Pomiar kinuryniny i kwasu kynureninowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej: powiązanie biochemii z funkcjami poznawczymi i snem u szczurów

Metoda ta łączy podejścia biochemiczne i behawioralne, aby pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki dotyczące wpływu ostrej prowokacji kinureniną u szczurów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia wiarygodną i spójną metodę pomiaru metabolitów szlaku kinureninowego w mózgu i osoczu szczura. Procedurę zademonstruje Carly Fabian, asystentka naukowa z mojego laboratorium.

W odpowiednim doświadczalnym punkcie końcowym po dootrzewnowym podaniu kinureniny rozmrozić zamrożone osocze zebrane na mokrym lodzie i rozcieńczyć rozmrożone próbki ultraczystą wodą. Przenieść 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki do indywidualnych pojemników po 25 mikrolitrów 6% kwasu nadchlorowego i odwirować próbki. Następnie przenieś 100 mikrolitrów supernatantów z każdej probówki do indywidualnych probówek wirówkowych o pojemności 250 mikrolitrów w celu oznaczenia kinureniny i kwasu kynureninowego.

W przypadku pomiaru kwasu kynureninowego z próbek mózgu, należy rozmrozić zamrożone pobrane próbki mózgu na suchym lodzie i indywidualnie zważyć każdą próbkę na precyzyjnej wadze analitycznej. Po zważeniu wszystkich próbek, przenieść probówki na mokry lód i rozcieńczyć każdą próbkę tkanki w stosunku wagowym od 1 do 10 ultraczystą wodą, a następnie homogenizować za pomocą sonikatora. Porcję 100 mikrolitrów zawiesiny każdej próbki przelać do nowej probówki, a następnie dodać 25 mikrolitrów 25% kwasu nadchlorowego w celu wirowania i odwirowania.

Następnie przenieś 100 mikrolitrów supernatantu do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 250 mikrolitrów w celu oznaczenia kwasu kynureninowego. Aby przygotować maszynę do wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub HPLC do analizy kinureniny, najpierw umieść poszczególne probówki wlotowe HPLC w fazie ruchomej, wodzie ultraczystej i pojemnikach 100% acetonitrylu. Następnie zaprogramuj urządzenie tak, aby uruchamiało 5% acetonitrylu i 95% ultraczystej wody z prędkością 0,5 mililitra na minutę i pozwól maszynie HPLC pracować przez 20 do 30 minut.

Po osiągnięciu stabilnego ciśnienia i linii podstawowej, zmień skład roztworu na 5% acetonitrylową i 95% fazę ruchomą octanu sodu i równoważ przyrząd przez kolejne 30 minut. Gdy przyrząd jest w równowadze, włącz lampę w detektorze fluorescencji. Przed derywatyzacją należy oddzielnie przepompować roztwór octanu przez pompę perystaltyczną, która łączy się z ruchomą kolumną fazową i włączyć pompę zasłupową do natężenia przepływu 0,1 mililitra na minutę przez około 20 minut, aż osiągnie stabilne ciśnienie około 500 psi.

Gdy urządzenie jest gotowe do analizy, ustaw oprogramowanie systemowe tak, aby kontrolowało parametry sekwencji próbki i umożliwiało automatyczne wstrzykiwanie wielu próbek. Na ekranie Uruchom próbkę kliknij Plik" i przeciągnij w dół, aby utworzyć nowy zestaw próbny, wybierając Pusty w nowym oknie. Należy indywidualnie wymienić wszystkie wzorce i próbki w kolejności, w jakiej powinny być badane, z zaznaczonymi wzorcami na początku i na końcu sekwencji.

W kolumnie funkcji oznacz wzorce i próbki, a następnie ustaw program tak, aby wstrzykiwał wodę między każdymi pięcioma próbkami. Ustaw czas pracy dla każdej próbki na 15 minut i wstrzyknij 20 mikrolitrów próbek z wzorców, a następnie 20 mikrolitrów próbek osocza i 30 mikrolitrów próbek homogenatu mózgu, zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami. Następnie ustaw długości fal wzbudzenia i emisji zgodnie z mierzonym związkiem i uruchom sekwencję.

Aby określić ilościowo dane, otwórz ekran Przeglądaj projekt i w zakładce Zestawy próbek kliknij dwukrotnie zestaw próbek, który ma zostać określony ilościowo. Z listy wstrzyknięć zaznacz wszystkie standardy i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Proces'w nowym oknie. Następnie użyj menu rozwijanego, aby wybrać Kalibruj i oceniaj ilościowo'Ponownie zaznacz wszystkie wzorce, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przejrzyj'Gdy chromatogramy się otworzą, zintegruj i skalibruj każdy wzorzec, aby wygenerować krzywą wzorcową.

Następnie wróć do zakładki Zestawy próbek i kliknij dwukrotnie zestaw próbek, aby określić ilościowo i przejrzeć, jak pokazano, integrując i kwantyfikując każdą próbkę, aby uzyskać stężenie każdej próbki na podstawie wcześniej utworzonej krzywej wzorcowej. Analiza HPLC próbek tkanek pobranych od zwierząt, którym podawano kinureninę, wykazała, że czas retencji kinureniny wynosi około sześciu minut, a czas retencji kwasu kynureninowego wynosi około 11 minut. Kwantyfikacja kinureniny w osoczu i kwasu kynureninowego w hipokampie ujawnia, że ostre wstrzyknięcie kinureniny zwiększa poziom kwasu kynureninowego w mózgu, osiągając szczyt po dwóch godzinach od wstrzyknięcia, który powraca do wartości wyjściowej po czterech godzinach po wstrzyknięciu.

Chociaż podczas prób treningu paradygmatu pasywnego unikania nie obserwuje się żadnych różnic grupowych, zwierzęta kontrolne wykazują znaczny wzrost opóźnienia, aby przejść na ciemną stronę podczas prób testowych, co wskazuje na uczenie się kontekstowe, podczas gdy zwierzęta, którym wstrzyknięto kinureninę 24 godziny wcześniej, nie wykazują takiego samego wzrostu opóźnienia, wykazując deficyt w uczeniu się. Ponadto ocena wpływu ostrego podwyższenia stężenia kinureniny w fazie światła na architekturę snu i czuwania wskazuje na skrócenie całkowitego czasu trwania snu z szybkimi ruchami gałek ocznych w ciągu pierwszych dwóch godzin po wstrzyknięciu kinureniny. Dane te znajdują odzwierciedlenie w wydłużeniu czasu czuwania w tych okresach i nieznacznym zmniejszeniu snu bez szybkich ruchów gałek ocznych, co pokazuje, że ostre podwyższenie stężenia kinureniny powoduje również zaburzenia dynamiki snu i czuwania.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza behawioralna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli podwyższonego poziomu tworzenia kwasu kynureninowego w modulowaniu funkcji poznawczych i snu.