Name: Pomiar kinuryniny i kwasu kynureninowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej: powiązanie biochemii z funkcjami poznawczymi i snem u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę HPLC do pomiaru kinuryniny i kwasu kynureninowego w mózgu i osoczu szczurów. Technika ta umożliwia niezawodne oznaczanie metabolitów szlaku kynureninowego związanych z chorobami psychicznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obecne badanie zostało częściowo sfinansowane przez National Institutes of Health (R01 NS102209) oraz darowiznę od Clare E. Forbes Trust.

<ol><li>Leklem, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+aspects+of+tryptophan+metabolism+in+humans+and+other+species%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).</li>
<li>Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128009819000250">Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior</a>. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).</li>
<li>Hilmas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+metabolite+kynurenic+acid+inhibits+alpha7+nicotinic+receptor+activity+and+increases+non-alpha7+nicotinic+receptor+expression%3A+physiopathological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications.</a> Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).</li>
<li>Perkins, M. N., Stone, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iontophoretic+investigation+of+the+actions+of+convulsant+kynurenines+and+their+interaction+with+the+endogenous+excitant+quinolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid.</a> Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).</li>
<li>DiNatale, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+is+a+potent+endogenous+aryl+hydrocarbon+receptor+ligand+that+synergistically+induces+interleukin-6+in+the+presence+of+inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling.</a> Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+as+a+ligand+for+orphan+G+protein-coupled+receptor+GPR35%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).</li>
<li>Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+elevations+of+brain+kynurenic+acid+impair+cognitive+flexibility%3A+normalization+by+the+alpha7+positive+modulator+galantamine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine.</a> Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).</li>
<li>Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-kynurenine+treatment+alters+contextual+fear+conditioning+and+context+discrimination+but+not+cue-specific+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning.</a> Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).</li>
<li>Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+of+endogenous+kynurenic+acid+produce+spatial+working+memory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits.</a> Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).</li>
<li>Pocivavsek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+endogenous+kynurenic+acid+control+hippocampal+glutamate+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).</li>
<li>Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Kynurenine+Challenge+Disrupts+Sleep-Wake+Architecture+and+Impairs+Contextual+Memory+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats.</a> Sleep. 40 (11), (2017).</li>
<li>Halassa, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+modulation+of+sleep+homeostasis+and+cognitive+consequences+of+sleep+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss.</a> Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Erhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+levels+are+elevated+in+the+cerebrospinal+fluid+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia.</a> Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).</li>
<li>Linderholm, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+kynurenine+and+kynurenic+acid+in+the+CSF+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).</li>
<li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+kynurenine+pathway+metabolism+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).</li>
<li>Schwarcz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cortical+kynurenate+content+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Increased cortical kynurenate content in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).</li>
<li>Pocivavsek, A., Rowland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Neuroscience+Illuminates+Causal+Relationship+Between+Sleep+and+Memory%3A+Translating+to+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).</li>
<li>Shibata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorimetric+micro-determination+of+kynurenic+acid%2C+an+endogenous+blocker+of+neurotoxicity%2C+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).</li>
<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+consolidation+during+sleep%3A+a+neurophysiological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective.</a> Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).</li>
<li>Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+deprivation+selectively+impairs+memory+consolidation+for+contextual+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning.</a> Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).</li>
<li>Yamashita, M., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+circuit+in+fatigue%3A+From+blood+to+brain+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition.</a> Brain Research. 1675, 116-126 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby uzyskać wiarygodną ocenę KYNA w mózgu po podaniu obwodowej kinureniny, kluczowe znaczenie ma połączenie i interpretacja eksperymentów biochemicznych i funkcjonalnych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który pozwala nowym użytkownikom ustalić skuteczne metody pomiaru stężenia kinureniny w osoczu i KYNA mózgu szczurów. Pomiar kinureniny w osoczu potwierdził dokładne wstrzyknięcie, a pomiar metabolitu KYNA potwierdza syntezę de novo w mózgu. Istnieje kilka zalet opisanej metody fluorometrycznej ...

KP jest odpowiedzialny za degradację prawie 95% niezbędnego aminokwasu tryptofanu1. W mózgu ssaków kynurenina przyjmowana do astrocytów jest metabolizowana do neuroaktywnej małej cząsteczki KYNA głównie przez enzym aminotransferazę kinureninową (KAT) II2. KYNA działa jako antagonista receptorów NMDA i α7nACh w mózgu2,3,4, a także celuje w receptory sygnałowe, w tym receptor węglowodorów arylowych (AHR) i receptor sprzężony z białkiem G 35 (GPR35)5,6. U zwierząt doświadczalnych wykazano, że zwiększenie KYNA mózgu pogarsza ich wydajność poznawczą w szeregu testów behawioralnych2,7,8,9,10. Pojawiająca się hipoteza sugeruje, że KYNA odgrywa integralną rolę w modulowaniu funkcji poznawczych poprzez wpływ na zachowanie podczas snu i czuwania11, co dodatkowo potwierdza rolę cząsteczek pochodzących z astrocytów w modulowaniu neurobiologii snu i funkcji poznawczych12.
Klinicznie, stwierdzono podwyższone wartości KYNA w płynie mózgowo-rdzeniowym i pośmiertnej tkance mózgowej u pacjentów ze schizofrenią13,14,15,16, wyniszczające zaburzenie psychiczne charakteryzujące się zaburzeniami poznawczymi. Pacjenci ze schizofrenią są również często nękani zaburzeniami snu, które mogą zaostrzyć chorobę17. Zrozumienie roli metabolizmu KP i KYNA w modulowaniu związku między snem a funkcjami poznawczymi, szczególnie między uczeniem się a pamięcią, może prowadzić do opracowania nowych terapii leczenia tych słabych wyników w schizofrenii i innych chorobach psychicznych.
Niezawodna i spójna metoda pomiaru metabolitów KP jest ważna, aby zapewnić, że badania pochodzące z różnych instytucji mogą być zintegrowane z naukowym zrozumieniem biologii KP. Obecnie opisujemy metodologię pomiaru kinureniny w osoczu szczura i KYNA w mózgu szczura za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Obecny protokół, który wykorzystuje detekcję fluorymetryczną w obecności Zn2+, został po raz pierwszy opracowany przez Shibata18, a ostatnio dostosowany i zoptymalizowany do derywatyzacji z octanem 500 mM jako odczynnikiem pokolumnowym, co pozwala na wykrycie endogennych, nanomolowych ilości KYNA w mózgu11.
Aby stymulować endogenną produkcję KYNA de novo, jak opisano w niniejszym protokole, bezpośredni bioprekursor kinurenina jest wstrzykiwany dootrzewnowo (i.p.) szczurom. W połączeniu z ocenami biochemicznymi w celu określenia stopnia produkcji KYNA, bada się również wpływ prowokacji kinureniną na pamięć zależną od hipokampa (paradygmat pasywnego unikania) oraz architekturę snu i czuwania (sygnały EEG i EMG)11. Połączenie tych technik pozwala na badanie biochemicznego i funkcjonalnego wpływu prowokacji kinureniną in vivo u szczurów.

<table><tbody><tr><td>Szczury Wistar</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>dorosły samiec, 250-350 g</td></tr><tr><td>siarczanu L-kinureniny</td><td>Kolumna Sai Advantium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 (4 mm x 150 mm)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Clips</td><td>Stoelting Co.</td><td>59022</td><td></td></tr><tr><td>Materiały montażowe</td><td>PlasticsOne</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>Szwy niewchłanialne</td><td>MedRep Express</td><td>699B</td><td>CP Medical Monomid Czarne Nylonowe Szewy, 4-0, P-3, 18", PUDEŁKO 12</td></tr><tr><td>Szwów Wchłanialnych</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1</td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting Co.</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Stoelting Co.</td><td>514551</td><td>0,45 mm</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Alliance System HPLC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E2695 moduł separacyjny</td><td>Waters</td><td>176269503</td><td></td></tr><tr><td>2475 detektor fluorescencji</td><td>Wody</td><td></td><td></td>186247500</tr><tr><td>menedżer odczynników po kolumnie</td><td>Waters</td><td>725000556</td><td></td></tr><tr><td>komputer Lenovo</td><td>Waters</td><td>668000249</td> Empower software Waters 176706100<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Pasywna skrzynka unikająca dla szczurów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra wysoka kabina dźwiękochłonna MDF</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-018MD</td><td>Wnętrze: 22 "(szer.) x 22" (wys.) x 16" (gł.)</td></tr> <tr><td>modulator kanału środkowego komora</td> wahadłowa <td>MedAssociates</td><td>ENV-010MC</td><td></td></tr><tr><td>Podłoga kratkowa ze stali nierdzewnej dla szczurów</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-GF</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczne drzwi gilotynowe</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010B-S</td><td></td></tr><tr><td>Szybkozłączka przenośna z siatką podłogową dla szczurów</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-QD</td><td></td></tr><tr><td>Światło stymulacyjne, soczewka 1" biała, montowana na panelu modułowym</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-221M</td><td></td></tr><tr><td>Moduł Sonalert z regulacją głośności do komory dla szczurów</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-223AM</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet SmartCtrl 8 wejść/16 wyjść</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-716P2</td><td></td></tr><tr><td>8-kanałowe sterowanie IR dla skrzynek wahadłowych</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-253C</td><td></td></tr><tr><td>Źródło podczerwieni i paski detektora</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-256</td><td></td></tr><tr><td>Stołowa szafa interfejsowa, 120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080C</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzakresowy moduł awersyjnej stymulacji prądem stałym</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-410B</td><td></td></tr><tr><td>Półprzewodnikowy moduł mieszacza podłogowego</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-412</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny moduł kontroli wstrząsów A/B</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-415</td><td></td></tr><tr><td>2' 3-pinowy przedłużacz mini-molex</td><td>MedAssociates</td><td>SG-216A-2</td><td></td></tr><tr><td>10' wyjściowy przeciwwstrząsowy, DB-9 M/F</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219G-10</td><td></td></tr><tr><td>przeciwwstrząsowy wahadłowca 15', 6</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219SA</td><td></td></tr><tr><td>Mała szafka stołowa i zasilacz, 120 V 60 Hz</td><td>Pakiet interfejsu PCI MedAssociates</td><td>SG-6080D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MedAssociates</td><td>DIG-700P2-R2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi do unikania shuttle box</td><td>MedAssociates</td><td>SOF-700RA-7</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt do monitorowania snu i czuwania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponehmah software</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNP-P3P-610</td><td></td></tr><tr><td>MX2 8 Interfejs akwizycji źródła</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNM-P3P-MX204</td><td></td></tr><tr><td>Komputer Dell, Optiplex 7020, Windows 7, wersja 64-bitowa</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0112-013</td><td></td></tr><tr><td>19-calowy monitor komputerowy Dell</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0113-001</td><td></td></tr><tr><td>Odbiorniki do klatek plastikowych, 8x</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>Router VPN Cisco RV130</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>RV130</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 2.0</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0119-001</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik sieciowy</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>SG200-08P</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Neuroscore</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0171-CFG</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik dwukanałowy z potencjałem biologicznym, model TL11M2-F40-EET</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>270-0134-001</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar kinuryniny i kwasu kynureninowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej: powiązanie biochemii z funkcjami poznawczymi i snem u szczurów

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

Szlak kynureniny (KP) degradacji tryptofanu jest związany z zaburzeniami psychicznymi. W szczególności metabolit kwasu kynureninowego (KYNA) pochodzący z astrocytów, antagonista zarówno receptorów N-metylo-d-asparaginianu (NMDA), jak i α7 nikotynowej acetylocholiny (α7nACh), jest zaangażowany w procesy poznawcze w zdrowiu i chorobie. Ponieważ poziomy KYNA są podwyższone w mózgach pacjentów ze schizofrenią, uważa się, że nieprawidłowe działanie receptorów glutaminergicznych i cholinergicznych jest przyczynowo związane z dysfunkcją poznawczą, która jest podstawową domeną psychopatologii choroby. KYNA może odgrywać patofizjologicznie istotną rolę u osób ze schizofrenią. Możliwe jest podniesienie endogennego KYNA w mózgu gryzoni poprzez leczenie zwierząt bezpośrednim bioprekursorem kinureniną, a badania przedkliniczne na szczurach wykazały, że ostre zwiększenie KYNA może wpływać na ich procesy uczenia się i pamięci. Obecny protokół szczegółowo opisuje to eksperymentalne podejście i łączy a) analizę biochemiczną poziomów kynureniny we krwi i tworzenia KYNA w mózgu (przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej), b) testy behawioralne w celu zbadania pamięci kontekstowej zależnej od hipokampa (paradygmat pasywnego unikania) oraz c) ocenę zachowania snu i czuwania [zapisy telemetryczne łączące sygnały elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG)] u szczurów. Podsumowując, badany jest związek między podwyższonym KYNA, snem i funkcjami poznawczymi, a niniejszy protokół szczegółowo opisuje eksperymentalne podejście do zrozumienia wyników funkcji podniesienia poziomu kinureniny i tworzenia KYNA in vivo u szczurów. Wyniki uzyskane dzięki wariacjom tego protokołu przetestują hipotezę, że KP i KYNA odgrywają kluczową rolę w modulowaniu snu i funkcji poznawczych w stanach zdrowotnych i chorobowych.

Aby zwalidować zastosowanie dostrzyczynowej iniekcji kynureniny jako metody podniesienia poziomu KYNA w mózgu, przeprowadzono analizę tkanek metodą HPLC. Krzywe wzorcowe (Rysunek 1) zostały sporządzone przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, co umożliwiło ilościowe oznaczenie próbek tkanek. Reprezentatywne chromatogramy dla kynureniny i KYNA przedstawiono na Rysunku 2. Kynureninę zaobserwowano przy czasie retencji 6 min, natomi...

Zmiany w neuroaktywnych metabolitach szlaku kinureniny (KP) są związane z chorobami psychicznymi. Badanie funkcjonalnych wyników zmienionego szlaku kynureniny metabolizmu in vivo u gryzoni może pomóc w wyjaśnieniu nowych podejść terapeutycznych. Obecny protokół łączy podejścia biochemiczne i behawioralne w celu zbadania wpływu ostrej prowokacji kinureniną u szczurów.

Pomiar kinuryniny i kwasu kynureninowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej: powiązanie biochemii z funkcjami poznawczymi i snem u szczurów

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite ...

Metoda ta łączy podejścia biochemiczne i behawioralne, aby pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki dotyczące wpływu ostrej prowokacji kinureniną u szczurów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia wiarygodną i spójną metodę pomiaru metabolitów szlaku kinureninowego w mózgu i osoczu szczura. Procedurę zademonstruje Carly Fabian, asystentka naukowa z mojego laboratorium.W odpowiednim doświadczalnym punkcie końcowym po dootrzewnowym podaniu kinureniny rozmrozić zamrożone osocze zebrane na mokrym lodzie i rozcieńczyć rozmrożone próbki ultraczystą wodą. Przenieść 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki do indywidualnych pojemników po 25 mikrolitrów 6% kwasu nadchlorowego i odwirować próbki. Następnie przenieś 100 mikrolitrów supernatantów z każdej probówki do indywidualnych probówek wirówkowych o pojemności 250 mikrolitrów w celu oznaczenia kinureniny i kwasu kynureninowego.W przypadku pomiaru kwasu kynureninowego z próbek mózgu, należy rozmrozić zamrożone pobrane próbki mózgu na suchym lodzie i indywidualnie zważyć każdą próbkę na precyzyjnej wadze analitycznej. Po zważeniu wszystkich próbek, przenieść probówki na mokry lód i rozcieńczyć każdą próbkę tkanki w stosunku wagowym od 1 do 10 ultraczystą wodą, a następnie homogenizować za pomocą sonikatora. Porcję 100 mikrolitrów zawiesiny każdej próbki przelać do nowej probówki, a następnie dodać 25 mikrolitrów 25% kwasu nadchlorowego w celu wirowania i odwirowania.Następnie przenieś 100 mikrolitrów supernatantu do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 250 mikrolitrów w celu oznaczenia kwasu kynureninowego. Aby przygotować maszynę do wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub HPLC do analizy kinureniny, najpierw umieść poszczególne probówki wlotowe HPLC w fazie ruchomej, wodzie ultraczystej i pojemnikach 100% acetonitrylu. Następnie zaprogramuj urządzenie tak, aby uruchamiało 5% acetonitrylu i 95% ultraczystej wody z prędkością 0,5 mililitra na minutę i pozwól maszynie HPLC pracować przez 20 do 30 minut.Po osiągnięciu stabilnego ciśnienia i linii podstawowej, zmień skład roztworu na 5% acetonitrylową i 95% fazę ruchomą octanu sodu i równoważ przyrząd przez kolejne 30 minut. Gdy przyrząd jest w równowadze, włącz lampę w detektorze fluorescencji. Przed derywatyzacją należy oddzielnie przepompować roztwór octanu przez pompę perystaltyczną, która łączy się z ruchomą kolumną fazową i włączyć pompę zasłupową do natężenia przepływu 0,1 mililitra na minutę przez około 20 minut, aż osiągnie stabilne ciśnienie około 500 psi.Gdy urządzenie jest gotowe do analizy, ustaw oprogramowanie systemowe tak, aby kontrolowało parametry sekwencji próbki i umożliwiało automatyczne wstrzykiwanie wielu próbek. Na ekranie Uruchom próbkę kliknij Plik" i przeciągnij w dół, aby utworzyć nowy zestaw próbny, wybierając Pusty w nowym oknie. Należy indywidualnie wymienić wszystkie wzorce i próbki w kolejności, w jakiej powinny być badane, z zaznaczonymi wzorcami na początku i na końcu sekwencji.W kolumnie funkcji oznacz wzorce i próbki, a następnie ustaw program tak, aby wstrzykiwał wodę między każdymi pięcioma próbkami. Ustaw czas pracy dla każdej próbki na 15 minut i wstrzyknij 20 mikrolitrów próbek z wzorców, a następnie 20 mikrolitrów próbek osocza i 30 mikrolitrów próbek homogenatu mózgu, zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami. Następnie ustaw długości fal wzbudzenia i emisji zgodnie z mierzonym związkiem i uruchom sekwencję.Aby określić ilościowo dane, otwórz ekran Przeglądaj projekt i w zakładce Zestawy próbek kliknij dwukrotnie zestaw próbek, który ma zostać określony ilościowo. Z listy wstrzyknięć zaznacz wszystkie standardy i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Proces'w nowym oknie. Następnie użyj menu rozwijanego, aby wybrać Kalibruj i oceniaj ilościowo'Ponownie zaznacz wszystkie wzorce, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przejrzyj'Gdy chromatogramy się otworzą, zintegruj i skalibruj każdy wzorzec, aby wygenerować krzywą wzorcową.Następnie wróć do zakładki Zestawy próbek i kliknij dwukrotnie zestaw próbek, aby określić ilościowo i przejrzeć, jak pokazano, integrując i kwantyfikując każdą próbkę, aby uzyskać stężenie każdej próbki na podstawie wcześniej utworzonej krzywej wzorcowej. Analiza HPLC próbek tkanek pobranych od zwierząt, którym podawano kinureninę, wykazała, że czas retencji kinureniny wynosi około sześciu minut, a czas retencji kwasu kynureninowego wynosi około 11 minut. Kwantyfikacja kinureniny w osoczu i kwasu kynureninowego w hipokampie ujawnia, że ostre wstrzyknięcie kinureniny zwiększa poziom kwasu kynureninowego w mózgu, osiągając szczyt po dwóch godzinach od wstrzyknięcia, który powraca do wartości wyjściowej po czterech godzinach po wstrzyknięciu.Chociaż podczas prób treningu paradygmatu pasywnego unikania nie obserwuje się żadnych różnic grupowych, zwierzęta kontrolne wykazują znaczny wzrost opóźnienia, aby przejść na ciemną stronę podczas prób testowych, co wskazuje na uczenie się kontekstowe, podczas gdy zwierzęta, którym wstrzyknięto kinureninę 24 godziny wcześniej, nie wykazują takiego samego wzrostu opóźnienia, wykazując deficyt w uczeniu się. Ponadto ocena wpływu ostrego podwyższenia stężenia kinureniny w fazie światła na architekturę snu i czuwania wskazuje na skrócenie całkowitego czasu trwania snu z szybkimi ruchami gałek ocznych w ciągu pierwszych dwóch godzin po wstrzyknięciu kinureniny. Dane te znajdują odzwierciedlenie w wydłużeniu czasu czuwania w tych okresach i nieznacznym zmniejszeniu snu bez szybkich ruchów gałek ocznych, co pokazuje, że ostre podwyższenie stężenia kinureniny powoduje również zaburzenia dynamiki snu i czuwania.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza behawioralna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli podwyższonego poziomu tworzenia kwasu kynureninowego w modulowaniu funkcji poznawczych i snu.

a-high-performance-liquid-chromatography-measurement-kynurenine

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ten film demonstruje protokół wszczepienia elektrody elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) znieczulonej myszy. Proces polega na zabezpieczeniu myszy na stereotaktycznej ramie, wykonaniu nacięcia w linii środkowej czaszki, wywierceniu otworów na elektrody i zamocowaniu zespołu elektrod do nagrywania sygnału. Po powrocie do zdrowia zachowanie myszy podczas snu i czuwania jest analizowane przy użyciu zarejestrowanych sygnałów.

Analiza zachowań związanych ze snem u myszy za pomocą elektroencefalogramu i zapisów elektromiogramu

Zapis elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) u swobodnie zachowujących się myszy jest kluczowym krokiem do skorelowania zachowania i fizjologii ze snem i czuwaniem. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny zapewnia przewodowy system do pozyskiwania zapisów EEG i EMG u myszy.

Procedura rejestracji poligraficznej do pomiaru snu u myszy

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Opisujemy wysokoprzepustową metodę pomiaru snu za pomocą monitorowania w domowej klatce opartej na aktywności. Ta metoda ma przewagę nad tradycyjnymi metodami opartymi na EEG. Jest dobrze zwalidowany do określania całkowitego czasu trwania snu i może być potężnym narzędziem do monitorowania snu w modelach chorób ludzkich u gryzoni.

Nieinwazyjne, wysokoprzepustowe określanie czasu trwania snu u gryzoni

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Utrata snu i niewspółosiowość rytmu dobowego przyczyniają się do licznych wypadków i incydentów operacyjnych. Skuteczność środków zaradczych i projektów harmonogramu pracy mających na celu złagodzenie zmęczenia może być trudna do oceny w środowiskach operacyjnych. Ten manuskrypt podsumowuje podejście do zbierania danych dotyczących snu, okołodoby, zmęczenia i wydajności w złożonych środowiskach operacyjnych.

Gromadzenie danych dotyczących snu, okołodoby, zmęczenia i wydajności w złożonych środowiskach operacyjnych

Tutaj prezentujemy metodę badania rytmów dobowych w wydajności po dokładnej kategoryzacji uczestników do grup fenotypów okołodobowych na podstawie Monachijskiego Kwestionariusza Chronotypu, złotego standardu biomarkerów fazy okołodobowej i miar aktygraficznych.

Fenotypowanie okołodobowe człowieka i dobowe testy wydajności w świecie rzeczywistym

Opisany tutaj jest protokół oznaczania czterech różnych metabolitów tryptofanu generowanych w szlaku kinureniny (kynurenina, 3-hydroksykinurenina, kwas ksanturonowy, kwas 3-hydroksyantranilowy) w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych analizowanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas.

Jednoczesna kwantyfikacja wybranych kinurenin analizowanych metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych

Poznaj metodę HPLC do pomiaru kinuryniny i kwasu kynureninowego w mózgu i osoczu szczurów. Technika ta umożliwia niezawodne oznaczanie metabolitów szlaku kynureninowego związanych z chorobami psychicznymi.

Pomiar kinuryniny i kwasu kynureninowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej: powiązanie biochemii z funkcjami poznawczymi i snem u szczurów (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar kinuryniny i kwasu kynureninowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej: powiązanie biochemii z funkcjami poznawczymi i snem u szczurów

Przeglądaj więcej filmów