poziomie 80-100 mmHg w orientacji pionowej5,15,16 lub przez 16 dni pod ciśnieniem kontrolowanym na poziomie 60 mmHg14. W przypadku decelularyzacji sterowanej ciśnieniem kompetencja zastawki aortalnej odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu wydajności perfuzji wieńcowej i stabilnego ciśnienia w korzeniu aorty. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że orientacja serca wpływa na skuteczność jego perfuzji wieńcowej podczas procedury decelularyzacji, a tym samym na integralność rusztowania w końcu9.
Jako kontynuacja naszej poprzedniej pracy9, wprowadzamy nowatorską koncepcję, w której dodaje się torebkę podobną do osierdzia, aby poprawić decelularyzację całego serca. Opisujemy decelularyzację ludzkich serc umieszczonych w woreczkach ciśnieniowych, zorientowanych odwrotnie i pod ciśnieniem kontrolowanym na poziomie 120 mmHg w korzeniu aorty. Protokół ten obejmuje monitorowanie profilu przepływu i zbieranie pożywek odpływowych podczas całej procedury decelularyzacji w celu oceny skuteczności perfuzji wieńcowej i usuwania resztek komórkowych. Następnie przeprowadza się testy biochemiczne w celu sprawdzenia skuteczności metody.

<table><tbody><tr><td>Szew jedwabny 2-0</td><td>Ethicon</td><td>SA85H</td><td>Szew służy do podwiązywania żyły głównej górnej i dolnej</td></tr><tr><td>Łącznik 1/4" x 3/8" z luer</td><td>NovoSci</td><td>332023-000</td><td>Połącz aortę i tętnicę płucną</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96410-16</td><td>Rurka do łączenia komór serca/żył</td></tr><tr><td>linii infuzji i odpływu</td><td>Smiths Medical</td><td>MX452FL</td><td>Do przepływania roztworów przez układ krwionośny</td></tr><tr><td>Woreczek poliestrowy (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)</td><td>Fisher scientific</td><td>01-812-17</td><td>Woreczek przypominający osierdzie do przechowywania serca podczas decelularyzacji</td></tr><tr><td>Snapware Kanister z kwadratowym uchwytem</td><td>Snapware</td><td>1022</td><td>1-litrowy pojemnik używany do perfuzji serca</td></tr><tr><td>Czarne gumowe korki</td><td>VWR</td><td>59586-162</td><td>Do uszczelnienia pojemnik perfuzyjny</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>881003</td><td>Do pompowania płynu przez przewody doprowadzające i odprowadzania płynów</td></tr><tr><td>Butelka aspiratora 2 l z dolnym ramieniem bocznym</td><td>VWR</td><td>89001-532</td><td>Do przechowywania roztworów/perfugatu</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw do oznaczania</td> DNA <td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td>Do ilościowego oznaczania dsDNA</td></tr><tr><td>Norma grasicy cielęcej</td><td>Sigma</td><td>D4522</td><td>Standardowy zestaw</td></tr><tr><td>do oznaczania glikozaminoglikanu Blyscan</td><td>Biocolor Ltd</td><td>Zestaw do oznaczania</td><td>Blyscan #B1000</td> GAG</tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 Pro</td><td>Do testów analitycznych</td></tr><tr><td>Fluoroskopia GE General</td><td>Electric</td><td>OEC 9900 Elite</td><td>Angiogram</td></tr><tr><td>Visipaque</td><td>GE</td><td>13233575</td><td>Środek kontrastowy</td></tr></tbody></table>

decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Ostatecznym rozwiązaniem dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością serca jest przeszczep narządów. Ale serca dawców są ograniczone, wymagana jest immunosupresja, a ostatecznie może dojść do odrzucenia. Stworzenie funkcjonalnego, autologicznego biosztucznego serca może rozwiązać te problemy. Jedną z opcji jest biofabrykacja serca składającego się z rusztowania i komórek. Naturalne rusztowanie o specyficznym składzie tkankowym, a także mikro- i makroarchitekturze można uzyskać poprzez decelularyzację serc ludzi lub dużych zwierząt, takich jak świnie. Decelularyzacja polega na wypłukiwaniu resztek komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej i naczyń 3D oraz umożliwieniu "celularyzacji" w późniejszym czasie. Wykorzystując nasze nowatorskie odkrycie, że decelularyzacja perfuzyjna złożonych narządów jest możliwa, opracowaliśmy bardziej "fizjologiczną" metodę decelularyzacji ludzkich serc nienadających się do przeszczepu poprzez umieszczenie ich w woreczku ciśnieniowym, w orientacji odwróconej, pod kontrolowanym ciśnieniem. Celem stosowania worka ciśnieniowego jest wytworzenie gradientów ciśnienia w poprzek zastawki aortalnej, aby utrzymać ją zamkniętą i poprawić perfuzję mięśnia sercowego. Jednoczesna ocena dynamiki przepływu i usuwania zanieczyszczeń komórkowych podczas decelularyzacji pozwoliła nam monitorować zarówno napływ płynu, jak i odpływ zanieczyszczeń, tworząc w ten sposób rusztowanie, które można wykorzystać zarówno do prostej naprawy serca (np. jako rusztowanie łaty lub zastawki), jak i jako rusztowanie całego narządu.

Po 7-dniowej decelularyzacji z antegradową perfuzją aorty pod stałym ciśnieniem 120 mmHg, ludzkie serce stało się półprzezroczyste (Rysunek 6B). Serce zostało makroskopowo podzielone na 19 sekcji do analizy biochemicznej (DNA, GAG i SDS) (Rysunek 6C) w celu oceny końcowego produktu decelularyzacji.
W trakcie procesu decelularyzacji szybkość przepływu infuzyjnego różnych...

Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące generowania unaczynionych rusztowań, które są naprawdę Świętym Graalem w dziedzinie inżynierii tkankowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że worek ciśnieniowy w orientacji odwróconej poprawia decelularyzację narządów ludzkich nienadających się do przeszczepu i pozwala nam to zrobić w sterylny sposób w odpowiednich ramach czasowych. Aby przygotować serce do decelularyzacji, najpierw wykonaj wewnętrzną inspekcję pod kątem ewentualnych wad.Jeśli występuje ubytek w przegrodzie nosowej, należy skorygować ubytek za pomocą odpowiednich szwów. Następnie podwiąż żyły górne i dolne za pomocą jedwabnego szwu 2-0. Zszyj prawą ścianę przedsionka 5-0 PROLENEM i wypreparuj aortę z dala od głównej tętnicy płucnej w celu późniejszej kaniulacji.Włóż łączniki, zgodnie ze średnicą naczynia, do aorty i tętnicy płucnej i zabezpiecz łączniki jedwabnymi szwami 2-0. Za pomocą jednego z otworów żyły płucnej wprowadzić rurkę przez lewy przedsionek w kierunku lewej komory i podłączyć przewód infuzyjny do łącznika w aorcie i przewód odpływowy do łącznika w tętnicy płucnej. Umieść przygotowane serce w poliestrowej torebce w odwróconej orientacji i umieść saszetkę w pojemniku perfuzyjnym.Podłącz każdą z linii do odpowiednich portów w gumowym korku, zgodnie ze średnicą pojemnika, i włóż korek do pokrywy pojemnika perfuzyjnego, aby uszczelnić poliestrową torebkę. Następnie należy wykonać perfuzję PBS przez port infuzyjny gumowego korka, aby sprawdzić odpływ z tętnicy płucnej i z linii wprowadzonej do lewej komory, wykorzystując ten przepływ do oczyszczenia narządu z wszelkich pozostałości krwi w układzie naczyniowym. Gdy serce jest gotowe, umieść zmontowany bioreaktor w pozycji pionowej i podłącz przewód infuzyjny, przewód głowicy ciśnieniowej, przewód odpływowy z tętnicy płucnej i przewód drenujący bioreaktor z portami powierzchniowymi gumowej nasadki na górze bioreaktora perfuzyjnego.Następnie decelularyzacja serca przez cztery godziny roztworem hipertonicznym, dwie godziny roztworem hipotonicznym, 120 godzin dodecylosiarczanem sodu lub SDS i końcowe płukanie 120 litrami PBS, wszystko pod stałym ciśnieniem rtęci 120 milimetrów mierzonym w korzeniu aorty. Podczas ostatnich 10 litrów płukania PBS dodaj 500 mililitrów sterylnego 2,1% roztworu kwasu nadoctowego zneutralizowanego 10 normalnym wodorotlenkiem sodu do roztworu perfuzyjnego, aby wysterylizować rusztowanie. Zazwyczaj szybkość przepływu do aorty podczas procesu decelularyzacji stopniowo maleje, gdy roztwór perfuzyjny zmienia się z hipertonicznego na hipotoniczne.Natomiast natężenie przepływu wzrasta, gdy roztwór perfuzyjny jest zmieniany z roztworu hipotonicznego na SDS, w którym to momencie natężenie przepływu infuzji wykazuje wahania. Szybkość odpływu z tętnicy płucnej wykazuje podobny trend w przypadku roztworów hiper- i hipotonicznych. Jednak szybkość odpływu podczas perfuzji SDS wykazuje ogólny spadek.Skuteczność perfuzji wieńcowej również zmniejsza się z czasem, ponieważ różne odczynniki są perfundowane przez naczynia krwionośne. Ponieważ odpływ perfuzatu z tętnicy płucnej i lewej komory jest jednocześnie zbierany, zawartość ich szczątków można porównać za pomocą spektroskopii. Zmętnienie ścieków z obu naczyń zmniejsza się z czasem podczas perfuzji, chociaż zmętnienie z tętnicy płucnej wykazuje bardziej gwałtowną zmianę koloru w porównaniu do obserwowanej z lewej komory w początkowym okresie perfuzji.Ocena korelacji między zmętnieniem odpływu a szczątkami komórek za pomocą testu białka kwasu bicinchoninowego z sześciu pozbawionych komórek ludzkich serc ujawnia liniową korelację między stężeniem białka a zmętnieniem ścieków. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby monitorować natężenie przepływu i okresowo zbierać perfuzat, aby faktycznie monitorować proces perfuzji. Po tej procedurze można zastosować inne techniki, takie jak ocena mechaniczna lub badanie sterylności, aby ocenić wierność rusztowania i jego potencjalne zastosowanie do recelularyzacji w celu wytworzenia funkcjonalnej tkanki serca.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej do zbadania generacji całych unaczynionych narządów, dosłownie zmieniając pole przeszczepów narządów stałych. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi narządami i tkankami oraz chemikaliami, takimi jak SDS, może być niezwykle niebezpieczna i zawsze noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.

decellularization-whole-human-heart-inside-pressurized-pouch-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Ten film demonstruje metodę wytwarzania decelularnych rusztowań z matrycy zewnątrzkomórkowej lub ECM poprzez zastosowanie perfuzji detergentów przez układ krwionośny. Strukturalne rusztowania ECM mogą być następnie wykorzystane do analizy przebudowy ECM związanej z chorobą krążeniowo-oddechową.

Decelularyzacja kompleksu krążeniowo-oddechowego: technika decelularyzacji serca i płuc na podstawie modelu mysiego

Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.

Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Ten protokół ma na celu decelularyzację serca i płuc myszy. Powstałe w ten sposób rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być barwione immunologicznie i obrazowane w celu zmapowania lokalizacji i topologii ich elementów.

Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Ten protokół przedstawia kompleksowy potok do analizy próbek pobranych z ludzkich serc, które obejmują mikroskopijne i makroskopowe skale.

Rurociąg do wieloskalowych trójwymiarowych badań anatomicznych ludzkiego serca

Poznaj metodę decelularyzacji całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej. Technika umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i minimalizuje uszkodzenia macierzy organu, wspierając inżynierię tkankową.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Przeglądaj więcej filmów